環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞分泌iNOS的影響

葉家寶，李 俊，徐曉軍，黃 成，孟曉明

◇藥學(xué)研究◇

環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞分泌iNOS的影響

葉家寶，李 俊，徐曉軍，黃 成，孟曉明

目的 研究環(huán)耙明在巨噬細(xì)胞極化過程中的作用。方法 用100 ng/ml脂多糖（LPS）和20 ng/ml干擾素γ（IFN-γ）處理RAW264.7 24 h刺激成M1型巨噬細(xì)胞，用20 ng/ml白介素-4（IL-4）處理RAW264.7 24 h刺激成M2型巨噬細(xì)胞，用熒光定量PCR（QPCR）法檢測各分型中一氧化氮合成酶（iNOS）、CD86、精氨酸酶-1（Arg-1）、CD206、GLi1、ptch1 mRNA水平的表達(dá)；用QPCR法、Western blot法、免疫熒光法檢測加入環(huán)耙明后對M1型巨噬細(xì)胞分泌iNOS的影響。結(jié)果 M1型巨噬細(xì)胞高分泌iNOS、CD86、M2型巨噬細(xì)胞高分泌Arg-1、CD206（P＜0.01）；40 nmol/L環(huán)耙明刺激后，M1型巨噬細(xì)胞中ptch1 mRNA水平的表達(dá)明顯增強(qiáng)且在100 nmol/L時(shí)達(dá)到最大值（P＜0.01）；經(jīng)環(huán)耙明1 000 nmol/L刺激后有效降低了iNOS的mRNA和蛋白水平，可能提示環(huán)耙明會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化。結(jié)論環(huán)耙明能夠明顯地降低M1型巨噬細(xì)胞中iNOS的分泌。

