雌激素影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMP-2和VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

黃海峰，孫 立，田曉濱，張 進(jìn)

雌激素影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMP-2和VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

黃海峰，孫 立，田曉濱，張 進(jìn)

目的 研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨過程中雌激素對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響，以探討雌激素可能的成骨機(jī)制。方法 對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，增殖到第4代后，實(shí)施成骨誘導(dǎo)1周后停止，通過堿性磷酸酶（ALP）染色方法，對(duì)成骨分化程度進(jìn)行鑒定。使用雌激素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行作用，分別對(duì)細(xì)胞BMP-2、VEGF、ALP的表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 在雌激素的作用下，BMP-2 mRNA、BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白表達(dá)均明顯提高。結(jié)論 雌激素可能通過雌二醇的作用，促進(jìn)BMP-2和VEGF蛋白的表達(dá)，使得骨的形成過程變得更為高效，因此可以判斷這種物質(zhì)具有骨誘導(dǎo)活性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；雌激素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

雌激素替代療法是治療絕經(jīng)后的婦女骨質(zhì)疏松癥最有效的方法之一。除了雌激素能夠抑制骨吸收，雌激素的受體能夠有效促進(jìn)骨基質(zhì)蛋白的形成［1］，并對(duì)骨的形成有正面促進(jìn)作用［2］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）對(duì)于骨形成來說不可或缺，其功能在于誘導(dǎo)成骨的分化［3］。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在骨修復(fù)中對(duì)血管的產(chǎn)生十分重要。研究［4］表明VEGF也會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞所含有的BMP-2作用產(chǎn)生促進(jìn)影響。骨修復(fù)時(shí)上述兩種生長(zhǎng)因子的表達(dá)上調(diào)，或許能夠達(dá)到骨和血供重建的協(xié)同效應(yīng)。而且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中存在雌激素受體（ER）表達(dá)［2］，證明雌激素或許在細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)發(fā)揮了一定的作用。雌激素作用后動(dòng)物骨形成也會(huì)大幅提高［5］。該研究擬探討雌激素促進(jìn)骨形成的生物學(xué)機(jī)制，為造?；颊咦鞒鲐暙I(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，6～8周齡，110～120 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供。實(shí)驗(yàn)在《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》［6］指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 藥物和試劑 細(xì)胞完全培養(yǎng)液：20%胎牛血清、L-DMEM、100 U/ml青鏈霉素。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液［7］：5%胎牛血清、L-DMEM、10 nmol/L地塞米松、100 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml抗壞血酸、100 U/ml青鏈霉素。17β-雌二醇，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒，大鼠ALP、BMP-2、VEGF ELISA試劑盒，PCR試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組

1.3.1 BMSCs的分離培養(yǎng)和傳代 取2只大鼠斷頸處死后無(wú)菌操作分離取出股骨和脛骨，用PBS沖洗出骨髓，1 700 r/min離心5 min后用L-DMEM重懸，再次1 700 r/min離心5 min，去上清液，用細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸，用培養(yǎng)瓶盛裝。然后放置到37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里。2 d后倒除一半的培養(yǎng)液，并倒入等量的新的培養(yǎng)液，以后每3 d換液1次，當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用胰蛋白酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.3.2 BMSCs成骨誘導(dǎo)分化 取一潔凈的6孔培養(yǎng)板，并將完成滅菌的蓋玻片蓋上，接著按照1× 105個(gè)/孔的標(biāo)準(zhǔn)，接種4代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。隨機(jī)編為A組，分為對(duì)照A組和實(shí)驗(yàn)A組并持續(xù)觀測(cè)，一旦細(xì)胞融合程度達(dá)到70%，將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液添加到實(shí)驗(yàn)A組里面，以72 h為周期更換培養(yǎng)液，持續(xù)誘導(dǎo)1周。對(duì)照A組中添加的培養(yǎng)液不含有成骨誘導(dǎo)劑，同樣以72 h為周期更換培養(yǎng)液，持續(xù)誘導(dǎo)1周。

1.3.3 ALP染色 細(xì)胞完成1周的誘導(dǎo)后，把培養(yǎng)液全部吸除，使用PBS溶液進(jìn)行沖洗，3次后停止。按ALP染色試劑盒操作進(jìn)行染色，標(biāo)記，鏡下觀察。

1.3.4 雌激素處理 使用胰蛋白酶對(duì)完成1周誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)A組細(xì)胞進(jìn)行消化。在6孔培養(yǎng)板中注入低糖培養(yǎng)液（成分為不包括血清的L-DMEM），接著按照1×105個(gè)/孔的標(biāo)準(zhǔn)接種細(xì)胞，并隨機(jī)編為B組，分為對(duì)照B組和實(shí)驗(yàn)B組。1 d后使用顯微鏡進(jìn)行觀察，一旦培養(yǎng)板內(nèi)壁上出現(xiàn)了細(xì)胞，將17β-雌二醇添加到實(shí)驗(yàn)B組里面，確保培養(yǎng)液中雌激素濃度保持為10 nmol/L［8］，經(jīng)過1 d后收集上清液和細(xì)胞，將細(xì)胞用超聲波破碎儀破碎，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、ELISA法分別檢測(cè)每孔總的BMP-2和VEGF、ALP的濃度。

