高效液相色譜法測定辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)

孫勝枚

（廣東省江門市李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529100）

高效液相色譜法測定辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)

孫勝枚

（廣東省江門市李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529100）

該研究采用了高效液相色譜法對辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)進行檢測，并對其提取條件和檢測方法進行了研究。以乙醇∶水= 70∶30（V∶V）作為提取液，采用直接萃取法提取樣品中的辣椒素和二氫辣椒素，以0.3%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（62：38，V：V）為流動相，檢測波長230 nm，Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離。結(jié)果表明，辣椒素和二氫辣椒素在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍線性關(guān)系良好（R12=0.999 8，R22=0.999 9），檢出限為0.001 g/kg，加標回收率分別為93%～104%和86%～103%，相對標準偏差RSD＜5%。該方法操作簡單、快速，具有良好的準確性和精密度，可有效排除香辛料物質(zhì)的雜峰干擾，適合各類辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)的檢測。

高效液相色譜；辣椒素類物質(zhì)；測定

日常所食用的辣椒制品中的辣味主要來源于辣椒當中的辣椒素類物質(zhì)。辣椒素類物質(zhì)主要包含有以下5種：辣椒素（capsaicin，CAP）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin，DCAP）、高辣椒素（homocapsaicin）、高二氫辣椒素（homodihydrocapsaicin）、降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）［1-2］。其中辣椒類制品辣感的主要來源是辣椒素和二氫辣椒素，占辣椒素類物質(zhì)總含量90%以上［3］，因此這兩種辣椒素類物質(zhì)也是辣味水平研究的主要對象［4-5］。

目前對于辣椒素類物質(zhì)含量的檢測主要方法有：比色法、薄層色譜法、紫外分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［6-9］。其中高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。國家標準GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測定及辣度表示方法》中所采用的方法也是采用高效液相色譜法。

國標方法中選取的提取液是甲醇-四氫呋喃溶液。而甲醇［10］、四氫呋喃［11］的毒性較大，對操作人員有一定的健康危害。本研究發(fā)現(xiàn)采作低毒的乙醇-純水溶液同樣可達到有效提取辣椒素和二氫辣椒素的效果，同時減少了對操作人員的危害，在實際應(yīng)用中更為合適。

為了提高各類辣椒制品的辣椒素類物質(zhì)檢測方法的準確性，本研究對高效液相色譜條件進行了研究。根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點，調(diào)整色譜流動相極性，有效地排除香辛料對辣椒素和二氫辣椒素的雜峰干擾，使雜峰與目標峰有效分離。定量更準確，進一步優(yōu)化了高效液相色譜法測定辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)的方法。

1　材料與方法

1.1試劑與樣品

辣椒油、咸紅望都辣椒胚、涮涮辣辣椒干、20目辣椒粉、桂林辣椒醬、涮涮辣特辣醬、四川風味麻辣醬、麻辣醬、花椒辣油：市售。

乙醇、丙酮、磷酸二氫鉀（分析純）：廣州化學試劑廠；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；辣椒素（純度≥95%）、二氫辣椒素（純度≥90%）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Macherey-NagelNucleosil120-5C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；0.2 μm微孔濾膜過濾器（尼龍66）：天津津騰實驗設(shè)備有限公司；BS224S電子天平：德國賽多利斯集團；S300H超聲波清洗器：德國Elma公司；Synergy純水機：德國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

分別精密稱取0.050 0 g辣椒素標準品和二氫辣椒素標準品，經(jīng)乙醇溶解后定容至50 mL，作為標準貯備液（辣椒素和二氫辣椒素的質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL）。以標準貯備液為基礎(chǔ)，分別吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL標準貯備液至50 mL容量瓶中，并用乙醇［12-13］定容，分別配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100 μg/mL的辣椒素和二氫辣椒素標準溶液，待HPLC進樣檢測分析。

以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線。辣椒素、二氫辣椒素的標準曲線線性回歸方程分別為y1=10.4428x1+0.0293（R12=0.9998）、y2=8.5614x2+0.0129（R22=0.999 9），均在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，辣椒素、二氫辣椒素的檢出限為0.001 g/kg。

1.3.2樣品前處理條件

（1）干椒樣品/新鮮辣椒

用粉碎機把辣椒樣品粉碎、研磨后，精確稱取2.000 0 g干椒樣品（或新鮮辣椒20.000 0 g）于100 mL的容量瓶中，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容，用力搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩。用0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液收集于2 mL的樣品瓶，待HPLC分析。

（2）含油脂類辣椒樣品

用攪拌器將油脂類辣椒樣品攪拌均勻，精確稱取2.000 0 g樣品于100 mL的容量瓶中，加入5 mL丙酮［14］，并搖勻，使油性物質(zhì)被完全溶解在丙酮中。分3次加乙醇∶水= 70∶30（V/V）的溶液，每次加3～5 mL，并搖勻，使油性物質(zhì)溶解在乙醇水溶液中，再用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液定容，并搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩，用0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液收集于2 mL的樣品瓶，待HPLC分析。

