急性缺糖缺氧通過增強(qiáng)膽堿酯酶表達(dá)促進(jìn)腎小管細(xì)胞的炎性損傷

吳明，吳樂鋒，李明利，陸俊福，賴凱，徐跡，劉芬，馮永文

（1、深圳市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東　深圳　5108035；2、深圳市第二人民醫(yī)院介入治療科，廣東　深圳　5108035；3、深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣東　深圳5108035；4、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西　南昌330006）

·論著·

急性缺糖缺氧通過增強(qiáng)膽堿酯酶表達(dá)促進(jìn)腎小管細(xì)胞的炎性損傷

吳明1，吳樂鋒1，李明利2，陸俊福1，賴凱1，徐跡3，劉芬4，馮永文1

（1、深圳市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳5108035；2、深圳市第二人民醫(yī)院介入治療科，廣東深圳5108035；3、深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室，廣東深圳5108035；4、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西南昌330006）

目的探討急性缺糖缺氧導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法分離培養(yǎng)大鼠腎內(nèi)巨噬細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞，構(gòu)建兩者共培養(yǎng)（transwell）模型，細(xì)胞分成對照組及缺糖缺氧（Oxygen and glucose deprivation，OGD）組，給予缺糖缺氧處理細(xì)胞1h后再正常培養(yǎng)24h，ELISA法檢測兩組上清液TNF-α，IL-1β和IL-10的濃度，噻唑藍(lán)（MTT）檢測腎小管細(xì)胞活力及RT-qPCR及Western Blot檢測AChE的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果在共培養(yǎng)上清液中，對照組與OGD相比，TNF-α（pg/ml）：（231.67±36.28）VS（428.67±43.16）（P＜0.05），IL-1β（pg/ml）：（116.67±21.64）VS（219.63±43.86）（P＜0.05），IL-10（pg/ml）：（235.67± 39.35）VS（432.67±49.72）（P＜0.01）。腎小管細(xì)胞活力明顯降低，分別為（88.41±18.25）VS（46.98±13.87）（P＜0.01），OGD組巨噬細(xì)胞AChE mRNA和蛋白水平均高于對照組，分別上調(diào)了（3.82±0.73）和（2.17±0.46）倍（P＜0.01）。結(jié)論急性缺糖缺氧增強(qiáng)了腎臟巨噬細(xì)胞膽堿酯酶的表達(dá)，通過炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了急性缺糖缺氧性腎小管細(xì)胞損傷。

缺糖缺氧；膽堿酯酶；炎癥介質(zhì)；腎小管細(xì)胞活力

在急性缺氧等各種應(yīng)激下，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，白細(xì)胞聚集、黏附、激活血小板，釋放大量的炎癥介質(zhì)，直接介導(dǎo)了腎臟間質(zhì)內(nèi)的巨噬細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生改變，使足細(xì)胞逐漸向纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)了腎臟纖維化的發(fā)生［1］。研究顯示急性腎損傷（AKI）的發(fā)生除全身血流動力學(xué)改變因素外，還與腎臟微環(huán)境和炎癥、免疫密切相關(guān)［2］。AKI是慢性腎臟疾?。–KD）、終末期腎?。‥SRD）、死亡和其他非腎臟疾病的獨(dú)立危險因素［3］。因此，全面理解腎臟微環(huán)境、免疫、炎癥的關(guān)系，對急性腎臟疾病的治療至關(guān)重要［4］。

