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    柱前衍生HPLC—UV法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量

    2016-10-29 09:11:30楊歡丁月珠段天璇
    中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志 2016年10期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜法

    楊歡 丁月珠 段天璇

    摘要:目的 建立柱前衍生HPLC-UV法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的方法。方法 以2-萘基溴甲基酮為衍生試劑、三乙胺為催化劑、60 ℃水浴條件下對(duì)豬去氧膽酸進(jìn)行衍生,采用HPLC-UV法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量。結(jié)果 當(dāng)衍生試劑與豬去氧膽酸的摩爾比>20∶1,催化劑與豬去氧膽酸的摩爾比>15∶1,在60 ℃水浴條件下反應(yīng)50 min時(shí),衍生反應(yīng)完全。豬去氧膽酸在0.1~2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7),平均回收率為97.85%(RSD=1.6%)。人工牛黃樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。結(jié)論 本方法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性和重復(fù)性好,可用于測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸的含量。

    關(guān)鍵詞:人工牛黃;豬去氧膽酸;柱前衍生;高效液相色譜法;紫外檢測(cè)

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.021

    中圖分類號(hào):R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5304(2016)10-0092-03

    Abstract: Objective To establish a pre-column derivation HPLC-UV method for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Methods The hyodeoxycholic acid was derived by 2-bromo-2-acetonaphthoneat using triethylamine as the catalyst in 60 ℃ water bath. After that, a HPLC-UV method was established to determine the content of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis. Results When the derivatising time at 60 ℃ water bath was 50 min, the radio of the molar amount of derived reagents and hyodeoxycholic was over 20:1 and the radio of catalyst and hyodeoxycholic was over 15:1; the reaction was completed. The calibration curve was linear within the range of 0.1–2 μg for hyodeoxycholic acid (r=0.999 7), and the average recovery was 97.85% (RSD=1.6%). In this sample, the content of hyodeoxycholic is 4.12%. Conclusion The method is with high sensitivity, highly reproducible, reliable and accurate for the content determination of hyodeoxycholic acid in artificial calculus bovis.

    Key words: artificial calculus bovis; hyodeoxycholic acid; pre-column derivation; HPLC; UV

    人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、?;撬?、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成,是天然牛黃的代用品之一[1],其在中藥制劑中的使用可有效緩解天然牛黃資源短缺。豬去氧膽酸為人工牛黃的特征成分之一,測(cè)定其含量可在一定程度上控制人工牛黃的質(zhì)量,同時(shí)豬去氧膽酸也是區(qū)別人工牛黃和天然牛黃的指標(biāo)性成分。由于豬去氧膽酸為末端吸收,無(wú)法采用高效液相紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。目前多采用高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[2-3]和薄層掃描法[4]測(cè)定其含量,但靈敏度較低。雖然采用質(zhì)譜法測(cè)定有非常高的靈敏度,但存在儀器價(jià)格昂貴、重復(fù)性差等缺點(diǎn)。采用柱前衍生HPLC-UV法可以提高靈敏度,同時(shí)普適性強(qiáng)。故本試驗(yàn)采用柱前衍生后高效液相紫外檢測(cè)器檢測(cè),對(duì)人工牛黃中豬去氧膽酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

    1 儀器與試藥

    島津高效液相色譜儀(LC-20AT),DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司),電子天平(CPA225D,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),MTN-2800D型氮?dú)獯蹈蓛x(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)

    豬去氧膽酸對(duì)照品(純度98%,成都曼斯特生物科技有限公司,中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,批號(hào)MUST-15032804),人工牛黃(產(chǎn)地安徽,批號(hào)20110116,購(gòu)自北京同仁堂),三乙胺(純度為99.0%,天津市福晨化學(xué)試劑廠),2-萘基溴甲基酮(純度98%,上海晶純生化科技股份有限公司),水為去離子水,甲醇、乙腈均為色譜純。其他試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1 色譜條件

    色譜柱:Agilent TC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-1%磷酸(83∶17,V∶V);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取豬去氧膽酸對(duì)照品1 mg置1mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋定容至刻度。

    2.2.2 人工牛黃提取液 精密稱取人工牛黃20 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇定容到刻度,稱定質(zhì)量,超聲30 min(功率300 W,工作頻率40 kHz),冷卻至室溫,再次稱定質(zhì)量,補(bǔ)足減失的質(zhì)量,即得。

    2.2.3 衍生試劑溶液 精密稱取2-萘基溴甲基酮63.5 mg于25 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。

    2.2.4 催化劑溶液 取三乙胺35.5 μL于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。

    2.3 衍生化反應(yīng)

    取人工牛黃提取液,定容于1 mL容量瓶中,氮?dú)獯蹈?。加入催化劑溶?.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL,用甲醇定容至刻度,60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫,加甲醇至刻度,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積。

