Toll樣受體4配體的研究進(jìn)展

朱雪坤，楊日芳，孟艷秋（.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽 04；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 00850）

Toll樣受體4配體的研究進(jìn)展

朱雪坤1，2，楊日芳2，孟艷秋1
（1.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

Toll樣受體4（TLR4）是TLR超家族的一員，主要識(shí)別細(xì)菌內(nèi)毒素、革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖和脂寡糖等物質(zhì)，防止微生物入侵。TLR4被配體激活后可產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子和炎癥趨化因子，調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)，但其異常調(diào)節(jié)會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病。本文綜述了TLR4的生物結(jié)構(gòu)和配體識(shí)別機(jī)制和近幾年對(duì)TLR4有調(diào)節(jié)作用的脂質(zhì)A類似物、天然產(chǎn)物和合成小分子化合物的研究進(jìn)展，討論了配體的構(gòu)效關(guān)系和復(fù)合物中配體-受體與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

Toll樣受體4；配體；脂多糖；天然免疫

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.014

Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLR受體超家族的一員，被配體激活后可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和炎癥趨化因子，調(diào)節(jié)天然免疫，防止微生物入侵［1］，但調(diào)節(jié)異常會(huì)引發(fā)自身免疫性疾?。?］。TLR4是TLR超家族中發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣的受體之一，以病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associat?ed molecular patterns，PAMP）識(shí)別配體，如革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分的脂多糖（lipopolysaccha?rides，LPS）、脂寡糖（lipooligosaccharide）、細(xì)菌內(nèi)毒素和病毒、真菌和霉?jié){菌分泌的物質(zhì)［3-5］。TLR4還以危險(xiǎn)/損害相關(guān)分子模式（danger/damageassociated molecular patterns，DAMP）識(shí)別內(nèi)源性配體，如高遷移率族蛋白B1（high mobility group box protein 1，HMGB1）和β-防御素等無菌發(fā)炎時(shí)的炎癥細(xì)胞因子等［5］。但迄今為止尚無直接證據(jù)能證實(shí)DAMP是TLR4的直接配體。這可能是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)期間DAMP類配體蛋白在表達(dá)或純化時(shí)被內(nèi)毒素及其他配體污染而受到干擾［4］。本文綜述TLR4的生物結(jié)構(gòu)和配體識(shí)別機(jī)制以及近幾年對(duì)TLR4有調(diào)節(jié)作用的脂質(zhì)A類似物、天然產(chǎn)物和合成小分子化合物的研究進(jìn)展，討論了配體的構(gòu)效關(guān)系、配體-受體和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，并對(duì)TLR4配體藥物研發(fā)進(jìn)行了展望。

1　TLR4　受體

1.1TLR4生物結(jié)構(gòu)

TLR超家族為模式識(shí)別受體，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)為富含亮氨酸重復(fù)序列（leu?cine-rich repeat，LRR）［6］，用于識(shí)別配體并與病原體細(xì)胞表面結(jié)合從而啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不同TLR之間的LRR區(qū)同源性較差，提示各種TLR分子的配體有不同的結(jié)構(gòu)；跨膜區(qū)是半胱氨酸重復(fù)排列區(qū)；胞內(nèi)區(qū)約含200個(gè)氨基酸，與白細(xì)胞介素1受體1 （interleukin-1 receptor-1，IL-1R1）高度同源，稱之為TIR（Toll/IL-1R1 homologous region，TIR）結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)與之有關(guān)［1，6］。包含TIR結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)有TLR、髓樣分化因子88（myeloid dif?ferentiation factor 88，MyD88）、TIR結(jié)構(gòu)域銜接子（TIR-domain-containing adaptor，TRIF）、TRIF相關(guān) 接 頭 分 子（Trif-related adaptor molecule，TRAM）等［7］，它們都具有相似的信號(hào)肽銜接蛋白。配體與TLR結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)肽與受體的TIR結(jié)構(gòu)域銜接，通過多重信號(hào)通路產(chǎn)生并分泌細(xì)胞因子，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-кB、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）等［3］。

