雷公藤多苷通過(guò)NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路抑制結(jié)腸炎癥*

鄭健豪， 鐘繼紅， 曹海軍， 朱 靈， 劉 軍， 胡華軍， 李善高△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院消化科， 2附屬第二醫(yī)院消化科， 3中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310006)

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雷公藤多苷通過(guò)NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路抑制結(jié)腸炎癥*

鄭健豪1， 鐘繼紅2， 曹海軍1， 朱 靈1， 劉 軍3， 胡華軍3， 李善高1△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)1附屬第一醫(yī)院消化科，2附屬第二醫(yī)院消化科，3中國(guó)計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察雷公藤多苷對(duì)右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的防治作用及對(duì)黏膜組織NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)-活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)-NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體信號(hào)通路表達(dá)的影響，探討其治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制。方法: BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：模型組；低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組；正常組。采用DSS誘發(fā)UC動(dòng)物模型，雷公藤多苷灌胃21 d 后，取結(jié)腸組織，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織NLRP3、ASC及caspase-1 的mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織caspase-1的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿上清IL-1α、TNF-α及IL-13的含量，魯米諾化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織ROS的生成和經(jīng)DPI(NOXs抑制劑)抑制后的NADPH消耗率來(lái)分析NOXs活性；體外分離結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞，檢測(cè)分離的中性粒細(xì)胞中ROS的生成、NOXs活性以及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果: 雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理均存在不同程度異常，但組織病理學(xué)評(píng)分均低于模型組；雷公藤多苷灌胃各組結(jié)腸黏膜組織和分離的中性粒細(xì)胞中，除高劑量組結(jié)腸黏膜組織caspase-1的mRNA表達(dá)與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余各組ROS生成、NOXs活性及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除中、高劑量組結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞caspase-1的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其它指標(biāo)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清中促炎因子(IL1α和TNF-α)含量低于模型組(P<0.05)，高于正常組(P<0.05)，抑炎因子(IL-13)含量各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: 雷公藤多苷可能通過(guò)抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路來(lái)降低IL-1α、TNF-α等促炎因子的表達(dá)從而對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠起保護(hù)作用，中性粒細(xì)胞可能是參與其保護(hù)作用的主要炎性細(xì)胞。

雷公藤多苷； 右旋葡聚糖硫酸鈉； 潰瘍性結(jié)腸炎； 活性氧簇； NADPH氧化酶； NLRP3炎癥小體

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為UC的發(fā)生與免疫反應(yīng)異常有關(guān)[1]。雷公藤多苷(Tripterygiumglycosides,TG)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤根提取精制而成[2]，具有很強(qiáng)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探討雷公藤多苷對(duì)右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)小鼠UC的防治作用，并從NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體信號(hào)通路的角度探討其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和試劑

健康雄性BALB/c小鼠50只，8周齡，體重(20±2) g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2013-0016。DSS購(gòu)自Sigma，臨用前配成5% 的溶液(5 g DSS溶于100 mL 蒸餾水)。雷公藤多苷片購(gòu)于浙江得恩德制藥有限公司，臨用前按人-小鼠體表面積換算，分別溶于蒸餾水配制成低、中、高劑量的雷公藤多苷混懸液，即：9.02 mg·kg-1·d-1、27.02 mg·kg-1·d-1和81.08 mg·kg-1·d-1。檢測(cè)IL-1α、TNF-α和IL-13的ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于R&D。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理 參考文獻(xiàn)[3-4]制作UC模型，小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組，低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組和正常組。自第1周開(kāi)始模型組和雷公藤多苷灌胃各組小鼠自由飲用5% DSS溶液，正常組小鼠自由飲用純凈水，同時(shí)，模型組小鼠每天用蒸餾水按0.02 mL/g進(jìn)行灌胃，每天1次，而低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組每天分別用低、中、高劑量雷公藤多苷混懸液按0.02 mL/g進(jìn)行灌胃，每天1次。造模開(kāi)始后第8天各組隨機(jī)處死1只小鼠，剖腹，觀察結(jié)腸組織大體形態(tài)，然后取直乙交界處結(jié)腸組織病檢(HE 染色)，以明確是否造模成功。第2周開(kāi)始，各組小鼠均自由飲用純凈水，其中模型組小鼠繼續(xù)每天蒸餾水灌胃1次，低、中及高劑量雷公藤多苷灌胃組每天分別用低、中、高劑量雷公藤多苷混懸液灌胃，每天1次，至21 d后取直乙交界處結(jié)腸組織，分別進(jìn)行如下處理：(1)PCR 樣品保存液保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ROS和NOXs檢測(cè)；(2)10%福爾馬林固定，用于HE染色及免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)；(3)PBS 液保存，用于ELISA檢測(cè)和分離中性粒細(xì)胞。