1.3.5 BMP-2 RT-PCR電泳 提取細(xì)胞總RNA行逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）。β-actin上游引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；BMP-2上游引物：5′-GTCCTCAGCGAGTTTGAGTTG-3′，下游引物：5′-CAAAGCTCTCCCACTGACTTG-3′。反應(yīng)條件：在94℃條件下展開變性，10 min后取出。接著按照94℃、30 s，55℃、45 s以及72℃、45 s的條件進(jìn)行處理，經(jīng)歷40個(gè)循環(huán)，在72℃環(huán)境下多反應(yīng)10 min。最后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并照相進(jìn)行DNA的相對(duì)定量分析。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)每孔總的BMP-2和VEGF、ALP的濃度 按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示；采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)多組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 完成2 d的分離細(xì)胞培養(yǎng)并更換50%的培養(yǎng)液后，通過顯微鏡觀察可知紅細(xì)胞將培養(yǎng)瓶底完全覆蓋，難以找到BMSCs的存在。第5天全量換液后，可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁上存在極少數(shù)的BMSCs，細(xì)胞形狀主要為梭形，橢圓形或不規(guī)則型也有少量。細(xì)胞在折光性方面表現(xiàn)良好。經(jīng)過第2次換液后，細(xì)胞分化速度呈對(duì)數(shù)規(guī)律，第3次換液后速度明顯降低。第8天更換全部培養(yǎng)液后，使用顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大量分化，且其排列如同漩渦。第11天更換全部培養(yǎng)液后，細(xì)胞融合程度為80%～90%，旋渦狀排列形態(tài)更為明顯，分化后快速聚集成片。見圖1。

2.2 完成第4代細(xì)胞成骨誘導(dǎo)1周后進(jìn)行ALP染色結(jié)果 完成成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞染色結(jié)果顯示，細(xì)胞核呈現(xiàn)出紫色，大量的紅棕色物質(zhì)存在細(xì)胞質(zhì)中，充分說明ALP呈陽(yáng)性。對(duì)照組ALP染色未見紅棕色顆粒出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組ALP染色有較多的紅棕色顆粒出現(xiàn)。見圖2。

圖1 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

圖2 ALP染色結(jié)果

2.3 BMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化 完成凝膠電泳后，使用紫外燈進(jìn)行照射，測(cè)量結(jié)果顯示大鼠βactin、BMP-2分別為207、475 bp。見圖3。使用凝膠成像系統(tǒng)針對(duì)大鼠β-actin與BMP-2 DNA目的條帶進(jìn)行積分光密度值的比值分析即相對(duì)定量分析。相對(duì)定量分析的值為目的基因和內(nèi)參基因兩者表達(dá)的比值。5個(gè)樣本量結(jié)果表明對(duì)照B組積分光密度比值（0.62±0.13）小于實(shí)驗(yàn)B組（0.95±0.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.19，P＜0.05）。

圖3 BMP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

2.4 BMP-2、VEGF蛋白水平及ALP蛋白表達(dá)的變化 應(yīng)用ELISA法測(cè)定BMP-2、VEGF蛋白、ALP蛋白表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)中BMSCs傳代至4代后，對(duì)細(xì)胞均行隨機(jī)分組行進(jìn)一步檢測(cè)。經(jīng)雌激素處理后的細(xì)胞BMP-2、VEGF、ALP的表達(dá)都比對(duì)照組更高（P＜0.05）。說明受到雌激素的刺激作用后，BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白的表達(dá)都出現(xiàn)了顯著的提高。見圖4～6、表1。

圖5 B組VEGF蛋白表達(dá)情況

圖6 B組ALP蛋白表達(dá)情況

表1 BMP-2、VEGF、ALP檢測(cè)情況（n=5±s）

表1 BMP-2、VEGF、ALP檢測(cè)情況（n=5±s）

與對(duì)照B組比較：*P＜0.05

蛋白對(duì)照B組實(shí)驗(yàn)B組t值BMP-2（ng）12.21±3.3918.13±1.34*-3.97 VEGF（pg）231.20±9.76311.85±5.04*-16.42 ALP（IU）109.47±3.23143.42±3.55*-15.81

