植物乳桿菌對(duì)獼猴桃酒降酸效果的研究

李　靜,樊明濤,孫慧燁

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

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植物乳桿菌對(duì)獼猴桃酒降酸效果的研究

李靜,樊明濤,孫慧燁

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

本研究旨在通過植物乳桿菌和酒類酒球菌引發(fā)獼猴桃酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵,篩選出獼猴桃果酒的后發(fā)酵的適宜菌株。實(shí)驗(yàn)選用植物乳桿菌CS-1、XJA-2、XJ-14、XJ-25、520、542、544以及酒類酒球菌31MBR八株菌對(duì)自釀獼猴桃酒進(jìn)行降酸。通過單因素實(shí)驗(yàn)以及中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)篩選最佳的獼猴桃酒后發(fā)酵菌株并優(yōu)化其降酸條件。結(jié)果表明植物乳桿菌520在酒中生長(zhǎng)快速,降酸效果最佳。所得最佳條件為:接種量6.7%,pH3.5,溫度21.6 ℃。在該條件下驗(yàn)證得到蘋果酸的降酸率為63.89%,因此可以有效降低獼猴桃果酒酸度,故植物乳桿菌520可作為新一代獼猴桃酒降酸的潛在菌株。

獼猴桃酒,植物乳桿菌,降酸

獼猴桃又稱“奇異果”,富含VC,被譽(yù)為“水果之王”,且含有豐富的可溶性膳食纖維,具有較強(qiáng)的抗氧化性能[1]。獼猴桃酒是其深加工產(chǎn)業(yè)的重要產(chǎn)品之一[2]。它的釀制過程同其他果酒釀造過程基本相同[3],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。但目前獼猴桃果酒市場(chǎng)占有率較低,究其原因主要是獼猴桃酒酸度過高,口感尖酸、銳利,不能滿足消費(fèi)者感官的需求,因而獼猴桃酒的降酸問題成為限制獼猴桃果酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)難題[4]。

果酒經(jīng)過后發(fā)酵可使其口感更加圓潤(rùn)、細(xì)膩,提高果酒的品質(zhì)[5]。利用后發(fā)酵過程,接入可引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵的適宜菌株,有效降低獼猴桃酒的酸度[6-7]。葡萄酒中進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的商業(yè)化菌株主要是酒類酒球菌[8],然而酒類酒球菌生長(zhǎng)緩慢,作用效果遲緩,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。已有研究證實(shí),植物乳桿菌可在嚴(yán)苛的釀酒環(huán)境中生存,通過蘋果酸乳酸發(fā)酵降低果酒酸度,故可以作為MLF發(fā)酵的潛在菌株[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)選取四株分離自果酒的菌株:植物乳桿菌CS-1、XJA-2、XJ-14、XJ-25和三株分離自泡菜中的植物乳桿菌520、542、544,接入獼猴桃鮮酒,引發(fā)MLF發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵后的蘋果酸含量,旨在篩選出適宜菌株并得到最優(yōu)的發(fā)酵條件,為獼猴桃酒的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌CS-1、XJ-14、XJ-25、XJA-2(從葡萄酒中分離)西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院提供。-80 ℃保存的植物乳桿菌活化至第二代后,以2%接種量接種至MRS培養(yǎng)基中,37 ℃溫度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期(12～16 h)備用;植物乳桿菌520,542,544(從泡菜中分離)本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存;酒類酒球菌31MBR為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉4 g/L,蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,乙酸鈉5 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,檸檬酸銨2 g/L,吐溫80 mL/L,用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.2～6.4,121 ℃滅菌20 min。

ATB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,葡萄糖10 g/L,MnSO4·4H2O 0.05 g/L,鹽酸半胱氨酸0.5 g/L,實(shí)驗(yàn)室自制番茄汁250 mL/L,pH調(diào)至4.8,121 ℃滅菌20 min。