1.3.3色譜條件

色譜條件：Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30℃，流動相：0.3%磷酸二氫鉀水溶液-乙腈（62∶38，V/V），流速：1.4 mL/min，檢測波長：230 nm，進樣量：10 μL，運行時間：45 min。

1.3.4定性定量方法

分別吸取相應(yīng)濃度的標準溶液及樣品提取液10 μL注入高效液相色譜儀，以1.3.3的色譜條件進行分析。用辣椒素、二氫辣椒素標準物質(zhì)的保留時間定性，用外標多點校準法，以峰面積定量。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇

國標方法中選擇的檢測波長為280 nm。在紫外光范圍內(nèi)，對辣椒素及二氫辣椒素標準溶液進行紫外全波長掃描光譜分析，得出230nm波長具有最大吸收波長，且230nm比280 nm的吸收峰值高且峰型平緩，且230 nm檢測波長更靈敏、更穩(wěn)定。因此本研究選用了230 nm作為檢測波長。

2.1.2色譜流動相的選擇

國標檢測方法所用的流動相是甲醇∶純水=65∶35（V/V），本研究在檢測含量香辛料的辣椒制品時，根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點，調(diào)整色譜流動相為0.3%磷酸二氫鉀溶液∶乙腈=62∶38（V/V），能有效地排除對辣椒素和二氫辣椒素的出峰干擾，使雜峰與目標峰有效分離，使定量更準確，進一步優(yōu)化了高效液相色譜法測定辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)的方法。

在此優(yōu)化的色譜條件下，采用HPLC法對標準品和三種辣椒樣品進行檢測，標準品和三種辣椒樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1　標準品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standard substance（A）and the sample（B）

由圖1可知，辣椒素及二氫辣椒素標準品的出峰時間分別是16.477 min和25.414 min。樣品中辣椒素和二氫辣椒素的出峰時間16.631 min和25.251 min，通過與標準的色譜圖對照，樣品中的待測組分與標準品的色譜圖匹配性良好，對于含較多香辛料的辣椒制品（a-麻辣醬，b-花椒辣油，c-四川風味麻辣醬），雜峰與目標峰已完全分開，滿足分析檢測要求。

2.2烘干步驟必要性的選擇

國標方法中針對新鮮辣椒或含水量＞15%的辣椒制品，必須用烘箱在50℃烘至含水量≤15%。但實際上，對于部分含水量＞15%的辣椒制品，也含有較多的油分。對于這些樣品，由于油分的存在，使得樣品不容易烘干，烘干時間較難把握，有的會長達7～8 h。因此，為驗證烘干步驟在前處理中的必要性，本研究對含水量＞15%的辣椒制品進行50℃烘干處理，直至樣品含水量≤15%。最后采用HPLC法進行檢測，并與未烘干處理樣品進行比較，結(jié)果見表1。

由表1可知，比較3種基質(zhì)樣品經(jīng)烘干處理后的結(jié)果與未經(jīng)烘干處理的結(jié)果，可以看出對于同一樣品，是否經(jīng)烘干處理，其最終的辣椒素類物質(zhì)結(jié)果基本一致。樣品中的水分對于辣椒素類物質(zhì)檢測結(jié)果基本無影響，可省去烘干這個過程，從而大大節(jié)省檢測時間，提高分析效率。

表1　烘干與未烘干處理樣品中辣椒素類物質(zhì)含量的比較Table 1 Comparison of the content of capsaicinoids in dried and undried samples

2.3樣品提取條件的選擇

2.3.1提取溶劑的選擇

結(jié)合辣椒素及二氫辣椒素的化學特性，針對不同的辣椒樣品，進行了提取溶劑的選擇試驗［2-5，15］。試驗選取了甲醇、乙醇、乙醇-水（70∶30，V/V）溶液和四氫呋喃-甲醇（1∶1，V/V）混合溶液4種不同的提取溶劑提取各樣品中的辣椒素類物質(zhì)，并進行檢測，結(jié)果如表2所示。

表2　提取溶劑對辣椒素類物質(zhì)提取效果的影響Table 2 Effect of extraction solvents on extraction capsaicinoids

由表2可知，4種提取液中，乙醇的提取效率最低，而其余3種提取液的提取效率比較接近。對于辣椒油、辣椒干和辣椒粉，使用乙醇-水溶液作提取液，其提取效率比四氫呋喃-甲醇的稍好。而乙醇的毒性遠低于甲醇、四氫呋喃，價格也比較便宜，因此，選取乙醇∶水=70∶30（V/V）作為提取溶劑。