3 討論

本研究采用的大鼠，體重不超過110～120 g，鼠齡不超過6～8周齡［9］。大鼠重量的把握十分關(guān)鍵。如果重量不夠的話，BMSCs數(shù)量比較少，反之如果重量太大，干細(xì)胞的活性降低，存活率低且實(shí)現(xiàn)效果不夠明顯［10］。培養(yǎng)及傳代至4代后，BMSCs的純度有了顯著的提升。由于這種細(xì)胞的鑒定難度復(fù)雜性較高［11］。本實(shí)驗(yàn)主要從形態(tài)學(xué)上判斷，實(shí)驗(yàn)主要采取外形鑒定的方法進(jìn)行判斷，細(xì)胞形狀呈扁平狀或長(zhǎng)梭形，所有細(xì)胞構(gòu)成旋渦狀［9］。取第4代生長(zhǎng)良好的BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)1周。ALP染色結(jié)果證明，BMSCs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)ALP表達(dá)，進(jìn)一步表明BMSCs向成骨方向分化。使用雌激素施加一定的刺激作用，在刺激之前，考慮到血清所包含的的物質(zhì)過于復(fù)雜，首先將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低糖培養(yǎng)基中進(jìn)行處理，24 h后停止，在最大程度上消除血清的影響，接著施加雌激素刺激，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24 h的作用［8］。運(yùn)用RT-PCR半定量法和ELISA法檢測(cè)BMP-2 mRNA、BMP-2、VEGF蛋白和ALP蛋白的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果表明，這些物質(zhì)的表達(dá)均有所提高。本研究充分說明雌激素能夠通過某種未知的作用促進(jìn)成骨基因BMP-2以及ALP蛋白的表達(dá)，而且對(duì)于VEGF的表達(dá)具有正向刺激作用，從而加速局部血管的生成。本實(shí)驗(yàn)中通過檢測(cè)顯示雌激素作用于細(xì)胞后ALP的表達(dá)明顯上調(diào)，而ALP為成骨細(xì)胞表達(dá)的重要物質(zhì)之一，進(jìn)一步從側(cè)面反應(yīng)了雌激素對(duì)細(xì)胞成骨作用存在促進(jìn)作用。

對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)婦女患者而言，雌激素是一種效果比較理想的治療方法，其能夠抑制患者骨量的降低，避免骨頭過脆后經(jīng)常發(fā)生骨折的情況［2］。研究［2］結(jié)果表明，BMSCs中存在ER的表達(dá)。本研究結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可以得出，雌激素能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞中BMP-2和VEGF蛋白量的提高，或許是因?yàn)槠淠軌蚝虰MSCs中的ER結(jié)合在一起而造成的。很多研究［12］早已證明，BMP-2能夠使得成骨細(xì)胞所包含的VEGF的表達(dá)變得更加活躍。研究［4］顯示，VEGF能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞里BMP-2的表達(dá)。以上結(jié)論似乎顯示了這兩種物質(zhì)的作用能夠彼此促進(jìn)。那么在修復(fù)骨損傷時(shí)，兩者或許也能夠促進(jìn)彼此作用的發(fā)揮。綜上所述，本研究為更加深入地揭示雌激素成骨機(jī)制提供新的途徑。

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Experimental study of BMP-2 and VEGF's expression in estrogen on bone marrow mesenchymal stem cells

Huang Haifeng，Sun Li，Tian Xiaobin，et al
（Dept of Orthopedics，Guizhou Province People's Hospital，Guiyang 550002）

Objective To study the possible osteogenesis mechanism of estrogen by its effection of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）and vascular endothelial growth factor（VEGF）expression on rat bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）during osteogenic differentiation.Methods The rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated，cultured and proliferated to the fourth generation.After one week osteoblastic induction，the level of osteogenic differentiation was identified by alkaline phosphatase（ALP）staining method.The expressions of BMP-2，VEGF and ALP were measured by the action of estrogen on cells.Results Estrogen could promote the expression of BMP-2 mRNA，BMP-2，VEGF and ALP.Conclusion Estrogen may promote the expression of BMP-2 and VEGF protein through the action of estradiol so as to make the bone formation process more efficient.So this substance can be considered osteoinductively active.

bone marrow mesenchymal stem cells；estrogen；bone morphogenetic protein-2；vascular endothelial growth factor

R 687

A

1000-1492（2016）08-1088-04

時(shí)間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.006.html

2016-04-14 接收

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金（編號(hào)：81560356）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)資金（編號(hào)：黔科合人字［2011］30號(hào)）；貴州省科技計(jì)劃（編號(hào)：黔科合SY字［2015］3044）；貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金（編號(hào)：gzwkj2013-1-150）；貴州省人民醫(yī)院青年基金（編號(hào)：GZSYQN［2015］05號(hào)）；貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（編號(hào)：gzwjkj2015-1-018）

貴州省人民醫(yī)院骨科，貴陽(yáng) 550002

黃海峰，男，碩士，住院醫(yī)師；

田曉濱，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：txb6@vip.163.com