神經(jīng)-免疫的正負(fù)反饋精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，對穩(wěn)定人類健康至關(guān)重要。研究顯示膽堿能抗炎通路是由迷走神經(jīng)介導(dǎo)的實時調(diào)控炎癥反應(yīng)通路［5］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，局部炎癥因子刺激迷走傳入神經(jīng)纖維，將炎癥信號傳入下丘腦，再經(jīng)迷走傳出神經(jīng)纖維向炎癥部位釋放乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），激活單核-巨噬細(xì)胞上的煙堿型乙酰膽堿受體7（nicotinic acetylcholine receptor alpha7，nACh-Rα7），從而抑制單核-巨噬細(xì)胞的活化，減少TNF-α等促炎因子的釋放，達(dá)到調(diào)控炎癥反應(yīng)的目的［6］。神經(jīng)元細(xì)胞分泌的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterse，AChE）對乙酰膽堿的分解起重要作用。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterse，AChE）不僅存在于神經(jīng)元細(xì)胞中，也存在于免疫細(xì)胞上，其中巨噬細(xì)胞表達(dá)最豐富［7］。因此，研究急性缺糖缺氧性腎臟疾病的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對急性缺糖缺氧性腎損傷的治療提供新方向。為此，我們先通過分離培養(yǎng)腎臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞與腎小管上皮細(xì)胞，構(gòu)建兩者共培養(yǎng)（transwell）模型，探討缺糖缺氧對腎小管細(xì)胞活力的影響，并觀察缺糖缺氧對腎臟巨噬細(xì)胞膽堿酯酶的影響。

1　材料與方法

1.1腎臟內(nèi)巨噬細(xì)胞分離與培養(yǎng)脫頸處死SD大鼠（8W，SFP級，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司），75%酒精侵泡5min，將大鼠倒立提起，外科方法無菌摘取雙側(cè)腎臟，置于盛有預(yù)冷RPMI-1640培養(yǎng)液（含1%小牛血清）（Gibco美國）的平皿中，剪去結(jié)締組織和脂肪。擠壓腎組織通過200目的鋼絲網(wǎng)，獲得單個細(xì)胞。離心200×g10min，去上清液。用含1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成約1×108/ml。獲取單個細(xì)胞接種于10%FBS 的DMEM培養(yǎng)液（Gibco美國）于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱（thermo美國）飽和濕度下培養(yǎng)。用貼壁法純化巨噬細(xì)胞并顯微鏡拍照（Olympus，日本）。將腎內(nèi)巨噬細(xì)胞系按3.0× 104cells/ml的密度接種于24孔板上，每孔1～2ml，培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h棄原培養(yǎng)液，并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，鏡下可觀察到貼壁腎巨噬細(xì)胞的細(xì)胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規(guī)則形，有偽足和突起。將此細(xì)胞鑒定為巨噬細(xì)胞后作為實驗細(xì)胞。

1.2腎小管細(xì)胞分離與培養(yǎng)動物處理同巨噬細(xì)胞分離。分離腎皮質(zhì)和髓質(zhì)，取腎皮質(zhì)剪碎至1mm3大小，使用PBS（Gibco美國）沖洗后離心300×g 10min，反復(fù)3次，棄上清液加入配制1g/L I型膠原酶的DMEM消化液，37℃振蕩消化30min，并用移液管輕輕吹到30次，將尚未消化的腎皮質(zhì)更換到新的膠原酶溶液中，繼續(xù)震蕩消化30min，再次吹打30次，將消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，并用玻璃棒輕輕研磨同時以DMEM沖洗，網(wǎng)下液體再經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后將其轉(zhuǎn)移到離心管中，離心300×g 5min，棄上清液取沉淀，反復(fù)2次。使用5ml DEME培養(yǎng)液重懸浮沉淀，并輕輕鋪于預(yù)先配置好的45%的percoll（GE Healthcare美國）細(xì)胞分離液上，使用高速冷凍離心機(jī)離心（4000×g，4℃，30min），離心后可見液體分層，吸取近管底第2層細(xì)胞懸液即為腎小管上皮細(xì)胞。將分離純化的腎小管上皮細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液洗滌并以300×g離心10min，洗滌2次以去殘留的Percoll細(xì)胞分離液。最后用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并做好標(biāo)記，臺盼藍(lán)（Sigma美國）染色計數(shù)細(xì)胞并觀察細(xì)胞活力，將細(xì)胞配成所需的濃度，經(jīng)倒置顯微鏡（Olympus日本）觀察到貼壁細(xì)胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，細(xì)胞之間排列緊密，鑒定為腎小管細(xì)胞后進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)。