獼猴桃鮮酒:實(shí)驗(yàn)室自釀[12](秦美獼猴桃,購自陜西省咸陽市楊凌區(qū)夏家村獼猴桃園)

蘋果酸標(biāo)樣:購自阿拉丁試劑公司;酵母(excellence SP):購自yakult公司;果膠酶(Mcerozyme R-10):購自Lamothe abiet公司;亞硫酸:購自西隴化工股份有限公司。

DH-420A電熱恒溫培養(yǎng)箱北京科偉永興儀器有限公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司;pH計(jì)上海雷磁儀器廠;UV-1700紫外可見分光光度儀SHIMADZU公司;LC-10AVPPLUS高效液相色譜儀日本島津公司;TRACE ISQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2獼猴桃酒的釀造

成熟度適宜的獼猴桃果實(shí)打漿后經(jīng)果膠酶處理24 h后,接入釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵,酒精發(fā)酵完成后進(jìn)行倒罐,直至果酒澄清且瓶底無沉淀物。接入實(shí)驗(yàn)菌株引發(fā)果酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵,至果酒中蘋果酸含量恒定后倒罐,至澄清即得到獼猴桃果酒的成品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1獼猴桃果酒理化指標(biāo)的測(cè)定pH的測(cè)定:用pHS-3C雷磁pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定;總酸(以酒石酸計(jì))測(cè)定:酸堿滴定法(GB/T 15038-1994);可溶性固形物(TSS)測(cè)定:用手持折光儀測(cè)定;總還原力:參照Oyalzu(1986)方法進(jìn)行測(cè)定[13];總酚含量測(cè)定:福林-酚(Folin-Ciocaheus)法;酒精度測(cè)定:酒精計(jì)測(cè)定。

1.3.2單因素實(shí)驗(yàn)菌株篩選實(shí)驗(yàn)選用7株植物乳桿菌和酒類酒球菌 31MBR在室溫條件下,以獼猴桃鮮酒體積為基準(zhǔn)接入6%(v/v)的菌株(108cfu/mL)[14],定期取樣HPLC法測(cè)定蘋果酸含量至蘋果酸含量恒定。計(jì)算各菌株對(duì)獼猴桃酒的蘋果酸降酸率。

各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)降酸效果的影響以獼猴桃酒中蘋果酸含量為響應(yīng)指標(biāo),經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定環(huán)境溫度、接種量和初始pH對(duì)響應(yīng)值影響顯著。在其他因素水平不變的條件下,單因素實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定溫度為14、18、22、26、30 ℃,接種量為2、4、6、8、10(v/v),初始pH為3、3.2、3.4、3.6、4.0時(shí)的降酸率。

1.3.3中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD,Central Composite Design)以獼猴桃酒中蘋果酸含量的降酸率作為響應(yīng)值,選取單因素實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)點(diǎn)為中心水平,進(jìn)行中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]。

1.3.4HPLC法測(cè)定蘋果酸含量色譜柱:Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm);柱溫:40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm,二極管陣列檢測(cè)器;流動(dòng)相:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01的磷酸氫二鉀溶液(去離子水配制),用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.9,流速:0.6 mL/min。

1.3.5蘋果酸降酸率的計(jì)算降酸率(%)=(1-C/C0)×100

C-植物乳桿菌降酸處理后,獼猴桃酒殘余蘋果酸含量(以蘋果酸計(jì)),mg/L;C0-空白組,即未經(jīng)后發(fā)酵的獼猴桃酒中蘋果酸含量,mg/L。

1.6.5數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Design export 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果進(jìn)行多元二次模型方程的建立以及方差分析,并利用響應(yīng)面方法得到各個(gè)因素的最優(yōu)水平。二次旋轉(zhuǎn)中心實(shí)驗(yàn)的因素水平(如表1)。

表1　二次旋轉(zhuǎn)中心實(shí)驗(yàn)因素水平

2　結(jié)果分析

2.1獼猴桃酒的理化指標(biāo)