2.2 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取上述置10%福爾馬林固定的結(jié)腸組織，石蠟包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 小鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) (1) 黏膜損傷：無(wú)黏膜損傷為0分；接近基膜1/3的隱窩丟失為1分；接近基膜2/3的隱窩丟失為2分；隱窩全部消失，上皮細(xì)胞完整覆蓋為3分；隱窩、上皮都消失為4分；(2)病變范圍：無(wú)病變?yōu)?分；局灶性病變?yōu)?分；病變大約累及1/3黏膜為2分；病變大約累及2/3黏膜為3分；病變累及到全部黏膜組織為4分。組織病理學(xué)評(píng)分總分(histological score，HS)為黏膜損傷評(píng)分與病變范圍評(píng)分的乘積[3]。

2.4 分離結(jié)腸組織中的中性粒細(xì)胞 采用組織中性粒細(xì)胞分離試劑盒(購(gòu)于上海易佰聚生物)分離結(jié)腸組織中的中性粒細(xì)胞，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 ROS測(cè)定 應(yīng)用ROS檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜組織和分離的中性粒細(xì)胞中的ROS水平，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.6 NOXs 活性測(cè)定 結(jié)腸黏膜組織和分離的中性粒細(xì)胞經(jīng)胰酶(Gibco)消化后，4 ℃、2 500×g離心5 min，然后以PBS懸浮，接著加入250 μmol/L NADPH(北京博潤(rùn)萊特科技有限公司)孵育，5 min后測(cè)定340 nm波長(zhǎng)的吸光度，通過(guò)吸光率的減少來(lái)測(cè)定NADPH的消耗量。為了分析NOXs特異活性，在測(cè)定之前30 min加入10 μmol/L DPI(NOXs抑制劑，Sigma)，測(cè)定DPI抑制后的NADPH 的消耗率。為標(biāo)準(zhǔn)化，用等量的細(xì)胞加入SDS溶解，濃縮蛋白后用Lowry solution測(cè)定，計(jì)算NADPH消耗總量的吸收消光系數(shù)是6.22 L·mmol-1·cm-1，NOXs活性用pmol NADPH·min-1·mg-1表示。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織和分離的中性粒細(xì)胞中NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達(dá) 用TRIzol裂解結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞，氯仿抽提，異丙醇沉淀，75% 乙醇洗滌，DEPC水溶解，使用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量和純度。cDNA合成具體步驟按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增具體步驟參照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列和反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR的有關(guān)參數(shù)

F:forward；R:reverse.

2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸黏膜組織中caspase-1的表達(dá) 采用二步法(EnVisionTM試劑盒)，基本工作步驟為脫蠟、水化；預(yù)處理組織切片(據(jù) I 抗具體說(shuō)明而定)，熱修復(fù)；3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育10 min；滴加 I 抗孵育60 mim；滴加山羊抗兔IgG抗體孵育40 min；DAB顯色液顯色3 min，在顯微鏡下控制反應(yīng)，純凈水沖洗終止反應(yīng)；漂洗,復(fù)染，封片。在細(xì)胞漿和/或胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)黃、棕色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞。利用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定吸光度(A)值。

2.9 組織勻漿上清中IL-1α、TNF-α及IL-13含量的測(cè)定 取結(jié)腸組織，切成(2～3) mm×1 mm×1 mm小塊，放入組織勻漿器中，加入適量PBS，冰上研磨，研磨產(chǎn)物在4oC下12 000×g離心15 min，取上清液分裝，-80oC保存，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠的一般狀況

除正常組小鼠外，自造模開(kāi)始后其余各組動(dòng)物均出現(xiàn)少動(dòng)，進(jìn)食少，毛色失去光澤，精神倦怠,不同程度的腹瀉，肉眼便血, 肛門血染，體重下降等癥狀，但雷公藤多苷灌胃各組小鼠較模型組上述癥狀較輕，各組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變及評(píng)分

造模第8天，模型組及雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)不同程度的充血水腫及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表明造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評(píng)分明顯低于模型組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃高劑量組的組織病理學(xué)評(píng)分與正常組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但雷公藤多苷灌胃中、低劑量組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除中、低劑量組間病理學(xué)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

Figure 1.HE staining of mouse colon sections in different groups (×100).