環(huán)耙明；巨噬細(xì)胞；RAW264.7；一氧化氮合成酶

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，通過免疫監(jiān)視、免疫清除，清除病原體，維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［1］。在這個(gè)過程中，巨噬細(xì)胞可在不同的生理病理狀況下表現(xiàn)出不同的表型以調(diào)控炎癥反應(yīng)，即定義為不同的極化狀態(tài)。研究［2］顯示，巨噬細(xì)胞極化與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌和寄生蟲感染等。進(jìn)一步的研究［3］表明，巨噬細(xì)胞極化過程受到多種信號分子的調(diào)控。其中NF-κB是巨噬細(xì)胞向M1極化過程中的關(guān)鍵分子。尋找內(nèi)源性NF-κB的調(diào)控信號分子，影響巨噬細(xì)胞極化，在疾病的防治過程中有重要的作用。研究［4］表明多種通路可調(diào)控NF-κB，Hedgehog信號通路可通過調(diào)控NF-κB在胰腺癌等疾病中發(fā)揮重要作用。并且其與調(diào)節(jié)NF-κB的多種通路有交叉作用。而環(huán)耙明是一種小分子化合物，并且是Hedgehog信號通路特異性拮抗劑，作用于該通路中的Smo受體。該研究旨在探討Hedgehog通路對巨噬細(xì)胞極化的影響，對免疫治療的分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 RAW264.7細(xì)胞由美國ATCC細(xì)胞庫提供。細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基（DMEM高糖+5%胎牛血清+100 kU/L青霉素+100 mg/L鏈霉素），在含5%CO2、37℃、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑 環(huán)耙明（美國Selleckchem公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司）；PBS、RIPA強(qiáng)裂解液、PMSF（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；4×Tris×HCl/SDS，pH 8.8、4×Tris×HCl/ SDS，pH 6.8、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（37.5∶1）溶液（40%）（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；二甲基亞砜（美國Sigma公司）；胎牛血清、0.25%胰酶（美國Gbico公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）；TRIzol、QPCR引物合成、BCA法蛋白濃度定量試劑盒（美國Invitrogen公司）；iNOS抗體（美國Cell Signal公司）；GLi1抗體（美國Abcam公司）；β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔和抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 生物安全柜、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ND2000）（美國Thermo公司）；冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）；QPCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 QPCR法檢測 按TRIzol試劑說明書提取經(jīng)處理后的RAW264.7總RNA，再立即用ND2000測定總RNA濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為檢測的內(nèi)參物，QPCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μl，包括cDNA 2 μl、上下游引物各0.4 μl、sybrgreen 10 μl、Rox 0.4 μl、無酶水6.8 μl。上機(jī)檢測。以內(nèi)參的循環(huán)數(shù)作為對照，計(jì)算2-ΔΔCt，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 Western blot法檢測 RAW264.7細(xì)胞用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液加PMSF在冰上裂解60 min，每10 min振蕩1次，收集細(xì)胞裂解物，于4℃、13 000 r/min離心30 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg，進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，再轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜上，非特異性封閉1 h，加入一抗，4℃過夜。次日用含辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，后用TBST洗膜4次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影，以βactin作為內(nèi)參，分別以目的蛋白與β-actin灰度比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 免疫熒光法檢測 在傳代細(xì)胞之時(shí)，將經(jīng)過處理的蓋玻片放入培養(yǎng)皿中，讓細(xì)胞爬片。用4%多聚甲醛處理細(xì)胞室溫固定30 min。PBS洗3次。0.2%Triton-X 100室溫通透30 min，PBS洗3次。3%BSA室溫封閉2 h。滴20 μl一抗在封口膜上，放在有水的飯盒中4℃過夜。撬片，放到皿里，PBS洗3次。滴20 μl二抗在封口膜上，放到濕盒里室溫1 h。PBS洗3次。稀釋DAPI，然后加0.5 ml，室溫5 min。PBS洗1次、5 min。在載玻片上滴上封片劑，不要太多且注意不要有氣泡，在毛玻璃側(cè)做好標(biāo)記。正置熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad 6.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，所有檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hedgehog信號通路中抑制蛋白ptch1和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLi1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá) QPCR檢測顯示：與M2型巨噬細(xì)胞相比，M1型巨噬細(xì)胞中GLi1 mRNA水平的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 10.72，P＜0.01），與M1型巨噬細(xì)胞相比，M2型巨噬細(xì)胞中ptch1 mRNA水平的表達(dá)明顯增加（t=475.4，P＜0.01）。見圖1。

2.2 巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206的表達(dá) QPCR檢測顯示，RAW264.7細(xì)胞中，與M2型相比，M1型中iNOS、CD86 mRNA水平的表達(dá)明顯增強(qiáng)（t=23.40，P＜0.01；t=16.68，P＜0.01），與M1型相比，M2型中Arg-1、CD206 mRNA水平的表達(dá)明顯增強(qiáng)（t=8.79，P＜0.01；t=19.79，P＜0.01）。見圖2。

圖1 Hedgehog信號通路中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLi1和抑制蛋白ptch1在各類型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 各類型巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206 mRNA的水平

2.3 環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞的ptch1表達(dá)的影響 QPCR檢測顯示，與對照組比較，經(jīng)環(huán)耙明40、100、1 000、2 000 nmol/L刺激后，M1型巨噬細(xì)胞中ptch1 mRNA水平的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且在100 nmol/L時(shí)達(dá)到最大值（t=16.68，P＜0.01）。見圖3。

2.4 環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

用QPCR法檢測加入環(huán)耙明后M1型巨噬細(xì)胞分泌iNOS mRNA水平明顯下調(diào)（t=194.9，P＜0.01）。見圖4。Western blot法、免疫熒光法檢測的蛋白水平也明顯下調(diào)（t=264.7，P＜0.01）。見圖5、6。

圖3 環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞的ptch1在mRNA水平的影響

圖4 QPCR法檢測環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

圖5 Western blot法檢測環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響

圖6 免疫熒光法檢測環(huán)耙明對M1型巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響 ×100