獼猴桃汁經(jīng)酒精發(fā)酵得到鮮酒,鮮酒(1 ℃)經(jīng)倒罐并澄清至瓶底無沉淀物,即為實(shí)驗(yàn)組獼猴桃酒。獼猴桃酒在陳釀的過程中,還原力較為穩(wěn)定,但多酚等具有抗氧化能力的物質(zhì)被氧化,或者分解為不具有抗氧化能力或者該能力較弱的單酚,故測(cè)得總酚含量(沒食子酸當(dāng)量)變小。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1獼猴桃鮮酒中不同植物乳桿菌降酸效果計(jì)算得到實(shí)驗(yàn)菌株的蘋果酸降酸率(如圖1)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)菌株都具有一定的降酸能力,而植物乳桿菌520能力較強(qiáng),可將獼猴桃鮮酒中53.22%的蘋果酸降解,比酒類酒球菌31MBR的降酸率高出3.28%。而降酸最弱的菌株為植物如柑橘CS-1,降酸率僅達(dá)到36.16%。實(shí)驗(yàn)得出酒類酒球菌31MBR的蘋果酸降酸率為49.94%,低于相關(guān)研究中的處理結(jié)果,原因是獼猴桃鮮酒的酸度較高,初始pH僅為3.19,在該過酸條件下,酒類酒球菌不能十分高效的引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵。植物乳桿菌520在獼猴桃酒中降酸效率較高,能較顯著改善獼猴桃果酒的口感和品質(zhì)。

表2　獼猴桃酒的基礎(chǔ)理化指標(biāo)

圖1　不同植物乳桿菌在獼猴桃鮮酒中的蘋果酸降酸率Fig.1　The deacidification of different Lactobacillus plantarum in kiwifruit wine

2.2.2各因素對(duì)降酸效果的影響環(huán)境溫度、初始pH和植物乳桿菌接種量三個(gè)因素對(duì)于MLF發(fā)酵的作用較為顯著(如圖2所示)。由圖2a所示,隨著植物乳桿菌接種量的增大,蘋果酸降酸率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì),蘋果酸降酸率在植物乳桿菌的接種量為6%時(shí)達(dá)到最大。接種量為6%～8%時(shí),蘋果酸降酸率基本保持不變,接種量繼續(xù)增大則蘋果酸降酸率有輕微下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎诮?jīng)酒精發(fā)酵,獼猴桃果酒中殘留的營(yíng)養(yǎng)素含量有限,接種量過大在MLF前期可有效促進(jìn)菌株量迅速增大,但到了發(fā)酵后期果酒不能供給單位體積生物量足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15],導(dǎo)致菌株大量死亡,發(fā)酵周期縮短反而不利于菌株的增殖。圖2b顯示環(huán)境溫度升高至22 ℃時(shí),蘋果酸降酸率達(dá)最大,隨著溫度繼續(xù)升高蘋果酸降酸率呈下降趨勢(shì)。植物乳桿菌對(duì)溫度具有較明顯的敏感性。如圖2c所示,菌株在pH 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8時(shí)均能夠生長(zhǎng),但隨著初始pH的增大蘋果酸降酸率呈現(xiàn)出先增大后減少的趨勢(shì),且初始pH為3.4時(shí)降酸率達(dá)最大。

圖2　MLF的初始條件對(duì)于蘋果酸降酸率的影響Fig.2　The influence of different initial factors to the rate of deacification for malic acid of kiwifruit wine

2.2二次旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)中心組合旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),選定環(huán)境溫度、pH和菌株接種量的中心值為22 ℃、3.4和6%進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以蘋果酸降酸率作為響應(yīng)值,得到植物乳桿菌降酸效果最優(yōu)時(shí)的因素水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3　二次旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)二次旋轉(zhuǎn)中心實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),其結(jié)果如表5和表6所示。從回歸模型的方差分析可以看出,回歸方程的失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),可推斷出選用的二次方程模型是適合的?；貧w方程的顯著性檢驗(yàn)得到該模型具有顯著性(p<0.01),可說明該模型的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值較為吻合,故該模型成立。

