AGEs對人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白表達的影響*

章順榮， 高 越， 封 菲

(杭州市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學科，浙江 杭州 310006)

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·短篇論著·

AGEs對人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白表達的影響*

章順榮， 高 越△， 封 菲

(杭州市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學科，浙江 杭州 310006)

目的： 明確晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是否可引起內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2表達水平的變化。方法: AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。將購買的原代人主動脈內(nèi)皮細胞株進行體外擴增、傳代、分組，進行AGEs干預，分為對照組，不同濃度梯度的AGEs干預組(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干預不同時間組(分別是100 mg/L的AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用實時熒光定量PCR方法對AGEs干預后的人主動脈內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達水平進行檢測；采用Western blot法對AGEs干預后的人主動脈內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果: 不同濃度AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平顯著降低；100 mg/L AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞6 h，Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比無顯著變化，而干預12 h、24 h和48 h均引起人主動脈內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平顯著降低。結(jié)論: AGEs干預體外培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞12 h后其線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達水平降低，提示AGEs可能引起內(nèi)皮細胞線粒體動力學的改變，并可能通過這一途徑引起內(nèi)皮細胞線粒體功能異常，而導致內(nèi)皮細胞的功能異常。

晚期糖基化終產(chǎn)物； 人主動脈內(nèi)皮細胞； 線粒體動力學； 線粒體融合蛋白

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白慢性非酶糖基化的產(chǎn)物，糖尿病患者、慢性腎功能不全患者以及老年人體內(nèi)AGEs的水平增高。AGEs與內(nèi)皮功能異常和動脈粥樣硬化的發(fā)病機制密切相關(guān)[1-2]，AGEs可引起內(nèi)皮細胞凋亡和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增加[3-4]。同時，最近研究表明線粒體動力學的改變與內(nèi)皮功能異常密切相關(guān)[5]。線粒體不僅僅是能量工廠，尚能通過網(wǎng)架的動態(tài)重構(gòu)、持續(xù)融合(fusion)和裂解(fission)來適應細胞能量需求的變化，這一動態(tài)改變過程被稱為線粒體動力學。研究表明線粒體動力學的改變與內(nèi)皮功能異常、糖尿病、動脈粥樣硬化、衰老、退行性疾病，以及腫瘤的發(fā)病機制相關(guān)[6]。然而AGEs是否可影響內(nèi)皮細胞線粒體動力學，從而通過這一途徑導致內(nèi)皮功能異常，目前國內(nèi)外尚未見有研究報導，是一個值得研究的靶點。

線粒體動力學是線粒體融合和裂解動態(tài)平衡的過程，涉及多種融合和裂解的關(guān)鍵蛋白，其中Mfn1和Mfn2分別是線粒體融合的2種關(guān)鍵蛋白[7]。本研究通過AGEs體外干預人主動脈內(nèi)皮細胞，來觀察AGEs是否可引起人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合關(guān)鍵蛋白Mfn1和Mfn2表達水平的變化，從而可能導致人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體動力學的變化。

材 料 和 方 法

1 細胞株和主要試劑

原代人主動脈內(nèi)皮細胞株購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。

糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end product-bovine serum albumin，AGE-BSA)購于Millipore；人主動脈內(nèi)皮細胞特殊培養(yǎng)基購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒購自Generay；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas；qPCR試劑SuperReal PreMix Plus (with SYBR Green I)購自TIANGEN；anti-GAPDH antibody購自Bioworld；anti-Mfn1 antibody和anti-Mfn2 antibody購自 CST。

2 方法

2.1 人主動脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和AGEs的干預 人主動脈內(nèi)皮細胞株接種于6孔板培養(yǎng)基，常規(guī)傳代，待內(nèi)皮細胞生長至約80%滿后換液，對照組繼續(xù)以含10%胎牛血清特殊培養(yǎng)液培養(yǎng)，而另外3組則在含10%胎牛血清的特殊培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的AGEs，使AGEs的終濃度分別為50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，PBS沖洗后，提取各組的總RNA和總蛋白，-20 ℃條件下保存，用于下一步研究。