1.2TLR4信號(hào)通路

TLR4有兩種識(shí)別配體的方式，包括MyD88依賴性途徑和TRIF依賴性途徑（圖1）［8］。MyD88依賴性途徑中，TLR4與配體結(jié)合后形成TLR4/MD-2復(fù)合物并二聚化，與MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88復(fù)合物，激活I(lǐng)L-1R相關(guān)激酶4（IL-1R-associated kinase 4，IRAK4），使IRAK1和IRAK2磷酸化后與TRAF6結(jié)合，活化IκB激酶（inhibitor of nuclear factor-κB kinase，IKK），促使NF-κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB，IκB）磷酸化后從NF-κB上脫落，使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并激發(fā)后續(xù)反應(yīng)［1，7］。

TRAM也含有TIR結(jié)構(gòu)域，在TRIF依賴性途徑中可通過活化TRAF3對(duì)干擾素（interferon，IFN）的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3）、IRF-7以及NF-κB。IRF-3激活后使IFN相關(guān)基因活化，促使機(jī)體產(chǎn)生炎癥相關(guān)因子［1，7］。

2　潛在適應(yīng)證

TLR4配體的作用廣泛，與頭頸癌、肺癌、肝癌、宮頸癌和卵巢癌等有密切聯(lián)系［8］，在福辛普利治療脂肪沉滯性動(dòng)脈硬化癥時(shí)也有重要作用［9］，與缺血性疾病的梗塞面積也有關(guān)［10］。抑制TLR4的表達(dá)可治療CBV3引起的心肌炎［2］。高HMGB1-TLR4信號(hào)通路在外傷性腦損傷后可導(dǎo)致神經(jīng)血管功能障礙［11］。TLR4抑制劑（如VGX-1027）可使人體抵抗2型糖尿病以及腎性并發(fā)癥［12］。此外，TLR4還與敗血癥、卒中、心肌梗死和器官移植等有密切關(guān)系［5］。

3　TLR4　配體的研發(fā)

圖1　Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路.MD-2：髓樣分化蛋白-2；MyD88：髓樣分化因子88；IRAK：IL-1R相關(guān)激酶；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子；NF-кB：細(xì)胞核因子-κB；IκB：NF-κB抑制因子；IKK：IκB激酶；TRIF：TIR結(jié)構(gòu)域銜接子；TRAM：TRIF相關(guān)接頭分子；IRF3：干擾素調(diào)節(jié)因子.

TLR4通過識(shí)別病原體和內(nèi)源性配體可引發(fā)促炎性固有免疫反應(yīng)，但表達(dá)異常也可促進(jìn)多種疾病的發(fā)生［1］。因此，TLR4是上述疾病防治的重要藥物靶點(diǎn)。

3.1脂質(zhì)A類似物

3.1.1減少脂質(zhì)A（圖2，化合物1）脂肪?；湥╢atty acyl group，F(xiàn)A）個(gè)數(shù)

脂質(zhì)ⅣA（圖2，化合物2）雖只有4條FA，與人髓樣分化蛋白-2（human myeloid differentiation pro?tein-2，hMD-2）結(jié)合，抑制（脂質(zhì)A/hMD-2/TLR4）形成，從而抑制TLR4活性，但與小鼠的mMD-2結(jié)合時(shí)有一條FA暴露在mMD-2表面，同脂質(zhì)A與hMD-2的晶體結(jié)構(gòu)非常相似。因此，脂質(zhì)ⅣA可在人體內(nèi)抑制TLR4活性而在小鼠體內(nèi)激動(dòng)TLR4［4，13］。這表明人與小鼠的mMD-2存在種屬差異。

E5564（圖2，化合物3）與脂質(zhì)A競(jìng)爭(zhēng)性地與hMD-2結(jié)合，抑制TLR4的活性［14］，雖在前期研究中表現(xiàn)出抑制敗血癥活性，但Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段未達(dá)到臨床終點(diǎn)，已終止進(jìn)一步的研究［15］。

肝素處理的人全血中，OM-174-DP（圖2，化合物4）可抑制熱致死大腸桿菌通過TLR4/MD-2生成TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8和IL-10［16］。