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.75 mL于1 mL容量瓶中后用甲醇定容到刻度,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖與人工牛黃衍生化反應(yīng)后的色譜圖進(jìn)行對(duì)比,見(jiàn)圖1、圖2。衍生試劑及催化劑對(duì)衍生產(chǎn)物無(wú)干擾,專屬性良好。

    2.4.2 線性關(guān)系考察 分別取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.005、0.01、0.02、0.05、0.07、0.1 mL于1 mL容量瓶中。按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng),按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物峰面積。以峰面積對(duì)豬去氧膽酸質(zhì)量作圖,結(jié)果豬去氧膽酸在0.1~2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=1.0×108X-9551 9,r=0.999 7。

    2.4.3 精密度試驗(yàn) 將人工牛黃提取液按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)后,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,RSD=2.7%。

    2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照人工牛黃提取液的提取方法制備6份提取液,按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,記錄峰面積,RSD=2.3%。

    2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將人工牛黃提取液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行HPLC測(cè)定,記錄產(chǎn)物峰面積,RSD=2.4%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取人工牛黃約10 mg,按人工牛黃提取液的方法提取6份提取液,取提取液定容于1mL容量瓶中,氮?dú)獯蹈?。分別加入豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液33、33、41、41、49、49 μL后按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行衍生化反應(yīng),按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積并計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

    2.5 樣品含量測(cè)定

    取人工牛黃樣品,按上述提取方法和衍生條件反應(yīng)后,測(cè)定豬去氧膽酸衍生產(chǎn)物峰面積,根據(jù)回歸方程計(jì)算豬去氧膽酸含量,結(jié)果表明樣品中豬去氧膽酸的含量為4.12%。

    3 討論

    3.1 衍生反應(yīng)條件的確定

    3.1.1 衍生時(shí)間 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中,加催化劑溶液0.1 mL、衍生試劑溶液0.5 mL,用甲醇定容至刻度,平行操作7份,分別于60 ℃水浴中反應(yīng)10、20、30、40、50、60、70 min后冷卻到室溫,加甲醇至刻度,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積,結(jié)果見(jiàn)圖3。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨反應(yīng)時(shí)間而增大,反應(yīng)50 min時(shí)達(dá)到最大。

    3.1.2 催化劑用量 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中,加入衍生試劑溶液0.5 mL后分別加入2~30倍反應(yīng)物摩爾量的催化劑溶液,用甲醇定容至刻度,60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫,加甲醇至刻度,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積,結(jié)果見(jiàn)圖4。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入催化劑溶液的增大而增大,當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的10倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒(méi)有明顯增加。

    3.1.3 衍生試劑用量 取豬去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中,加催化劑溶液0.05 mL后分別加入2~100倍反應(yīng)物摩爾量的衍生試劑溶液,用甲醇定容至刻度,60 ℃水浴反應(yīng)50 min后冷卻到室溫,加甲醇至刻度,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積,結(jié)果見(jiàn)圖5。反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積隨加入衍生試劑溶液的增大而增大,當(dāng)催化劑的摩爾量為反應(yīng)物的20倍后反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積沒(méi)有明顯增加。

    3.2 高效液相色譜條件確定

    衍生化反應(yīng)后,將衍生產(chǎn)物在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外掃描,其最大吸收波長(zhǎng)為238 nm,故選擇238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。采用甲醇和1%磷酸溶液為流動(dòng)相,衍生產(chǎn)物的峰形較好。同時(shí),流動(dòng)相的用量比為甲醇-1%磷酸(83∶17,V∶V)、流速為1.0 mL/min時(shí),可以使衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)峰獲得最佳分離。

    4 小結(jié)

    采用本法測(cè)定人工牛黃中豬去氧膽酸含量的結(jié)果與其他方法[4-5]相差不大。與其他文獻(xiàn)報(bào)道的衍生方法[6-7]相比,本法以價(jià)格低廉的溴乙?;噭檠苌噭?、三乙胺為催化劑,提供堿性環(huán)境,降低了衍生反應(yīng)的成本。本試驗(yàn)考察了衍生試劑用量、催化劑用量、反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生產(chǎn)物的影響,確定了衍生反應(yīng)進(jìn)行完全所需的條件。整個(gè)衍生反應(yīng)可在1 h內(nèi)完成,利用HPLC-UV法對(duì)其進(jìn)行分離,可在15 min內(nèi)完成;方法學(xué)考察結(jié)果顯示本法穩(wěn)定可靠,可作為人工牛黃中豬去氧膽酸的含量測(cè)定的方法。本研究可為其他甾體類等無(wú)紫外吸收物質(zhì)的分析提供依據(jù),是一種靈敏度高、價(jià)格低廉、重復(fù)性好、快速簡(jiǎn)便的分析方法。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:5-8.

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    [3] 熊靖.人工牛黃甲硝唑膠囊中主要膽汁酸類成分的HPLC-ELSD法測(cè)定研究[J].藥物分析雜志,2015,35(6):1067-1071.

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    (收稿日期:2015-11-07;編輯:陳靜)

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