1.3缺糖缺氧（OGD）及共培養(yǎng)模型的構(gòu)建將第3代腎小管上皮細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞長滿約50%～60%時，10%FBS 的DMEM培養(yǎng)液300μl，放入腎臟巨噬細(xì)胞雙細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中（transwell板）并培養(yǎng)24h。棄原培養(yǎng)液后，正常組細(xì)胞：加入Earle's液（Gibco美國）；缺糖缺氧組（10%XB+OGD）：用無糖Earle's液清洗細(xì)胞1次后，分別加入4mmol/ml濃度的Na2S2O4無糖Earle's液，無糖低氧損傷時間為1h。1h后細(xì)胞分別用Earle's液清洗1次，加入完全培養(yǎng)液（10% FBS的1640 Gibco美國）培養(yǎng)至24h。

1.4酶聯(lián)免疫吸附檢測按照ELISA試劑盒說明，檢測培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中TNF-α（mybiosource，MBS355371），IL-1β（mybiosource，MBS175941），IL-10（Mybiosource，MBS8506064）的濃度，通過酶標(biāo)儀（MK3 LAB芬蘭）檢測450nm的吸光度，所有吸光度結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)化，計算出樣品水平。

1.5腎小管細(xì)胞活力檢測（MTT檢測）取96孔板共培養(yǎng)實驗中的腎小管上皮（約1×104）細(xì)胞，置37℃、5%CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入適當(dāng)濃度的受試化合物并適當(dāng)條件下培養(yǎng)24h。每孔加50μl1×MTT（KeyGEN KGA312），在37℃孵育4h。吸出上清液，每孔加150μl DMSO，酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測每孔的光密度（OD值）。細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD值減去本底OD值（完全培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD值（完全培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD值取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T為加藥細(xì)胞的OD值，C為對照細(xì)胞的OD值。細(xì)胞存活率%=（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100%。

1.6RT-qPCR檢測AChE的mRNA相對表達(dá)用TRIzol液（Invitrogen，美國）提取腎內(nèi)巨噬細(xì)胞總RNA，RNA的濃度和純度用紫外分光光度計檢測其在260和280nm的吸光度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Biotechnology-Co，Ltd，上海，中國）完成，每反應(yīng)10μl總體系。RT-qPCR用SYBR Premix Ex TaqⅡ kit（TaKaRa BiotechnologyCo，Ltd，上海，中國）完成，每反應(yīng)20μl體系。PCR擴(kuò)增用一步法定量PCR系統(tǒng)完成（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國），AChE mRNA的表達(dá)水平參照標(biāo)準(zhǔn)化的β-actin內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt表示［8］，并評估樣本間差異。上述各試劑盒操作根據(jù)供應(yīng)商操作說明。AChE和β-actin引物見表1。

表1　AChE和β-actin引物

1.7Western Blot分析為了檢測AChE和對照GAPDH蛋白，用RIPA提取腎巨噬細(xì)胞總蛋白，取相同量的蛋白上樣，電泳后，將一抗用TBST（SIGMA）稀釋至1：500（在1.5ml離心管中）；從封閉液中取出膜，室溫下孵育1～2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min；用辣根過氧化物酶（HRP Abcam美國）標(biāo)記的二抗稀釋液（1：500）室溫下孵育1h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min，用ECL發(fā)光試劑盒檢測。結(jié)果定量分析用Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測其IOD（integrated optical density）累積光密度。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1缺糖缺氧對腎內(nèi)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液炎癥介質(zhì)及腎小管細(xì)胞活力的影響為了明確急性缺糖缺氧誘導(dǎo)的腎內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，我們構(gòu)建了缺糖缺氧腎內(nèi)巨噬細(xì)胞模型，使用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中TNF-α，IL-1β和IL-10濃度。結(jié)果顯示OGD組的TNF-α，IL-1β及IL-10表達(dá)均高于對照組（見圖1A、B、C）。通過MTT法檢測各實驗組腎小管細(xì)胞的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組（Normal cell）相比，10%XB+OGD組腎小管細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）（見圖1D）。