3.1.2單磷酸脂質(zhì)A類似物

1-脫磷酸的MPLA（圖2，化合物5）有6條FA，是TLR4的激動(dòng)劑，毒性較低，可用作疫苗佐劑，這與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為TRIF-選擇性而非MyD88-依賴性有關(guān)［4］。但1-羥烷氧基化的OM-174-MP（圖2，化合物6）只有3條FA，是TLR4的拮抗劑［16］。

3.1.3單糖類脂質(zhì)A類似物

單糖磷脂GLA-60（圖2，化合物7）為TLR4激動(dòng)劑，可作免疫佐劑［17］。CCL-34為TLR4特異性激動(dòng)劑［4］；其半乳糖構(gòu)型須為α-構(gòu)型，可為其他單糖替代，如α-巖藻糖、α-或β-葡萄糖、α-半乳糖醛酸等［18］。

乙醇胺衍生物（圖2，化合物9）（R=COOH），濃度為0.1μmol·L-1即可刺激IL-6的產(chǎn)生［4，19］。

長鏈醚胺IAXO-101（圖2，化合物10）可特異性地抑制TLR4［20］，IAXO-102（圖2，化合物11）、IAXO-103（圖2，化合物12）可抑制內(nèi)毒素從其與CD14形成的復(fù)合物中轉(zhuǎn)出后呈遞給MD-2/TLR4復(fù)合物［21］，抑制與TLR4相關(guān)的癥狀，如鼠急性敗血癥和神經(jīng)性疼痛［4］。IAXO-103對(duì)NF-κB的抑制作用最優(yōu)［21］。

3.1.4單糖且單磷酸脂質(zhì)A類似物

L-CRX-527（圖2，化合物13）和D-CRX-547（圖2，化合物14）為1-氨烷氧基葡胺糖-4-磷酸酯類，在葡胺糖頭碳引入絲氨酸苷鍵，在α-氨基引入含2條FA的側(cè)鏈，加上糖環(huán)上的4條FA側(cè)鏈，也有6 條FA，因此也是TLR4激動(dòng)劑。有趣的是，D-異構(gòu)體CRX-547僅選擇性地激動(dòng)TRIF信號(hào)通路，而L-異構(gòu)體CRX-527則對(duì)TRIF與MyD88信號(hào)通路均有激動(dòng)作用。CRX-547在較寬濃度范圍內(nèi)都可選擇性地作用于TRIF信號(hào)通路［22］。

圖2　脂質(zhì)A類似物的結(jié)構(gòu)

3.1.5非經(jīng)典的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)類似物

低濃度OM-197-MP-AC（圖2，化合物15）可活化TLR4，但高濃度（200 μg·L-1）時(shí)對(duì)LPS具有拮抗行為，劑量達(dá)0.9 mg·kg-1時(shí)對(duì)兔也無發(fā)熱現(xiàn)象，可作疫苗佐劑促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答。在HEK293細(xì)胞中，OM-294-DP（圖2，化合物16）抑制LPS的活性較弱，但在全血中其作用很強(qiáng)，可能是因?yàn)槿芯哂蠺LR4輔助因子［15］。

結(jié)構(gòu)對(duì)稱的D1（圖2，化合物17）具有4條FA、2個(gè)硫酸基團(tuán)和（C6-C6′）琥珀酰胺連接的2個(gè)α-D-吡喃葡萄糖甲苷，亦為TLR4抑制劑［4］。

3.2天然產(chǎn)物

3.2.1鼠尾草酸、異硫氰類、嗎啡類、紫杉酚和羽扇豆醇

鼠尾草酸（carnosic acid）可抑制3T3-L1脂細(xì)胞中TLR4的活性，從而抑制NF-κB的活化［23］；由肝清除，經(jīng)腸道排出［24］。異硫氰類如萊菔硫烷（sul?foraphane）可抑制MD-2與LPS的結(jié)合［4］。紫杉酚可活化mMD-2/TLR4通路但抑制hMD-2/TLR4通路，并改善人體內(nèi)TLR4過表達(dá)引起的癥狀和LPS引起的腎損傷［4，15］。嗎啡類可阻止IRAK與MyD88分離后與TRAF6的結(jié)合，羽扇豆醇（lupeol）可通過IRAK-M抑制MyD88依賴性通路，對(duì)抗D-半乳糖苷（D-galactosamine，GlaN）/LPS引起的暴發(fā)性肝衰竭［25］。

