冷鮮調理肉三種乳酸菌發(fā)酵劑的篩選

張　飛，劉　哲，羅愛平*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

冷鮮調理肉三種乳酸菌發(fā)酵劑的篩選

張飛，劉哲，羅愛平*

（貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

為篩選出符合冷鮮調理肉制品發(fā)酵的優(yōu)質乳酸菌發(fā)酵劑，對3株乳酸菌的發(fā)酵特性進行研究，通過耐鹽、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)粘、產(chǎn)酸能力、蛋白質和脂肪分解能力、菌種間的拮抗作用等試驗對其進行優(yōu)勢菌種篩選。結果表明，菌株LLSL、LP、LGG對食鹽和亞硝酸鹽具有較好的耐受性，能在6%的食鹽溶液和150 mg/L亞硝酸鹽溶液中存活，能有效產(chǎn)酸，無降解蛋白質和脂肪能力，不產(chǎn)氣、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)H2S；其中，菌株LLSL、LP不產(chǎn)粘，兩者間無拮抗作用，可作為于冷鮮調理肉制品的發(fā)酵劑；菌株LGG產(chǎn)粘，影響冷鮮調理肉制品的感官品質和內部組織狀態(tài)，不適合作為冷鮮調理肉制品的發(fā)酵劑。

乳酸乳球菌乳酸亞種；植物乳桿菌；鼠李糖乳桿菌；篩選；發(fā)酵劑

冷鮮調理肉制品因食用方便，又能較好地保持肉的營養(yǎng)與風味，包裝精美和小容量化，以及免除清洗、切割、調理等步驟而廣受消費者青睞。其產(chǎn)品附加值較高、受國際產(chǎn)品競爭沖擊較小的優(yōu)點而被生產(chǎn)者推崇。但是貨架期短成為生鮮調理肉制品發(fā)展的主要制約因素。將調理肉制品與發(fā)酵肉制品有機結合，不僅延長貨架期，還可以改善肉制品風味。

發(fā)酵肉制品中的微生物包括乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母等，在整個發(fā)酵過程中，乳酸菌起著至關重要的作用［1］。發(fā)酵過程中乳酸菌的添加不僅可以有效降低產(chǎn)品的pH值、改善肉制品的組織結構和風味，而且可以降低產(chǎn)品中的亞硝酸鹽殘留、減少亞硝胺形成、抑制腐敗菌的生長和毒素的產(chǎn)生［2］。但并不是所有的乳酸菌都適合作為肉品發(fā)酵劑，乳酸菌的發(fā)酵性能差異對產(chǎn)品質量將產(chǎn)生很大的影響。如產(chǎn)生H2S、產(chǎn)粘將影響肉品的感官品質。

根據(jù)發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的基本要求，乳酸菌發(fā)酵劑應具有以下幾個特征：（1）能在6%的食鹽中正常生長，在80～100 mg/L質量濃度亞硝酸鹽中生長良好；對食鹽和亞硝酸鹽有一定的耐受力；（2）對蛋白質、脂肪無明顯直接分解作用；（3）無致病性，為益生菌；（4）產(chǎn)生乳酸，屬同型發(fā)酵，不產(chǎn)粘；（5）菌種間無拮抗作用［3-4］。

本研究選用乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp.Lactis，LLSL）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）三株益生菌為發(fā)酵菌株。菌株LLSL不僅能產(chǎn)生乳酸，而且代謝產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素（Nisin）［5］可延長肉制品的保質期［6］，但在發(fā)酵肉制品中的應用鮮見報道；菌株LP在發(fā)酵肉制品中被廣泛應用［7］并與其他乳酸菌有協(xié)同作用［8］；菌株LGG僅產(chǎn)L-乳酸并促使發(fā)酵骨粉提高骨粉中鈣轉化率的［9］。以肉制品發(fā)酵劑應具有的特性為依據(jù)進行研究，篩選適宜冷鮮調理肉乳酸菌的發(fā)酵菌株，為實現(xiàn)發(fā)酵調理肉制品的安全化和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.Lactis，LLSL）1.2281：購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）1.0557：貴州大學生命科學學院微生物實驗室提供；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LGG）1.2466：中國科學院微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：蒸餾水100 0 mL，乳酸菌專用MRS肉湯培養(yǎng)基，按說明配制，121℃高壓滅菌15 min，備用。用于菌種活化。

MRS固體培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，牛肉浸膏10.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，KH4PO32.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，MgSO40.58 g，M瓊脂粉15 g。121℃高壓滅菌15 min，備用。用于菌種產(chǎn)粘性試驗。

葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基：蒸餾水100 0 mL，牛肉浸膏10.0 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖1.0 g，氯化鈉10.5 g，調pH至7.4，加入溴甲酚紫溶液，待呈現(xiàn)紫色后再加葡萄糖。溶解分裝于試管，最后將杜氏小管倒置試管中，121℃高壓滅菌15 min。