3 討論

巨噬細(xì)胞是從單核細(xì)胞分化而來，是一類重要的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞。在固有免疫應(yīng)激過程中，組織外的巨噬細(xì)胞對于外來抗原起到防御作用，并且能夠通過吞噬或者降解從而維持抗原在一定的耐受范圍內(nèi)，其還可以與其他的免疫細(xì)胞發(fā)生相互作用，比如T細(xì)胞和B細(xì)胞，相互作用的過程中會(huì)釋放大量的細(xì)胞因子和酶類等。巨噬細(xì)胞還可參與機(jī)體內(nèi)許多抗炎或抑炎反應(yīng)，對于組織細(xì)胞的損傷和修復(fù)都起到一定的作用。研究［5］表明，巨噬細(xì)胞按照TH細(xì)胞的分類原理一樣，根據(jù)其表型和分泌的細(xì)胞因子定義為兩種極化類型，即經(jīng)典活化的M1型和選擇性活化的M2型。M1型高表達(dá)ROS、IL-1、IL-12、IL-23等其他趨化因子，發(fā)揮宿主免疫功能，但也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體正常組織的炎癥損傷。M2型高表達(dá)CD209、CD206、IL-10、CD301等其他趨化因子，發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)功能，但在炎癥后期可發(fā)揮抗炎作用、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。此外，持久性M1型巨噬細(xì)胞及其活性的產(chǎn)品可以誘導(dǎo)組織損傷，M2型巨噬細(xì)胞抑制炎癥、清除殘骸，血管生成和組織愈合。巨噬細(xì)胞極化在許多人類炎性疾病治療中，包括動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖和胰島素抵抗、癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌和寄生蟲感染發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。其中，信號通路在影響巨噬細(xì)胞極化的過程中起到巨大作用。如TLR、MyD88、MAPK、NF-κB［6］、mTOR、STAT6［7］。因?yàn)樵S多信號通路與Hedgehog信號通路存在交叉作用。所以，也許Hedgehog信號通路參與了巨噬細(xì)胞的極化過程。

Hedgehog信號通路開始發(fā)現(xiàn)其功能，是在胚胎發(fā)育、組織分化過程中起到重要的調(diào)控作用。然而近年來，研究［8］顯示Hedgehog信號通路在腫瘤發(fā)生的過程中也發(fā)揮著重要作用。Hedgehog信號通路主要由正調(diào)控的Shh配體和跨膜蛋白Smo、負(fù)調(diào)控跨膜蛋白受體Ptch以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）組成。Smo蛋白是Hedgehog信號通路中重要的傳遞信使，能夠?qū)⒓?xì)胞外的Shh信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli1信號，從而啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄，對Hedgehog信號通路具有激活作用。其中Ptch蛋白的異常激活也能阻止該過程的發(fā)生。為了探究當(dāng)該通路沒有激活時(shí)，其對病理生理的影響，運(yùn)用其抑制劑是個(gè)很好的研究方法，其中環(huán)耙明是Hedgehog信號通路特異性抑制劑［9］，作用于該通路中Smo受體。

目前，許多對于Hedgehog信號通路的研究［9］集中于其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用。對于其在免疫方面的作用尚未有所研究。本研究從其與NF-κB等重要的炎癥信號通路有交叉作用，探討其對巨噬細(xì)胞極化的影響。本研究顯示，Hedgehog信號通路在M1型巨噬細(xì)胞中是激活的，抑制基因ptch1低表達(dá)，其抑制劑環(huán)耙明可降低M1型巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)，可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，本研究的意義在于，Hedgehog信號通路的異常激活可促進(jìn)癌癥的發(fā)生，通過使用其抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致其向M2型巨噬細(xì)胞極化，而M2型巨噬細(xì)胞在炎癥后期對癌癥細(xì)胞起到保護(hù)作用，這就提示，小分子化合物對于癌癥［10］治療的副作用可能就是因?yàn)槠浯龠M(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，尚需進(jìn)一步深入研究，本研究是第一次探討該抑制劑對巨噬細(xì)胞極化后分泌物的影響，為后來的研究提供基礎(chǔ)，也為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

［1］ Almatroodi S A，McDonald C F，Darby I A，et al.Characterization of M1/M2 tumor-associated macrophages（TAMs）and Th1/Th2 cytokine profiles in patients with NSCLC［J］.Cancer Microenviron，2016，9（1）：1-11.