3.2.2含有α，β-不飽和羰基的化合物

肉桂醛可抑制LPS引起的TLR4寡聚化從而降低NF-κB和IRF3的產(chǎn)生，但肉桂醛飽和類似物2-苯基丙醛則無此作用，提示肉桂醛可能與MD-2的半胱氨酸共價(jià)結(jié)合［4］。甘草皂苷和異甘草素均可抑制LPS引起的（MD-2/TLR4）2的形成而抑制TLR4活性，但僅甘草皂苷抑制LPS/TLR4/MD-2復(fù)合物的形成，異甘草素則通過與TLR4或MD-2共價(jià)加成，抑制TLR4的寡聚化［4］。姜黃素在鼠BaF3細(xì)胞系中抑制MyD88依賴性TLR4信號(hào)傳導(dǎo)，也可抑制TRIF的活性，可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制LPS和hMD-2結(jié)合［4，15］。

3.3合成小分子化合物

LPS類似物的相對(duì)分子質(zhì)量太大，很難達(dá)到藥理性質(zhì)，如抑菌劑依立托倫（eritoran，E5564）雖進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段，但無達(dá)到臨床終點(diǎn)的藥理效能。因此，高特異性和高生物利用度的小分子調(diào)節(jié)劑成為新的研究熱點(diǎn)。

3.3.1瑞沙托維（resatorvid，TAK-242）

TAK-242［N-（2-氯-4-氟苯基）-2-乙氧羰基-2-環(huán)己烯磺酰胺］可選擇性地抑制TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞因子（如IL-6和TNF-α）的mRNA在鼠和人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，TAK-242雖可抑制LPS引起的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但并不抑制LPS與CD14/ TLR4/MD-2結(jié)合［26］。TLR4信號(hào)通路是NLRP3活化的第一階段，可產(chǎn)生IL-1β前體（pro-IL-1β），TAK-242對(duì)TLR4的抑制作用可減少pro-IL-1β的產(chǎn)生，從而抑制NLRP3炎癥體不適當(dāng)活化引起的敗血癥等非傳染性疾?。?7］。2009年TAK-242因不能達(dá)到降低細(xì)胞因子水平的臨床終點(diǎn)而中斷了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但其TLR4的選擇性抑制作用對(duì)于治療慢性炎性疾病如肥胖、2型糖尿病等仍有研究意義［28］。

3.3.2β-氨基乙醇衍生物

基于MD-2探索TLR4小分子抑制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)了β-氨基乙醇衍生物（圖3，化合物1），如T5342126 （1j，R=p-CH3CH2O-，R1=o-Cl，R2=H）。-OH的立體異構(gòu)體的活性區(qū)別不大，去除-OH時(shí)活性變化也不大，表明-OH不是必須的，但醚鍵可能是必須的。R基為吸電子基團(tuán)時(shí)活性較優(yōu)，親脂性增加會(huì)使活性降低，如R=Cl時(shí)EC50=16.1 μmol·L-1，R= CF3時(shí)EC50=23.7 μmol·L-1。R1為吸電子基團(tuán)時(shí)（如m-Cl）活性增加，EC50由＞100降至16.5 μmol·L-1，間位時(shí)活性最強(qiáng)［14］。藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，濃度為5 mmol·L-1時(shí)1j有較高的血腦屏障通透性，但在肝中以較快的速度代謝；細(xì)胞色素CYP初步篩選發(fā)現(xiàn)，1j對(duì)主要代謝酶均有作用，表明藥物結(jié)構(gòu)需進(jìn)一步改進(jìn)。初步研究表明，1j對(duì)多種重要的激酶均無影響，其濃度達(dá)1 mmol·L-1時(shí)在全血中的溶血作用亦可忽略［14，29］。

3.3.3VGX-1027（GlT27）

VGX-1027（GIT27）［（±）-3-苯基-4，5-二氫異噁唑-5-乙酸］可通過抑制炎性抗原的加工和遞呈來抑制免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，因此具有治療免疫性炎性疾病的潛能，如1型糖尿病、胸膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和全身性紅斑狼瘡等［30］。