產(chǎn)H2S培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，蛋白胨10.0 g牛肉浸膏7.5 g，明膠5.0 g，氯化鈉5.0 g，10%FeCl3l25 mL，調pH值7.0，115℃高壓滅菌15 min。

產(chǎn)氨培養(yǎng)基：脫脂牛奶100 mL，精氨酸0.5 g，氯化鈉0.5 g，115℃高壓滅菌15 min。

1.1.3試劑

蛋白胨、酪蛋白胨、酵母膏、牛肉膏（均為生化試劑）：北京陸橋技術有限責任公司；酒精、碘化汞、碘化鉀、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉等（均為分析純）：重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；中性紅、溴甲酚指示劑：沈陽市試劑三廠。

1.2儀器與設備

JM2003電子天平：余姚紀銘稱重校驗設備有限責任公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱：上海光都儀器設備有限公司；WFJ7200型可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-R40A型熱風恒溫鼓風干燥箱：上海試驗儀器總廠；100型筆式pH計：上海三信儀表廠；CJ-1D超凈工作臺：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌種活化

將菌種分別接入MRS液體培養(yǎng)基，菌株LLSL、LGG在37℃條件下培養(yǎng)，菌株LP在34℃培養(yǎng)，活化擴大培養(yǎng)，備用。用于發(fā)酵肉制品的發(fā)酵劑，菌種的活菌數(shù)均不得＜106CFU/g［10］，菌株LLSL傳代活化4次，菌株LGG、 LP傳代活化3次，培養(yǎng)24 h后其活菌數(shù)為108CFU/mL，＞106CFU/mL，表明3株益生菌均已復壯活化，達到發(fā)酵肉制品的要求。

1.3.2耐鹽、耐亞硝酸鹽試驗

在MRS液體培養(yǎng)基中分別添加質量分數(shù)為0、2%、4%、6%、8%的食鹽和質量濃度為0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的亞硝酸鹽，分別接種試驗菌株，菌株LLSL、LGG 37℃培養(yǎng)，菌株LP 34℃培養(yǎng)，48 h后，用分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm），以空白MRS液體培養(yǎng)基作為對照。

1.3.3產(chǎn)酸能力的測定

在MRS肉湯培養(yǎng)基中分別接種等量的乳酸菌，菌株LLSL、LGG在37℃條件下培養(yǎng)，菌株LP在34℃培養(yǎng)，每隔12 h測定肉湯培養(yǎng)基pH值，并測定48 h內pH值變化情況。

1.3.4產(chǎn)粘試驗

在MRS固體平板培養(yǎng)基上接種3株乳酸菌，菌株LLSL、LGG37℃培養(yǎng)（菌株LP34℃培養(yǎng)）48h，挑取菌落直接觀察。

1.3.5蛋白質降解活性試驗

將3株乳酸菌分別涂布于含有15%脫脂乳的MRS固體培養(yǎng)基中，恒溫37℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落周圍是否有透明圈，出現(xiàn)透明圈則為陽性。

1.3.6脂肪分解活性試驗

將3株乳酸菌分別涂布于含有15%豬油脂和中性紅指示劑的MRS固體培養(yǎng)基中，菌株LLSL、LGG 37℃培養(yǎng)（菌株LP 34℃培養(yǎng)）48 h。觀察培養(yǎng)基的顏色變化，培養(yǎng)基出現(xiàn)紅色斑點為陽性。

1.3.7產(chǎn)氣試驗

在葡萄糖產(chǎn)氣培養(yǎng)基中接種待測乳酸菌，菌株LLSL、LGG 37℃培養(yǎng)（菌株LP 34℃培養(yǎng)）24 h。觀察杜氏小管內是否有氣泡生成。

1.3.8產(chǎn)氨試驗

在產(chǎn)氨培養(yǎng)基中接種待測乳酸菌，另取未接種的培養(yǎng)基做空白對照試驗，菌株LLSL、LGG 37℃培養(yǎng)（菌株LP 34℃培養(yǎng)）24 h，加3～5滴氨試劑在培養(yǎng)液中，若有黃色或棕紅色的沉淀為陽性，否則為陰性。

1.3.9產(chǎn)H2S試驗

乳酸菌穿刺接種于產(chǎn)H2S培養(yǎng)基中，菌株LLSL、LGG 37℃培養(yǎng)（菌株LP 34℃培養(yǎng)）24 h。出現(xiàn)黑色沉淀線為陽性，反之為陰性。