［2］ Chen J J，Lin Y C，Yao P L，et al.Tumor-associated macrophages：the double-edged sword in cancer progression［J］.J Clin Oncol，2005，23（5）：953-64.

［3］ Ahmad A.Pathways to breast cancer recurrence［J］.ISRN Oncol，2013，2013：290568.

［4］ Du W，Liu X，Chen L，et al.Targeting the SMO oncogene by miR-326 inhibits glioma biological behaviors and stemness［J］.Neuro Oncol，2015，17（2）：243-53.［5］ 李美玲，李應(yīng)配，冷銀芝，等.雙酚A對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化影響的體外研究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（6）：82-5.

［6］ Zou J，Shankar N.Roles of TLR/MyD88/MAPK/NF-κB signaling pathways in the regulation of phagocytosis and proinflammatory cytokine expression in response to E.faecalis infection［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0136947.

［7］ Tian F，Yu B L，Hu J R，et al.mTOR mediates the cross-talk of macrophage polarization and autophagy in atherosclerosis［J］.Int J Cardiol，2014，177（1）：144-5.

［8］ Genin M，Clement F，F(xiàn)attaccioli A，et al.M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide［J］.BMC Cancer，2015，15：577.

［9］ Xu Y，An Y，Wang X，et al.Inhibition of the Hedgehog pathway induces autophagy in pancreatic ductal adenocarcinoma cells［J］. Oncol Rep，2014，31（2）：707-12.

［10］You J，Zhao J，Wen X，et al.Chemoradiation therapy using cyclopamine-loaded liquid-lipid nanoparticles and lutetium-177-labeled core-crosslinked polymeric micelles［J］.J Control Release，2015，202：40-8.

Effect of cyclopamine on the secretion of iNOS in M1-type

Ye Jiabao，Li Jun，Xu Xiaojun，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To observe the role of cyclopamine in macrophage polarization.Methods M1-type macrophage was treated with LPS（100 ng/ml）and IFN-γ（20 ng/ml）for 24 h，and M2-type macrophage was stimulated with IL-4（20 ng/ml）for 24 h.The expressions of iNOS，CD86，Arg-1，CD206，GLi1，ptch1 were detected by QPCR in various types；the mRNA level of iNOS was determined by QPCR after joining cyclopamine in the M1-type，the protein expression of iNOS was assessed by western blot and immunofluorescence after joining cyclopamine in the M1-type.Results The relative expression of iNOS，CD86 was significantly higher in M1-type than that in M2-type at mRNA level（P＜0.01）.The relative expression of Arg-1，CD206 was significantly higher in M2-type than that in M1-type at mRNA level（P＜0.01）.After 40 nmol/L cyclopamine stimulation，the mRNA level of ptch1 was significantly enhanced in M1 macrophages and reached the maximum at 100 nmol/L treatment of M1-type with cyclopamine at 1 000 nmol/L，which effectively reduced the expression of iNOS at mRNA and protein levels，suggesting that it could promote the macrophages polarization to M2-type.Conclusion Cyclopamine can obviously reduce the secretion of iNOS in M1 macrophages.

cyclopamine；macrophages；RAW264.7；iNOS

R 392.5

A

1000-1492（2016）08-1141-05

時(shí)間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.030.html

2016-05-30 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81273526、81473268）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH145）；安徽省科技專項(xiàng)基金（編號：1301042212）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號：20123420120001）

安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

葉家寶，男，碩士研究生；

李 俊，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj @ahmu.edu.cn