該化合物可使患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的NZB/ NZW F1鼠的死亡率從62.5%降低到33.3%，血清中抗雙鏈DNA（dsDNA）自身抗體水平降低，腎炎發(fā)生減少［31］，此外還可降低急性胸膜炎模型的死亡率、鼠自發(fā)型1型糖尿病累計(jì)發(fā)病率和Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的病情進(jìn)展［11，31］。外傷性腦損傷4h后用此化合物治療可明顯減弱腦水腫，但預(yù)處理或創(chuàng)傷1h后使用則無效，這種臨床上不完整的治療窗口與TLR4在TBI后延遲應(yīng)答一致，也與腹膜內(nèi)給藥后2h的血漿達(dá)峰濃度一致［11］。

3.3.4嘧啶［5，4-b］吲哚類化合物

取代的嘧啶［5，4-b］吲哚類化合物（圖3，化合物2），如1Z105：R1=Ph，R2=c-Hex，R3=H；1Z88：R1=Ph，R2=tetrahydrofurfuryl，R3=Me）是TLR4的選擇性配體，此類化合物并不受CD14的影響，而是直接與TLR4/MD-2復(fù)合物的MD-2結(jié)合［4］。

對(duì)嘧啶［5，4-b］吲哚類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)現(xiàn)R2為苯基或氟、甲基取代苯時(shí)對(duì)干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducible protein 10，IP-10）的刺激活性是R2為環(huán)己烷基時(shí)的44%～70%，對(duì)IL-6的刺激活性卻為R2為環(huán)己烷基時(shí)的11%～36%，應(yīng)答偏向Ⅰ型干擾素通路；當(dāng)R3為短烷基鏈（如甲基）時(shí)活性較高，且細(xì)胞毒性較低。此類化合物有用作免疫調(diào)節(jié)劑或免疫佐劑的潛力［32］。

3.3.5euodenine A及其合成類似物EAA1

如化合物3（圖3），EAA1（R=c-Pent，R1=H，R2=R3=R7=R8=Me，R4=R5=R6=H）和euodenine A （R=R7=R8=Me，R1=R2=R3=OMe，R4=R5=R6=H）是TLR4激動(dòng)劑。euodenine A對(duì)hTLR4和hMD-2均有選擇性。

在外周血單核細(xì)胞中，euodenine A對(duì)IL-8產(chǎn)生與LPS相似程度的誘導(dǎo)作用，對(duì)IL-12p40、IL-10 和TNF-α的誘導(dǎo)作用較小，抑制IL-5的活性。表明euodenine A可能拮抗IL-5引起的過敏性炎癥，同時(shí)有較低的IL-12和TNF-α介導(dǎo)的促炎反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，測(cè)定對(duì)TLR4的活性發(fā)現(xiàn)，當(dāng)R=H時(shí)激動(dòng)TLR4的活性消失，在R2=R3=OMe，R4=H條件下將R基用較大取代基如乙基、環(huán)丙基、環(huán)戊烷基等替換甲基時(shí)活性升高，EC50=3.1-0.39 μmol·L-1，R2=R3=R4=OMe條件下，活性也升高但規(guī)律性降低，R基比環(huán)戊烷基還大或有烷基以外的基團(tuán)（羰基或醚類）時(shí)，活性降低或消失，如R=COMe，EC50=10 μmol·L-1；R=CH2O-iPr，藥物濃度達(dá)到300 μmol·L-1時(shí)仍無活性。R2=R3=OMe條件下，R4=H或OMe時(shí)活性相似，表明移走一個(gè)甲氧基（R4）對(duì)活性影響不大。將R3用甲基替換甲氧基時(shí)不影響活性，但用較大基團(tuán)或極性基團(tuán)替換時(shí)活性顯著減小，如R=H，R4=iPr條件下，R3=OMe，EC50=1.0，R3= OEt，EC50=3.9；R3=OH，EC50＞10 μmol·L-1。當(dāng)R2為鹵素時(shí)活性急劇下降，為增溶性基團(tuán)（如2-羥乙氧基）時(shí)活性增加，為更大的增溶基團(tuán)（如3-嗎啉丙氧基）時(shí)活性反而下降，為酰氧基（如-OAc）時(shí)活性也下降。將R2、R3兩個(gè)甲氧基都去除時(shí)活性急劇下降。R5為小烷基（如Me）時(shí)對(duì)大多數(shù)化合物的活性影響較小，將吡啶環(huán)上的苯環(huán)去除則活性消失。R6為甲基或甲氧基時(shí)活性都下降。移走R7、R8的任意一個(gè)甲基都會(huì)顯著減少活性［33］。