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色

表2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分和結(jié)腸組織中caspase-1的表達(dá)

Table 2.The histological score of mouse colon tissues and the expression of caspase-1 in different groups (Mean±SD.n=9)

GroupHistologicalscoreCaspase-1(Avalue)Model8.23±1.538.10±1.33Low-doseTG5.00±1.00*6.20±0.93*Medium-doseTG4.67±0.54*4.10±0.46*?High-doseTG2.57±0.48*?▲3.30±0.12*?Normal1.03±0.58*1.20±0.38*

*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow dose TG;▲P<0.05vsmedium dose TG.

3 小鼠結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞ROS生成水平和NOXs活性

雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞中ROS生成水平和NOXs活性明顯低于模型組，但高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，以高劑量組最低，低劑量組最高，各組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.ROS generation and NOXs activity in the mouse colon tissues and neutrophils of different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

圖2 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞ROS生成和NOXs活性的比較

4 小鼠結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表達(dá)水平

雷公藤多苷灌胃各組結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞中，除了結(jié)腸黏膜組織正常組與高劑量組caspase-1的mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余各組NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)；但高于正常組(P<0.05)。雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除結(jié)腸黏膜組織及分離的中性粒細(xì)胞中、高劑量組caspase-1的mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余各組之間NLRP3、ASC及caspase-1 的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The mRNA expression levels of NLRP3, caspase-1 and ASC in the mouse colon tissues and neutrophils of different groups. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmodel;?P<0.05，??P<0.01vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織及分離的中性粒細(xì)胞NLRP3、ASC 及caspase-1 mRNA表達(dá)水平的比較

5 小鼠結(jié)腸黏膜組織caspase-1免疫組化染色結(jié)果

模型組、雷公藤多苷灌胃各組caspase-1表達(dá)量均高于正常組，且結(jié)腸炎癥黏膜區(qū)caspase-1表達(dá)遠(yuǎn)高于非炎癥黏膜區(qū)，該表達(dá)現(xiàn)象在模型組尤為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與模型組相比，雷公藤多苷灌胃各組結(jié)腸黏膜組織caspase-1表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除了中、高劑量組間caspase-1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

Figure 4.Detection of caspase-1 expression in the mouse colon sections in different groups (×200).

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織caspase-1的檢測(cè)

6 小鼠結(jié)腸黏膜組織勻漿上清中IL-1α、TNF-α及IL-13含量

雷公藤多苷灌胃各組小鼠結(jié)腸黏膜組織勻漿上清中IL-1α和TNF-α的含量明顯低于模型組(P<0.05)，但高于正常組(P<0.05)；雷公藤多苷灌胃各組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，除了高、中劑量組間IL-1α含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；各組間IL-13含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織勻漿上清IL-1α、TNF-α及IL-13含量

Table 3.The IL-1α, TNF-α and IL-13 levels in the supernatant of colon tissue homogenate in different groups (ng/L. Mean±SD.n=9)

GroupIL-1αTNF-αIL-13Model265.4±24.9313.6±47.398.5±16.5Low-doseTG200.0±16.4*230.8±18.8*119.4±20.2Medium-doseTG150.3±22.8*?178.8±19.3*?106.0±2.7High-doseTG159.5±19.5*?82.1±21.5*?▲103.8±5.4Normal52.9±6.7*27.4±7.3*22.0±15.4

*P<0.05vsmodel;?P<0.05vslow-dose TG;▲P<0.05vsmedium-dose TG.

討 論

UC發(fā)病機(jī)制仍不明，現(xiàn)認(rèn)為UC是免疫、遺傳、環(huán)境及腸道菌群等多因素共同作用的結(jié)果，其中免疫功能紊亂被認(rèn)為是重要致病因素之一[5]。目前治療炎癥性腸病3大類藥物(氨基水楊酸類藥物、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑)雖然有一定效果，但均存在諸多副作用，不宜長(zhǎng)期服用。因此，尋找一種高效，且毒副作用少、能長(zhǎng)期用于UC患者維持緩解治療的藥物已迫在眉睫。

雷公藤多苷是從中藥雷公藤中提取出來(lái)的有效成分，具有很強(qiáng)抗炎，免疫調(diào)節(jié)作用,能夠抑制多種細(xì)胞因子表達(dá)，如IL-1、IL-12、TNF-α等[6]。有研究報(bào)道雷公藤多苷能夠有效抑制小鼠結(jié)腸急性炎癥反應(yīng)[7]，其具體作用機(jī)制仍不清楚。