另一批內(nèi)皮細胞按2×107/L濃度接種于含有載玻片的6孔板培養(yǎng)基，分為對照組和100 mg/L AGEs干預6 h、12 h、24 h、48 h組，共5組。待內(nèi)皮細胞生長至鋪滿80%玻片后換液，對照組繼續(xù)以含10%胎牛血清的特殊培養(yǎng)液培養(yǎng)，干預組則在培養(yǎng)液中加入終濃度為100 mg/L的AGEs，繼續(xù)分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h后去除培養(yǎng)液，PBS液沖洗后提取總蛋白和總RNA，-20 ℃條件下保存，用于進一步研究分析。

2.2 實時熒光定量PCR檢測Mfn1和Mfn2 mRNA的表達水平 以相應溶劑為對照(blank組)，取2 μL RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，觀察A260/A280均>2.0且<2.3、觀察A260/A230比值及連續(xù)波長吸收峰，并計算RNA溶液濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行實時熒光定量PCR擴增檢測。Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物對，各引物序列見表1。PCR擴增反應體系為IQ SYBR Green Supermix 10 μL，10 μmol/L的forward primer 1 μL， 10 μmol/L的reverse primer 1 μL，cDNA(加水稀釋成一致水平) 8 μL。Real-time PCR 條件為95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s、58 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。實驗重復3次，結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager自動進行統(tǒng)計和計算。

表1 Real-time PCR 引物序列

2.3 Western blot法檢測Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平 采用 RIPA裂解液(含1.2 mmol/L的PMSF)裂解內(nèi)皮細胞，之后離心提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。上樣前樣品加入5×上樣緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg。50 mA恒流電泳至溴酚藍跑完濃縮膠層，分離膠電泳電流為60 mA；200 mA恒流轉(zhuǎn)膜；將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h。磷酸化抗體采用5% BSA 封閉，置搖床上緩慢搖動室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，加入Ⅰ抗4 ℃過夜后浸于TBST緩沖液中，于搖床上洗滌 15 min 3次；加入Ⅱ抗，于室溫搖床上孵育1 h，洗膜同前，ECL化學發(fā)光顯影，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導出后在ImageJ軟件下分析各條帶光密度。

3 統(tǒng)計學處理

實時熒光定量PCR實驗結(jié)果由熒光定量PCR分析軟件Bio-Rad CFX Manager自動進行統(tǒng)計和計算，并生成相應的PDF文檔和Excel原始數(shù)據(jù)文件。運用ImageJ 1.43圖像分析軟件對Western blot圖片進行灰度掃描半定量分析。所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 AGEs引起人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2 mRNA的表達水平降低

1.1 不同濃度的AGEs干預HAECs，引起Mfn1和Mfn2 mRNA表達水平降低 如圖1所示，50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞24 h后引起內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。

Figure 1.The relative mRNA expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with AGEs at different concentrations for 24 h. The relative mRNA expression levels were normalized to the GAPDH level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖1 不同濃度的AGEs干預HAECs 24 h引起Mfn1和Mfn2的mRNA表達水平降低

1.2 100 mg/L的AGEs干預HAECs 不同的時間，Mfn1和Mfn2 mRNA表達水平變化 如圖2所示，100 mg/L的AGEs分別干預人主動脈內(nèi)皮細胞6 h、12 h、24 h和48 h后，除了干預6 h組外，其余各不同干預時間組，內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)。

2 AGEs引起人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平降低

2.1 不同濃度的AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞24 h引起Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平降低 如圖3所示，Western blot法檢測結(jié)果顯示50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞24 h后引起其Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。