圖3　代表性TLR4小分子配體結(jié)構(gòu)

3.3.6乙醇

TLR4或MyD88缺失或用納洛酮抑制TLR4的活性可減弱乙醇引起的鎮(zhèn)靜和行為損傷，表明TLR4和MyD88與乙醇引起的行為有關(guān)［34］。乙醇可上調(diào)星形細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)，使胱天蛋白酶1活化，IL-1β和IL-18釋放，引起細(xì)胞死亡。抑制TLR4活性可消除乙醇對(duì)NLRP3的作用，減少細(xì)胞死亡，表明TLR4和NLRP3的相互作用在乙醇引起的大腦損傷中有重要作用［35］。

含有乙醇的飲食可抑制野生型C3H/HeOuJ小鼠體內(nèi)海帕西啶（hepcidin）mRNA的轉(zhuǎn)錄，并激活NF-κB核轉(zhuǎn)移，但在TLR4突變型C3H/HeJ小鼠體內(nèi)無此效果，表明慢性攝入乙醇可通過活化TLR4信號(hào)通路和NF-κB在炎性肝臟中抑制海帕西啶mRNA轉(zhuǎn)錄［36］。另有研究發(fā)現(xiàn)，將野生型小鼠和TLR4突變小鼠ig攝入乙醇濃度為32%體積比的組織培養(yǎng)水后，這2種小鼠（尤其是野生型小鼠）體內(nèi)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，大腸桿菌清除率降低，這可能是急性攝入乙醇使敗血癥預(yù)后不良的機(jī)制［35］。

3.3.7雙環(huán)醇

雙環(huán)醇（bicyclol）（圖3，化合物4）是我國第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類新藥，具有減少氧自由基、保護(hù)抗氧化酶系統(tǒng)、抗炎、抗凋亡和抗腫瘤增殖的作用，主要用于病毒性肝炎、脂肪性肝病和藥物性肝損傷的治療。張健等［37］發(fā)現(xiàn)，它也能顯著減輕缺血性腦卒中模型大鼠的神經(jīng)損傷，減小梗死面積和水腫，下調(diào)TLR4、TLR9、TRAF6、NF-κB和基質(zhì)金屬蛋白酶9，上調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白閉蛋白（Claudin-5）。因此，雙環(huán)醇還可能是TLR4的抑制劑。其類似物聯(lián)苯雙酯（bifendate）（圖3，化合物5）也可能具有相同作用［37］。

3.3.8neoseptin-3

Wang等［38］通過對(duì)約9萬個(gè)化合物的庫篩選，得到先導(dǎo)化合物neoseptin-1，對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行優(yōu)化改造，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)離體活性相當(dāng)?shù)暮蜻x化合物neoseptin-3與-4，其中neoseptin-3（圖3，化合物6）的刺激活性有劑量依賴關(guān)系，為TLR4的選擇性激動(dòng)劑，EC50為18.5 mmol·L-1，被選作進(jìn)一步的研發(fā)［38］。

neoseptin-3的構(gòu)效關(guān)系分析中，4-位氨基、酰氨基和苯環(huán)上的酚羥基均為其激動(dòng)活性所不可或缺的，酯基以叔丁基最優(yōu)，酯基減小活性顯著下降；酰氨基N上的H被取代、酰基的O被S取代或變?yōu)閬喖谆鶗r(shí)活性消失；4-酚羥基的鄰位被取代活性下降，而酚羥基甲醚化后由激動(dòng)劑反轉(zhuǎn)為拮抗劑，3-取代基苯環(huán)間的連接鏈以二亞甲基或二亞甲基氧基為好；而S-苯丙氨酸部分的苯環(huán)可被環(huán)己基替代，其苯環(huán)4-位可為甲基、鹵素、疊氮基等取代，苯環(huán)與a-碳間以二亞甲基為最好、其次為三亞甲基、再次為一或四亞甲基，但其R-對(duì)映體活性消失［38-39］。