表5　回歸模型的方差分析

響應(yīng)面分析所得的因子變化與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的相互作用真實(shí)可靠。經(jīng)回歸擬合之后,實(shí)驗(yàn)因子對(duì)于響應(yīng)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系可用二次回歸方程表示。

Y=58.28+2.14A+3.36B+0.62C+4.99AB-5.41AC-0.82BC-5.28A2-6.24B2-3.83C2

在α=0.05的顯著水平下,剔除不顯著項(xiàng)之后,二次回歸方程可簡(jiǎn)化為

Y=58.28+2.14A+3.36B+4.99AB-5.41041AC-5.28A2-6.24B2-3.83C2

簡(jiǎn)化所得二次回歸模型是顯著的,回歸方程與實(shí)測(cè)值擬合較好。進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行偏相關(guān)t檢驗(yàn),得到各項(xiàng)均在α=0.05的顯著水平上顯著(p<0.05),故剔除不顯著因素后實(shí)驗(yàn)所選取因素(初始pH和接種量)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均影響顯著。

構(gòu)建蘋果酸降酸率與環(huán)境溫度、初始pH和接種量的三維空間響應(yīng)面圖,各因素之間的交互作用如圖3～圖5所示。

圖3　接種量和初始pH對(duì)蘋果酸降酸率的響應(yīng)面圖Fig.3　Response surface of inoculum size and initial pH on the deacification rate of malic acid

圖4　接種量和溫度對(duì)蘋果酸降酸率的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface of inoculum size and temperature on the deacification rate of malic acid

圖5　初始pH和溫度對(duì)蘋果酸降酸率的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface of initial pH and temperature on the deacification rate of malic acid

回歸方程所作的響應(yīng)面立體分析圖3～圖5,分別反映了接種量、起始pH、溫度這3個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。因擬合所得方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,故其所表征的拋物面開口向下,具有極大值點(diǎn)。利用Design Expert 7.0軟件,計(jì)算分析得到,植物乳桿菌接種量為6.7%,pH3.5,溫度為21.6 ℃時(shí)蘋果酸降酸率最大,且軟件預(yù)測(cè)中心點(diǎn)對(duì)應(yīng)響應(yīng)值為64.57%。

2.3主因子效應(yīng)分析

由方差分析以及優(yōu)化得到的回歸方程可知接種量(A)、pH(B)會(huì)對(duì)響應(yīng)值蘋果酸降酸率有顯著影響(p<0.05),而溫度(C)對(duì)蘋果酸降酸率影響不顯著(p>0.05),且歸方程的一次系數(shù)B>A,即三因素對(duì)于響應(yīng)值的影響:pH>接種量>溫度,結(jié)果與對(duì)獼猴桃酒總體品質(zhì)研究[2]的結(jié)果一致。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design Export 7.0 優(yōu)化得到的最適條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(6個(gè)平行組),HPLC法測(cè)定獼猴桃酒經(jīng)過植物乳桿菌520進(jìn)行MLF發(fā)酵獼猴桃酒的蘋果酸減少量,經(jīng)計(jì)算得蘋果酸降酸率的平均值為63.89%,與模型的預(yù)測(cè)值64.57%較為接近。

2.5討論

獼猴桃果酒的微生物降酸主要通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵實(shí)現(xiàn),蘋果酸乳酸酶是乳酸菌進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的關(guān)鍵酶。實(shí)驗(yàn)菌株接入獼猴桃鮮酒,菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力不同,導(dǎo)致其生長(zhǎng)狀況存在差異,同時(shí)蘋果酸乳酸酶(MLE)的分泌量和活力也不同[16]。菌株達(dá)到穩(wěn)定期后,因適應(yīng)能力的差異導(dǎo)致菌株穩(wěn)定期長(zhǎng)短和分泌蘋果酸乳酸酶量和活力具有明顯差異,故導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)獼猴桃酒的降酸效果不同,需篩選出適宜獼猴桃酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵的菌株。