Bauer等[8]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎耐受，其機(jī)制可能與結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少有關(guān)，NLRP3炎癥性小體在炎癥疾病中有著重要作用。NLRP3炎癥性小體的激活機(jī)制目前認(rèn)為與鉀離子外流、溶酶體破壞和ROS生成有關(guān)，其中ROS生成是最主要的激活機(jī)制[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激致機(jī)體免疫功能紊亂被認(rèn)為可能在UC發(fā)病機(jī)制中起重要作用，而ROS是氧化應(yīng)激的分子基礎(chǔ)[10]。在胃腸道紊亂患者腸道定居的中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中NOXs能促進(jìn)ROS的生成[11]。中性粒細(xì)胞是參與組織炎癥損害的主要細(xì)胞之一[12]，其在UC中的主要機(jī)制為遷移以及聚集在炎癥部位[13-14]，并釋放出炎癥因子以及大量ROS[15-16]，故推測(cè)在UC炎癥部位，NOXs能夠促進(jìn)ROS生成，而中性粒細(xì)胞是其中參與的主要炎性細(xì)胞。綜上所述，UC發(fā)病機(jī)制可能通過(guò)NOXs活化產(chǎn)生大量ROS，激活NLRP3炎癥性小體釋放促炎因子，而雷公藤多苷抑制腸道炎癥反應(yīng)是否是通過(guò)抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號(hào)通路發(fā)揮作用，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠自由飲用5% DSS溶液成功復(fù)制了與人類UC類似的小鼠UC動(dòng)物模型，運(yùn)用雷公藤多苷干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜組織ROS生成水平和NOXs活性、NLRP3炎癥性小體各組成部分(NLRP3、caspase-1和ASC)在小鼠結(jié)腸黏膜組織表達(dá)水平，及受NLRP3炎癥性小體調(diào)節(jié)下游蛋白(促炎因子如IL-1α、TNF-α和抑炎因子如IL-13)表達(dá)，探討雷公藤多苷對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠UC的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷灌胃各組ROS生成水平和NOXs活性，NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA表達(dá)水平，IL-1α及TNF-α含量雖高于正常組，但明顯低于模型組，其組織病理學(xué)評(píng)分明顯好于模型組，以上作用以高劑量組最明顯，各組抑炎因子(IL-13)表達(dá)水平無(wú)明顯變化。表明雷公藤多苷對(duì)DSS誘發(fā)UC起防治作用可能是經(jīng)雷公藤多苷干預(yù)后致結(jié)腸黏膜組織ROS生成水平和NOXs的活性及NLRP3炎癥性小體各組成部分表達(dá)下調(diào)，降低促炎因子(IL-1α和TNF-α)表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，與調(diào)控抑炎因子的表達(dá)無(wú)關(guān)。為明確中性粒細(xì)胞在雷公藤多苷對(duì)DSS誘發(fā)UC發(fā)生中的作用，我們還通過(guò)體外分離結(jié)腸組織中的中性粒細(xì)胞，并檢測(cè)了以上指標(biāo)，結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果一致，說(shuō)明中性粒細(xì)胞是參與其保護(hù)作用的主要炎性細(xì)胞。

綜上所述，據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果推測(cè)雷公藤多苷對(duì)DSS誘導(dǎo)UC具有防治作用可能是雷公藤多苷通過(guò)抑制腸道NOXs活性及ROS生成，從而抑制NLRP3炎癥性小體的激活，最后抑制促炎因子的表達(dá)，即抑制NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用。后續(xù)將在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用ROS與NOXs的抑制劑及激動(dòng)劑進(jìn)一步研究雷公藤多苷對(duì)NOXs-ROS-NLRP3炎癥性小體信號(hào)通路的具體作用機(jī)制，挖掘信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子及防治UC作用的最適劑量，為臨床運(yùn)用雷公藤多苷治療UC提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Neuman MG. Immune dysfunction in inflammatory bowel disease[J]. Transl Res, 2007, 149 (4):173-186.

[2] 黃 真，毛慶秋. 雷公藤多苷的臨床應(yīng)用、不良反應(yīng)及預(yù)防[J]. 藥品評(píng)價(jià)， 2005, 2(2):125-127.

[3] 李旺林，曹 杰，肖煥擎，等. 大腸埃希氏菌在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎恢復(fù)中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(1):163-167.

[4] 祝 斌，張寒仙，曾今誠(chéng)，等.美沙拉嗪對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型Th1、Th17及Treg細(xì)胞亞群的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(12):2219-2225.

[5] 趙 曼，高 峰. 潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 16(10):3160-3165.

[6] 周 泠，劉卓志. 雷公藤多甙栓對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TNF-α和IL-8 的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院報(bào), 2006, 29 (1):31-33.

[7] 肖南平，歐陽(yáng)欽. 雷公藤多苷對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-23、IL-17和IL-12表達(dá)的影響[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(9):1069-1073.