1.3.10菌種間的拮抗試驗

將乳酸菌混合接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢，觀察菌株的生長情況。

1.3.11數(shù)據(jù)分析

采用Excel和DPS軟件進行分析，OriginPro9.0軟件制圖。

2　結果與分析

2.1菌株耐鹽能力的測定

肉制品加入食鹽不但具有調味作用，而且還有防腐、提高保水性等作用，不同食鹽添加量影響肉制品發(fā)酵過程中微生物的生長繁殖及最終產(chǎn)品的品質［11］。一般肉制品加工的食鹽質量分數(shù)在2%～2.5%，腌臘制品食鹽質量分數(shù)則在5%以上，發(fā)酵肉制品中的乳酸菌在一定范圍內要有良好的耐鹽性，耐鹽能力達到6%［12］。三株乳酸菌在不同食鹽質量分數(shù)條件下的OD600nm值見圖1。

圖1　不同食鹽質量分數(shù)對三株菌株生長的影響Fig.1 Effect of different salt concentrations on growth of three lactic acid bacteria

由圖1可知，食鹽對三種乳酸菌均有不同程度的影響。隨著食鹽含量升高，三株乳酸菌的OD600nm值均逐漸降低，當食鹽含量升高至8%時，三株乳酸仍能生長，菌株LLSL、LGG和LP的OD600nm值分別為0.680、0.621和0.512，分別下降了44.12%、48.16%和52.92%。結果表明，菌株LLSL的耐鹽性最強，其次是菌株LGG和LP，三株乳酸菌均有較好的耐鹽性，符合發(fā)酵肉制品發(fā)酵菌株的要求。

2.2耐亞硝酸鹽能力的測定

肉制品加入亞硝酸鹽，可抑制致病菌的生長，改善肉制品的色澤和風味。GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》規(guī)定肉制品中亞硝酸鹽的最大使用量為0.15 g/kg，最大殘留量為50 mg/kg。亞硝酸鹽的加入抑制發(fā)酵微生物的生長繁殖，影響正常發(fā)酵。三株乳酸菌在不同亞硝酸鹽質量濃度條件下的OD600nm值見圖2。

圖2　不同亞硝酸鹽質量濃度對三株菌株生長的影響Fig.2 Effects of different nitrite concentrations on growth of three lactic acid bacteria

由圖2可知，三株乳酸菌的OD600nm值隨著亞硝酸鹽的增加而減小，說明亞硝酸鹽對三株乳酸菌的生長均有不同程度的抑制作用。當添加的亞硝酸鹽質量濃度為150 mg/L時，菌株LLSL的OD600nm值由1.198下降至0.531，下降55.68%；菌株LGG的OD600nm值由1.217下降至0.877，下降27.94%；LP的OD600nm值由1.065下降至0.632，下降40.66%；結果表明，三株乳酸菌耐亞硝酸鹽能力為LGG＞LP＞LLSL，三株乳酸菌均能在亞硝酸鹽質量濃度為150 mg/L的培養(yǎng)基中存活，符合肉制品發(fā)酵菌株的要求。

2.3產(chǎn)酸能力的測定

產(chǎn)酸能力是篩選發(fā)酵菌種的一個重要指標。發(fā)酵菌種產(chǎn)酸速率越大，pH值下降越快，較低pH將抑制腐敗菌和病原菌的生長。三株乳酸菌的產(chǎn)酸能力見圖3。

圖3　三株乳酸菌48 h的產(chǎn)酸能力Fig.3 The acid production of three lactic acid bacteria in 48 h

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基pH值先迅速下降后趨于平緩，當培養(yǎng)12 h時，菌株LLSL、LP、LGG培養(yǎng)基pH值分別下降為5.01、4.84、4.32，菌株LGG培養(yǎng)基pH值下降速率最快；當培養(yǎng)時間為48 h時，菌株LLSL、LP和LGG培養(yǎng)基pH值分別為4.25、3.65和3.86。結果表明，三株乳酸菌均能有效產(chǎn)酸，且產(chǎn)酸速率為菌株LGG＞LP＞LLSL，菌株LP產(chǎn)酸能力較強，適用于發(fā)酵肉制品。

2.4三株乳酸菌的發(fā)酵特性

表1　三株乳酸菌的發(fā)酵特性Table 1 The fermentation characteristics of three lactic acid bacteria

乳酸菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)生粘液物質，將破壞肉內部組織狀態(tài)，影響其感官［13］；若加入的發(fā)酵劑具有脂肪降解的能力，則會造成成品在貯藏銷售過程中脂肪降解易產(chǎn)生酸敗味；若加入的發(fā)酵劑具有較強的蛋白質降解作用，在產(chǎn)品的貯藏銷售過程易造成腐敗現(xiàn)象，降低了產(chǎn)品的貨架期和微生物安全性［14］；異型發(fā)酵的乳酸菌作為肉制品發(fā)酵劑，將產(chǎn)生大量CO2氣體，影響肉結構的致密性；乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生NH3等不良氣體，影響肉制品的風味；產(chǎn)生H2S，影響產(chǎn)品的風味和色澤；三株乳酸菌的發(fā)酵特性見表1。