2.3.2提取方式的選擇

在充分的粉碎和均質(zhì)樣品后，采用直接浸提萃取和超聲萃取。直接浸提萃?。褐苯臃Q樣于100 mL容量瓶，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容至刻度，搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩搖勻。超聲萃?。?-2，10］：稱樣于100 mL燒杯中，加入25mLV乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液，用保鮮膜封口，在保鮮膜上用針扎幾個小孔，60℃水浴超聲提取30 min，把濾液收集于100 mL容量瓶，重復(fù)以上提取2次，合并提取液，用乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液定容至刻度。采用HPLC法對兩種提取方法所獲得的提取液進行辣椒素類物質(zhì)的檢測，結(jié)果如表3所示。

表3　提取方式對辣椒素類物質(zhì)提取效果的影響Table 3 Effect of extraction methods on extraction capsaicinoids

由表3可知，超聲萃取方法的中間轉(zhuǎn)移步驟較多，容易造成最終辣椒素類物質(zhì)結(jié)果的定量損失，直接浸提萃取與超聲萃取相比，萃取效果較好，且操作更為簡單，可節(jié)省大量提取時間。

2.4加標回收率試驗

按照上述樣品前處理方法和色譜分析條件進行分析，分別取辣椒樣品，添加0.049 g/kg、0.098 g/kg、0.147 g/kg三個質(zhì)量濃度的辣椒素標準溶液和0.051 g/kg、0.102 g/kg、0.153g/kg的二氫辣椒素標準溶液，進行了加標回收率試驗，試驗結(jié)果見表4。

表4　辣椒樣品中辣椒素和二氫辣椒素的加標回收率Table 4 Adding standard recovery rate of capsaicine and dihydrocapsaicin in capsicum samples

由表4可知，辣椒素和二氫辣椒素的加標回收率分別為93%～104%和86%～103%，說明該方法準確性好，能滿足辣椒樣品中辣椒素和二氫辣椒素的分析要求。

2.5精密度試驗

取同一批四川風味麻辣醬樣品共6份，按照上述測定方法對樣品中辣椒素和二氫辣椒素的含量進行精密度試驗。結(jié)果表明，辣椒素的含量分別為0.092g/kg、0.089g/kg、0.091 g/kg、0.093 g/kg、0.090 g/kg、0.094 g/kg，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.04%；二氫辣椒素的含量分別為0.033 g/kg、0.031 g/kg、0.032 g/kg、0.034 g/kg、0.033g/kg、0.032g/kg，RSD為3.23%。表明此方法精密度良好。

3　結(jié)論

本研究針對辣椒制品的特點，采用了高效液相色譜法對辣椒制品中的辣椒素和二氫辣椒素進行檢測，并對提取條件和檢測方法進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用毒性低、價格便宜的試劑乙醇-水（70∶30，V/V）溶液作為提取液，在樣品充分粉碎均質(zhì)的前提下，采用更為簡便有效的直接浸提萃取的方式，大大縮短提取時間。研究表明，對于水分含量＞15%的鮮辣椒或辣椒制品，樣品中的水分不會影響辣椒素和二氫辣椒素的定量檢測，可省去烘干這個過程，提高了分析效率。根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點，調(diào)整色譜流動相極性，選用0.3%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（62∶38，V∶V）為流動相，檢測波長230 nm，能有效地排除香辛料雜峰對辣椒素和二氫辣椒素的干擾，使雜峰與目標峰有效分離，使定量更準確，進一步優(yōu)化了高效液相色譜法測定辣椒制品中的辣椒素類物質(zhì)的方法。

辣椒素和二氫辣椒素加標回收率分別在93%～104%和86%～103%之間，精密度試驗結(jié)果相對標準偏差RSD＜5%。改良后的方法更為簡便、高效、準確，適合各類辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)的批量檢測，值得推廣。

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Determination of capsaicinoids in capsicum products by HPLC

SUN Shengmei
（Lee Kum Kee（Xin Hui）Food Co.，Ltd.，Jiangmen 529100，China）

The capsaicinoids in capsicum products was detected by HPLC，and the extraction conditions and detection method were researched.Using ethyl alcohol：water=70：30（V：V）as extracting solution，the capsaicin and dihydro capsaicin were extracted by direct extraction method，and separated by Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），using the 0.3%monopotassium phosphate solution-acetonitrile（62：38，V：V）as mobile phase and the detection wavelength of 230 nm.The results showed that the linear relationship of capsaicin and dihydro capsaicin were good in the range of 20-100 μg/ml（R=0.999 8，R=0.999 9），the limit of detection was 0.001 g/kg，and the recovery rate of capsaicin and dihydro capsaicin were 93%-104%and 86%-103%，respectively.The relative standard deviation was less than 5%.The proposed method was simple，fast，with good accuracy and precision.The method can eliminate the impurity peak interference of spices materials effectively，and it was suitable for determination of capsaicinoids in all kinds of capsicum products.

HPLC；capsaicinoids；determination

TS262.5

0254-5071（2016）03-0148-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.034

2015-12-23

孫勝枚（1964-），女，高級工程師，本科，研究方向為質(zhì)量管理和法規(guī)標準。