2.2 100 mg/L的AGEs干預不同時間引起HAECs Mfn1和mfn2蛋白表達水平的降低 如圖4所示，Western blot法檢測結(jié)果顯示 100 mg/L的AGEs分別干預人主動脈內(nèi)皮細胞6 h、12 h、24 h和48 h后，除6 h干預組外，其余各不同時間干預組內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平與對照組相比均顯著下降(P<0.05)。

Figure 2.The relative mRNA expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with 100 mg/L AGEs for different time intervals. The relative mRNA expression levels were normalized to the GAPDH level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

圖2 100 mg/L的AGEs干預HAECs 不同時間Mfn1和Mfn2 mRNA的相對表達水平

Figure 3.AGEs at different concentrations (50 mg/L, 100 mg/L and 200 mg/L) downregulated the protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3 不同濃度的AGEs干預 HAECs 24 h引起Mfn1和Mfn2蛋白表達水平降低

討 論

動脈粥樣硬化的發(fā)病機制涉及多種因素，特別是糖尿病患者，內(nèi)皮功能異常起著關(guān)鍵的作用。改善內(nèi)皮功能可延緩動脈粥樣硬化的進展，能改善相應疾病(如冠心病、腦動脈供血不足)癥狀和減少并發(fā)癥，是動脈粥樣硬化防治的重要靶點之一。而線粒體功能障礙與心血管疾病關(guān)系密切[8]，線粒體動力學不僅在維持線粒體的正常功能中起著關(guān)鍵作用，其異常改變與內(nèi)皮功能異常、糖尿病、動脈粥樣硬化、衰老、退行性疾病，以及腫瘤的發(fā)病機制相關(guān)[6]。線粒體動力學異常導致內(nèi)皮功能異常，從而引起動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[9-10]。

Figure 4.The protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs stimulated with 100 mg/L AGEs for different time intervals. Except for 6 h intervention group, the protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in the HAECs for 12 h, 24 h, and 48 h were all downregulated. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖4 100 mg/L AGEs干預HAECs不同時間Mfn1和Mfn2的蛋白表達水平

AGEs與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制密切相關(guān)，是糖尿病心血管并發(fā)癥的關(guān)鍵致病因子，可以引起血管內(nèi)皮功能異常。AGEs刺激血管內(nèi)皮細胞能增加誘導型一氧化氮合酶的表達，誘導內(nèi)皮細胞凋亡，促進細胞外基質(zhì)、促凝血因子、組織因子、血小板與平滑肌細胞接觸，引起單核/巨噬細胞遷移，吞噬脂質(zhì)，啟動動脈粥樣硬化的病理過程，促進早期動脈粥樣硬化斑塊的形成[11]。最近研究表明，AGEs能促進心肌細胞和血管平滑肌細胞的自噬[12-13]。

但是AGEs是否通過影響線粒體動力學，引起線粒體動力學的異常，從而導致內(nèi)皮功能異常，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，目前國內(nèi)外尚未見研究報道，是一個值得研究的靶點。線粒體動力學是融合和裂解動態(tài)平衡的過程，正常情況下融合和裂解保持平衡，線粒體形態(tài)保持在管狀和顆粒狀之間，如融合增加則線粒體表現(xiàn)為長管狀形態(tài)，而裂解增加則表現(xiàn)為碎顆粒狀形態(tài)。裂解和融合過程涉及多種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白，Mfn1、Mfn2、OPA1參與融合過程，而Fis1、Drp1等參與裂解過程，此外，多種其它激酶參與了調(diào)節(jié)這一過程[14]。本研究采用AGEs干預體外培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞，對線粒體膜2種關(guān)鍵融合蛋白Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白的表達水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGEs干預能引起人主動脈內(nèi)皮細胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平降低，AGEs的干預濃度從50 mg/L到200 mg/L，干預時間從12 h到48 h均能引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平下降。但AGEs干預人主動脈內(nèi)皮細胞6 h，Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表達水平未下降，這可能與干預時間過短、基因表達水平的改變尚未顯現(xiàn)有關(guān)。