neoseptin-3與小鼠mTLR4-MD2復(fù)合物單晶X射線衍射結(jié)果表明，它通過母核苯環(huán)間p-堆積和一分子的酰氨H與另一分子的酯羰基O形成2個(gè)分子間氫鍵，自組裝為雙分子體，與MD-2的疏水腔結(jié)合，使MD-2如Phe126環(huán)區(qū)發(fā)生類似于LPS或脂質(zhì)A誘導(dǎo)的構(gòu)象變化（面向配體位移），進(jìn)而mTLR4-MD-2二聚體化（配體也提供了部分相互作用面），從而激活mTLR4，其中，一分子neoseptin-3的酚羥基與mTLR4的Ser439側(cè)鏈羥基、苯胺基與mTLR4 的Ser413主鏈?；纬?2個(gè)氫鍵，另一分子neoseptin-3的酚羥基則與mTLR4的Asp437主鏈?；?、苯胺基與MD2的Arg90主鏈?；纬?個(gè)氫鍵。單晶結(jié)構(gòu)進(jìn)一步揭示了neoseptin-3的藥效團(tuán)及其類似物的構(gòu)效關(guān)系［38］。

4　展望

隨著對(duì)TLR4及其配體、TLR4-MD2異源二聚體研究的深入，大量具有TLR4調(diào)節(jié)作用的化合物涌現(xiàn)，但目前已公開報(bào)道的TLR4配體大多缺乏足夠的受體選擇性及通路選擇性，這是今后研究需要注重的方向。TLR4作用具有廣譜性，如何研發(fā)選擇性TLR4配體使其在發(fā)揮相應(yīng)治療作用的同時(shí)避免副作用的發(fā)生，是取得進(jìn)展的關(guān)鍵；此外，還要注意人源與鼠源TLR4存在的種屬差異。隨著不同結(jié)構(gòu)小分子的TLR4配體的報(bào)道，特別是新型配體-TLR4-MD2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的公開，為后續(xù)相應(yīng)的研發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。以TLR4及其超家族為靶點(diǎn)的藥物研究越來越受到重視，其研究進(jìn)展特別是對(duì)TLR4及下游通路具有選擇性作用的配體的發(fā)現(xiàn)將為新型疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑的研發(fā)、敗血癥等疑難雜癥的防治提供工具、方法和藥物。

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（本文編輯：齊春會(huì)）

Research progress in ligands of Toll-like receptor 4

ZHU Xue-kun1，2，YANG Ri-fang2，MENG Yan-qiu1
（1.Pharmaceutical and Biological Engineering College，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142，China；2.Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

Toll-like receptor 4（TLR4）is a member of the TLRs superfamily，mainly capable of identifying bacterial endotoxin，lipopolysaccharides and lipooligosaccharides of Gram-negative bacte?ria cell walls to prevent microbial invasion.Activation of TLR4 can induce production of proinflammato?ry cytokines and inflammatory chemokines and regulate natural immunity.However，dysregulation of TLR4 can lead to autoimmune diseases.This review summarized the biological structure of TLR4 and recognition mechanisms between TLR4 and its ligands，surveyed TLR4 ligands including lipid A ana?logues，natural products and synthetic small molecules，discussed the structure-activity relationship of TLR4 modulators and the ligand-receptor and protein-protein interactions in the complex，and outlined the prospect of future research and development of TLR4 ligands.

Toll-like receptor 4；ligands；lipopolysaccharides；innate immunity

YANG Ri-fang，E-mail：yangrf215@163.com，Tel：（010）66874611；MENG Yan-qiu，E-mail：mengyanqiu@hotmail.com

R966

A

1000-3002-（2016）04-0389-08

朱雪坤，女，碩士研究生，主要從事鼠尾草酸和其他TLR4配體的研究，E-mail：zhuxuekun@yeah.net；楊日芳，男，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物合成研究；孟艷秋，女，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物合成研究。

楊日芳，E-mail：yangrf215@163.com，Tel：（010）66874611；孟艷秋，E-mail：mengyanqiu@hotmail.com

2016-01-28接受日期：2016-03-26）