[8] Bauer C, Duewell P, Mayer C. Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium (DSS) is mediated by the NLRP3 inflammasome[J]. Gut, 2010, 59(9)：1192-1199.

[9] Tschopp J, Schroder K. NLRP3 inflammasome activation: the convergence of multiple signalling pathways on ROS production?[J]. Nat Rev Immunol, 2010, 10(3):210-215.

[10]Zhu H, Li YR. Oxidative stress and redox signaling me-chanisms of inflammatory bowel disease: updated experimental and clinical evidence[J]. Exp Biol Med, 2012, 237(5):474-480.

[11]Pongnimitprasert N,EI-Benna J,Foglietti MJ,et al.Potential role of the “NADPH oxidases”(NOX/DUOX) family in cystic fibrosis[J]. Ann Biol Clin (Paris), 2008, 66(6):621-629.

[12]El-Benna J, Dang PM, Gougerot-Pocidalo MA. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane[J]. Semin Immunopathol, 2008, 30(3): 279-289.

[13]Podolsky DK. Inflammatory bowel disease[J]. N Engl J Med, 2002， 347(6): 417-429.

[14]Kucharzik T, Walsh SV, Chen J, et al. Neutrophil transmigration in inflammatory bowel disease is associated with differential expression of epithelial intercellular junction proteins[J]. Am J Pathol, 2001, 159(6):2001-2009.

[15]Naito Y, Takagi T, Yoshikawa T. Molecular fingerprints of neutrophil dependent oxidative stress in inflammatory bowel disease[J]. J Gastroenterol, 2007, 42(10): 787-798.

[16]Naito Y, Takagi T, Yoshikawa T. Neutrophil-dependent oxidative stress in ulcerative colitis[J]. J Clin Biochem Nutr, 2007, 41(1):18-26.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Tripterygium glycosides suppress colitis via NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways

ZHENG Jian-hao1, ZHONG Ji-hong2, CAO Hai-jun1, ZHU Ling1, LIU Jun3,HU Hua-jun3, LI Shan-gao1

(1DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,2DepartmentofGastroenterology,TheSecondAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,3AcademyofLifeSciencesofJiliangUniversityofChina,Hangzhou310006,China.E-mail:galisga@aliyun.com)

AIM: To observe the effect ofTripterygiumglycosides on NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways in the colon tissue in dextran sulphate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis (UC) mice, and to investigate the underlying mechanisms. METHODS: BALB/c mice were used and the mouse model of UC was established by DSS induction. The mice were randomly divided into 5 groups (model group, low-， medium- and high-doseTripterygiumglycosides groups， and normal group). The colon tissues were collected 21 d afterTripterygiumglycosides gavage. The mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 in the colon tissues was detected by real-time PCR. The caspase-1 expression in the colorectal mucosa was observed by immunohistochemical method. ELISA was used to detect the protein le-vels of IL-1α, TNF-α and IL-13. The production of reactive oxygen species (ROS) was measured by chemiluminescence technique, and the consumption rate of NADPH, which was inhibited by DPI, was analyzed to determine the activity of NADPH oxidases (NOXs). The neutrophils were isolated, and the ROS production, NOXs activity, and the mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were also detected. RESULTS: The colon tissues were abnormal with different degrees inTripterygiumglycosides groups, and histopathological scores were lower than that in model group. InTripterygiumglycosides groups, in addition to the mRNA expression levels of caspase-1 in the colon tissues between normal group and high-dose group, ROS production, NOXs activity and the mRNA expression levels of NLRP3, ASC and caspase-1 in the colon tissues and colon-isolated neutrophils were lower than those in model group (P<0.05), and higher than those in normal group (P<0.05). The results of pairwise comparison for the efficacy ofTripterygiumglycosides administration showed that the above indexes were statistically significant except the mRNA expression levels of caspase-1 between middle-dose group and high-dose group.Tripterygiumglycosides administration significantly decreased the expression levels of proinflammatory cytokines IL-1α and TNF-α in the homogenates of colon tissues in the model mice (P<0.05). No difference of IL-13 expression among the groups was observed. CONCLUSION:Tripterygiumglycosides inhibits NOXs-ROS-NLRP3 inflammatory signaling pathways to reduce the expression of IL-1α, TNF-α and other proinflammatory cytokines, and attenuates DSS-induced ulcerative colitis in mice, by which the neutrophils might be involved in the process.

Tripterygiumglycosides; Dextran sulphate sodium; Ulcerative colitis; Reactive oxygen species; NADPH oxidases; NLRP3 inflammasome

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