由表1可知，菌株LP、LLSL、LGG降解蛋白質、脂肪及產(chǎn)氣、產(chǎn)氨、產(chǎn)H2S特性均呈陰性，菌株LLSL、LP產(chǎn)粘為陰性，菌株LGG為陽性；表明三菌株均無降解蛋白質、脂肪的能力；均未產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S、產(chǎn)氨，菌株LLSL與LP不產(chǎn)粘，菌株LGG產(chǎn)粘。結果表明，菌株LP、LLSL符合發(fā)酵肉制品乳酸菌發(fā)酵劑各項基本要求，是理想的肉用乳酸菌種。據(jù)SUSANNAE等［15］報道，菌株LGG較適合發(fā)酵干香腸。但本研究將菌株LGG接種于冷鮮調理肉制品進行發(fā)酵，探索該菌株是否適宜冷鮮調理肉的發(fā)酵菌株，結果表明，肉的表面產(chǎn)生大量粘液，影響冷鮮調理肉制品的感官和內部組織狀態(tài)，故菌株LGG不適宜用于冷鮮調理肉制品的發(fā)酵菌株。

2.5菌種的拮抗性研究

從對產(chǎn)品的風味和狀態(tài)的影響上來看，兩種或兩種以上菌種混合發(fā)酵，比使用單一發(fā)酵劑有更好的效果。這就要求混合發(fā)酵的菌種間要有較好的共生作用，而不能有顯著的拮抗性。根據(jù)上述試驗的初步結果，研究針對菌株LP和LLSL的拮抗性進行試驗，結果見表2。

表2　菌株LP與LLSL拮抗作用試驗結果Table 2 Test results of antagonism between strains LP and LLSL CFU/mL

由表2可知，培養(yǎng)12 h后，混合菌液的菌落總數(shù)為單一培養(yǎng)菌株LP的15倍、菌株LLSL的13.2倍；18 h后，混合菌液的菌落總數(shù)為菌株LP的3.48倍，為菌株LLSL的2.23倍；24 h后，混合菌液的菌落總數(shù)為菌株LP的2.25倍，為菌株LLSL的3.09倍。結果表明，菌株LP與LLSL在同一環(huán)境中生長繁殖良好，無顯著的拮抗作用，菌株LP與LLSL可作為冷鮮調理肉的混合發(fā)酵劑。

3　結論

本研究通過對三株乳酸菌進行生長能力、耐鹽性、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)酸能力、發(fā)酵特性等進行研究。結果表明，三株乳酸菌均有較好的耐鹽性，在食鹽含量為8%的條件下仍能生長，對質量分數(shù)為150 mg/L的亞硝酸鹽具有一定的耐受作用，能有效產(chǎn)酸，無降解蛋白質、脂肪能力，不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)NH3，符合發(fā)酵肉制品乳酸菌發(fā)酵劑的要求。菌株LLSL與LP不產(chǎn)粘，且通過菌種間拮抗作用研究表明，菌株LLSL與LP兩菌株之間無明顯拮抗作用，可作為冷鮮調理肉的復合發(fā)酵劑，其在冷鮮調理肉中的應用有待進一步研究；而菌株LGG產(chǎn)粘，不適宜用于冷鮮調理肉制品的發(fā)酵菌株。

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Screening of three lactic acid bacteria starter cultures in fermented chilled and prepared meat

ZHANG Fei，LIU Zhe，LUO Aiping*
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to screen high-quality lactic acid bacteria starter cultures adapted to fermented chilled and prepared meat products，the fermentation characteristics of three lactic acid bacteria were researched and screened by the experiments of salt tolerance，nitrite tolerance，viscosity producing，acid-producing ability，the ability to protein and fat decomposition and the antagonism between strains.The results showed that strain LLSL，LP and LGG all had good tolerance on salt and nitrite，could survive in 6%salt and 150 mg/L nitrite solution，had ability of acid production effectively.They did not decompose protein and fat and produce gas，ammonia and H2S.Strain LLSL and LP which did not produce mucilage and had no antagonism were used as starter culture of chilled and prepared meat products.Strain LGG could produce mucilage to influence the sensory quality and internal texture，which was not suitable for starter culture of chilled and prepared meat products.

Lactococcus lactissubsp.Lactis；Lactobacillus plantarum；Lactobacillus rhamnosus；screen；starter cultures

TS255

0254-5071（2016）03-0104-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.023

2015-12-08

貴州省科技廳攻關課題（黔科合NZ字［2012］3010號）

張飛（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)與質量安全。

羅愛平（1958-），女，教授，本科，主要從事畜產(chǎn)品加工與開發(fā)工作。