一般認為內(nèi)皮細胞線粒體融合增加具有保護作用，具有維持正常線粒體功能和內(nèi)皮功能的作用，而裂解增加則引起線粒體功能異常、ROS的產(chǎn)生增加，導致內(nèi)皮功能異常。例如，線粒體裂解蛋白Drp-1抑制劑Mdivi-1抑制線粒體的裂解能減輕壓力負荷誘導的心衰[15]和阿霉素誘導的心臟毒性[16]，而過表達Mfn2則能抑制血管緊張素2引起的心肌肥厚[17]，外源性Mfn2基因的轉(zhuǎn)染能改善非酒精性脂肪肝細胞線粒體的功能、減少ROS的產(chǎn)生[18]。鑒于研究表明AGEs引起內(nèi)皮細胞功能異常、損傷和凋亡，但是否通過影響線粒體動力學這一機制而導致內(nèi)皮損傷和功能異常目前國內(nèi)外未見有研究報導。本研究初步表明，AGEs體外干預培養(yǎng)的人主動脈內(nèi)皮細胞引起線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達水平降低，提示AGEs可能改變內(nèi)皮細胞的線粒體動力學，即線粒體的融合減少而線粒體的裂解增加，從而通過這一途徑引起內(nèi)皮細胞功能異常。

本研究也存在一定的不足之處，由于未采用牛血清白蛋白(BSA)干預人主動脈內(nèi)皮細胞作對照，因此不能完全排除高濃度的BSA可能會影響內(nèi)皮細胞的基因表達水平。但理論上講，血清白蛋白作為血清中的正常成分一般不會影響內(nèi)皮細胞的正?；虮磉_水平，此外，內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)液中也有一定成分的胎牛血清。

總之，本研究表明AGEs可引起人主動脈內(nèi)皮細胞線粒體融合蛋白Mfn1和Mfn2的表達水平降低，提示AGEs可能引起線粒體的融合減少，從而通過這一途徑引起內(nèi)皮細胞功能異常。本研究對進一步明確糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病機制具有重要意義，可以揭示AGEs引起血管內(nèi)皮損傷的新機制，為糖尿病動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of AGEs on expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured human aortic endothelial cells

ZHANG Shun-rong, GAO Yue, FENG Fei

(GeriatricDepartment,HangzhouFirstPeople’sHospital,Hangzhou310006,China.E-mail:gy9821@sina.com.cn)

AIM: To clarify whether advanced glycation end products (AGEs) can influence the expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured human aortic endothelial cells (HAECs)invitro. METHODS: AGE-BSA was used as AGEs. Purchased primary human aortic endothelial cell line was multiplied, and transferred to different passages for subsequent grouping. For dose-dependent experiment, HAECs were divided into 4 groups, and the concentrations of AGE-BSA in each group were 0 mg/L (control group), 50 mg/L, 100 mg/L and 200 mg/L, respectively. For time-dependent experiment, HAECs were divided into 5 groups with the same concentration (100 mg/L) of AGE-BSA, but the intervention time was 0 h (control group), 6 h, 12 h, 24 h and 48 h, respectively. The mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in the HAECs were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: Exposure of the HAECs to AGEs at different concentrations for 24 h all down-regulated the mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2. Except for 6 h intervention group, 100 mg/L AGEs intervention for 12 h, 24 h and 48 h all down-regulated the mRNA and protein expression levels of Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs. CONCLUSION: AGEs down-regulates the expression of mitochondrial fusion proteins Mfn1 and Mfn2 in cultured HAECs, indicating that AGEs may influence mitochondrial dynamics of human aortic endothelial cells.

Advanced glycation end products; Human aortic endothelial cells; Mitochondrial dynamics; Mitochondrial fusion proteins

1000- 4718(2016)09- 1688- 06

2016- 01- 07

2016- 08- 03

杭州市科技計劃項目(No.20120633B04)

△通訊作者 Tel: 0571-56006872; E-mail: gy9821@sina.com.cn

R543.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.026

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