環(huán)境溫度和初始pH對(duì)植物乳桿菌的作用包括菌株的生長(zhǎng)狀況和菌株的產(chǎn)酶特性兩個(gè)方面,因而控制該因素變化可得到降酸效果最優(yōu)的條件。理論上講,初始pH越高,則蘋果酸乳酸酶的活力則越強(qiáng),但是化學(xué)方法調(diào)節(jié)pH會(huì)破壞酒體的微生物穩(wěn)定性,故實(shí)驗(yàn)結(jié)果中實(shí)驗(yàn)菌株的的降酸能力并未隨pH的增大而一直增大。環(huán)境溫度較低時(shí),菌株生長(zhǎng)受到抑制,因而產(chǎn)酶量和酶活力都較低,導(dǎo)致降酸效果不理想。隨著溫度升高,酶活力升高,但是果酒環(huán)境中實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)可能會(huì)受到抑制。經(jīng)實(shí)驗(yàn)降酸效果最優(yōu)時(shí)的環(huán)境溫度和初始pH分別為21.6 ℃,pH3.5。

綜上,植物乳桿菌的產(chǎn)酶活性和產(chǎn)酶量會(huì)受到環(huán)境影響,且菌株的生長(zhǎng)狀況及酒體的微生物穩(wěn)定性都可能在一定程度影響微生物降酸的效果和風(fēng)味[17]。但考慮到蘋果酸乳酸酶是誘導(dǎo)酶[18],通過改良環(huán)境因素可能使菌株產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶活性可得到一定的增加。關(guān)于增加果酒中菌株的產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶活性的途徑,有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)七株不同來源的植物乳桿菌進(jìn)行獼猴桃酒的降酸效果不同,篩選出植物乳桿菌520在獼猴桃酒中降酸效果最優(yōu)。單因素實(shí)驗(yàn)和中心旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)得到在植物乳桿菌接種量為6.7%,pH3.5,溫度為21.6 ℃該條件下,蘋果酸消耗率的平均值為63.89%,降酸效果得到有效提高。

故分離自泡菜的植物乳桿菌520接入獼猴桃酒,引發(fā)蘋果酸乳酸發(fā)酵可以有效降低獼猴桃酒的蘋果酸含量、改善其口感,是一株具有商業(yè)化潛力的獼猴桃果酒生物降酸菌株。

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Effect ofLactobacillusPlantarumon the Deacification of Kiwifruit Wine

LI Jing,FAN Ming-tao,SUN Hui-Ye

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The aim of this study was to investigate the secondary fermentation of kiwifruit wine inducted byLactobacillusplantarumandOenococcusoeniso as to screen the starter cultures for malolactic fermentation(MLF)by comparing the deacidification. 7 different isolates ofLactobacillusplantarum(CS-1,XJA-2,XJ-14,XJ-25,520,542,and 544)andO.oeni31MBR associated with the MLF were used in the study. By conducting single factors and central composite design(CCD),the suitable levels were screened out for MLF. According to rate of deacidification for malic acid,L.plantarum520 was a considerable strain for kiwifruit wine,and the centre point were 6.7 percent for inoculum size and pH3.5 at 21.6 ℃. Under this optimized condition,the rate of deacidification for malic acid achieved 63.89 percent. All these characteristics,together with their ability to conduct MLF,makingL.plantarum520 suitable for a new generation of MLF starter cultures to reduce the acidity and improve the flavor of kiwifruit wine.

kiwifruit wine;Lactobacillusplantarum;deacidification

2015-05-15

李靜(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵研究,E-mail:

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)-園藝作物產(chǎn)品加工副產(chǎn)物綜合利用(201503142)；西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目-冷凍濃縮技術(shù)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)葡萄酒和低醇獼猴桃酒的試驗(yàn)研究(NC1318)。

TS261.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000