圖1　急性缺糖缺氧對大鼠腎臟巨噬細(xì)胞炎癥因子濃度及腎小管的活力的影響

2.3缺糖缺氧對腎巨噬細(xì)胞AChE mRNA及蛋白水平表達(dá)的影響為明確缺糖缺氧對膽堿能通路的影響，我們檢測了兩組乙酰膽堿酯酶mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：腎巨噬細(xì)胞經(jīng)過缺糖缺氧處理后，與對照組相比，AChE mRNA上調(diào)了（3.82± 0.73）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2A），并且細(xì)胞內(nèi)AChE蛋白水平也升高了（2.17±0.46）倍（圖2B），AChE蛋白表達(dá)結(jié)果定量分析如 圖2C所示。

圖2　急性缺糖缺氧對大鼠腎臟巨噬細(xì)胞AChE mRNA及蛋白的影響

3　討論

2013年針對全國44家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的急性腎損傷流行病學(xué)調(diào)查顯示有約25.3%患者的血清肌酐是正常值的2倍或以上，其中約7.0%患者懷疑有急性腎損傷，明顯高于西方發(fā)達(dá)國家1.9%水平［9，10］。急性缺氧是急性腎損傷的重要原因。缺氧誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤在缺氧性腎損傷中起重要作用，其中巨噬細(xì)胞的腎臟浸潤，顯得尤為重要［11］。新近的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境中有不同的表型，M1促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷，M2減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)等，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對組織的損傷與修復(fù)起重要作用［12］。腎臟發(fā)生缺血性損傷時，循環(huán)中的炎癥介質(zhì)進(jìn)入組織，改變了腎臟間質(zhì)巨噬細(xì)胞的微環(huán)境。其中TNF-α、IL-1β可以促使巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1型，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，IL-4、M-CSF、TGF-β可以促使巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)［13］。也有研究顯示iPSC-MSC來源的外泌體可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎性因子，減輕肺損傷［14］。因此，探討腎臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞的微環(huán)境對急性腎損傷的治療至關(guān)重要。

迷走神經(jīng)的膽堿能通路是一種及時的神經(jīng)調(diào)節(jié)通路，激活此通路能有效減少炎性因子的合成和釋放，對缺血再灌注損傷的全身和局部的炎癥反應(yīng)具有明顯地抑制作用［15］。膽堿能神經(jīng)末梢分泌乙酰膽堿，激活單核-巨噬細(xì)胞上的煙堿型乙酰膽堿受體7，抑制單核-巨噬細(xì)胞的活化，減少TNF-α等促炎因子的釋放［16］。神經(jīng)元細(xì)胞分泌的乙酰膽堿酯酶 （acetylcholinesterse，AChE）精準(zhǔn)調(diào)控乙酰膽堿。避免神經(jīng)末梢乙酰膽堿的集聚，對維持乙酰膽堿的動態(tài)穩(wěn)定起積極作用。研究顯示AChE不僅存在于神經(jīng)元細(xì)胞中，也存在于免疫細(xì)胞上，其中巨噬細(xì)胞表達(dá)最豐富［7］。當(dāng)機(jī)體受到不良刺激，組織的巨噬細(xì)胞能否調(diào)節(jié)AChE的分泌，適度調(diào)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)尚不清楚。

為了明確腎臟微環(huán)境、炎癥與膽堿能的關(guān)系，了解巨噬細(xì)胞在腎臟疾病的發(fā)展中的重要作用，我們構(gòu)建OGD模型及腎臟巨噬細(xì)胞-上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系，以模擬急性缺血缺氧性所致腎小管損傷的病理過程。我們在腎臟巨噬細(xì)胞與小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，低糖低氧處理1h再正常培養(yǎng)至24h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，OGD組細(xì)胞養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β濃度水平明顯增高，兩者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），OGD組腎臟巨噬細(xì)胞中AChE mRNA和蛋白水平比正常對照組上調(diào)了（3.82±0.73）和（2.17±0.46）倍，并且腎小管細(xì)胞活力明顯降低。說明缺糖缺氧促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面的膽堿酯酶的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)介導(dǎo)了缺糖缺氧性腎小管細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究證實了缺糖缺氧增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞分泌乙酰膽堿酯酶，間接減弱了膽堿能的抗炎作用，改變了腎臟間質(zhì)細(xì)胞周圍的微環(huán)境。我們推測，這種微環(huán)境的改變，使巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1型，加劇了急性缺氧性炎癥損傷。因此，我們將進(jìn)一步探討膽堿酯酶與巨噬細(xì)胞的表型之間的關(guān)系，為調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型，減輕急性缺糖缺氧性腎損傷提供新的線索。

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Acute oxygen and glucose deprivation promotes inflammatory injury of renal tubular cells by enhancing the expression of cholinesterase

WU Ming1，WU LeFeng1，LI Mingli2，LU Junfu1，LAI Kai1，XU Ji3，LIU Fen4，F(xiàn)ENG Yongwen1.1.Department of Crit-ical Care Medicine of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；2.Department of interventional therapy of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；3.Department of Central laboratory of Shengzhen Second Hospital，Shenzhen 518035，China；4.the First Hospital Affiliated to Nan chang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigate the injury mechanism of renal tubular cells induced by acute oxygen and glucose deprivation.Methods Isolation and culture of rat kidney macrophages and renal epithelial cells，constructing co-cultivating model of lacking Oxygen and sugar（Oxygen and glucose deprivation，OGD），Cells were devided into control group and OGD group，and were given OGD treatment for 1 hour，and then carried out normal culture for up to 24 hours in each group.the expression of TNF alpha，IL-1 beta，IL-10 in supernatant fluid was detected by ELISA，the viability of renal tubular cells was determined by MTT，the expression of mRNA and protein of acetylcholine esterase（AChE）were determined by RT-qPCR and Western Blot respectively. Results The levels of TNF alpha（pg/ml）in the supernatant fluid in cultivation system were（231.67±36.28）in control group VS （428.67±43.16）（P＜0.05）in OGD group，the levels of IL-1β（pg/ml）were（116.67±21.64）in control group VS（219.63±43.86）in OGD group（P＜0.05），the levels of IL-10（pg/ml）were（235.67±39.35）in control group VS（432.67±49.72）in OGD group（P＜0. 01）.The viability of renal tubular cells was（88.41±18.25）VS（46.98±13.87）（P＜0.01）；The levels of mRNA and protein of AChE in OGD group were higher than those in control group，they were raised（3.82±0.73）and（2.17±0.46）times respectively（P＜0.01）. Conclusion Acute oxygen and glucose deprivation enhances the expression of cholinesterase in renal macrophages，the acute injury of renal tubular cells induced by OGD was mediated through inflammatory mediators.

Oxygen and glucose deprivation；Cholinesterase；Inflammatory mediators；Renal tubular cell viability

R692.6，R-332

A

1674-1129（2016）04-0412-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.002

國家自然科學(xué)基金（81101410）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（A2016353）；廣東省深圳市科技創(chuàng)新委項目（JCYJ20130401112313541；JCYJ20150330102401099）深圳市第二人民醫(yī)院基礎(chǔ)-臨床橋梁項目（2015）

吳明，男，1976年11月出生，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事于急性腎損傷的基礎(chǔ)與臨床研究。

馮永文，男，1959年12月出生，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事于危重患者的救治。E-mail：boshiyy@126.com

（2016-05-05；

2016-07-05）