鈣調(diào)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路抑制劑的研究進(jìn)展

吳鵬飛，劉俊麟，崔志峰（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

鈣調(diào)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路抑制劑的研究進(jìn)展

吳鵬飛，劉俊麟，崔志峰
（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310032）

鈣調(diào)磷酸酶（CaN）是人體免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵酶，其最重要的靶標(biāo)蛋白是活化T細(xì)胞核因子（NFATc）。CaN抑制劑（CNI）如環(huán)孢素A和他克莫司的免疫抑制作用的發(fā)現(xiàn)克服了器官移植中的免疫排斥難題，使器官移植發(fā)生了根本性的改變，迄今這兩種藥物仍然廣泛應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究，但嚴(yán)重的腎毒性和神經(jīng)毒性也限制了它們在臨床上的使用。因此，查找新的特異性更高、在臨床上副作用更小的CNI是一個研究熱點。本文從藥物-親和素復(fù)合物阻斷底物、直接抑制CaN活性和特異性干擾CaN-NFATc相互作用三方面對最近幾十年來天然的和人工合成的CNI作一綜述。

鈣調(diào)磷酸酶；活化T細(xì)胞核因子；免疫抑制劑；環(huán)孢素A；他克莫司

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.015

鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CaN）是一種廣泛分布于人體各種組織的Ca2+離子依賴性絲/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白磷酸酶，又稱為蛋白磷酸酶2B（pro?tein phosphatase 2B，PP2B）。作為Ca2+信號調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵酶，它參與了多項重要生理功能或一些病理過程的調(diào)節(jié)如T細(xì)胞活化、肌肉量調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶的形成和老年癡呆癥的發(fā)生等［1-2］。CaN是由其催化亞基A（calcineurin A，CaNA）和調(diào)節(jié)亞基CaNB組成的異二聚體。CaNA含有催化區(qū)域、CaNB結(jié)合區(qū)域B亞單位結(jié)合螺旋（B subunit bind?ing helix，BBH）、鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）結(jié)合區(qū)域、自身抑制區(qū)域4個功能結(jié)構(gòu)域。CaNB由4個與Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)（EF-hand（含E.F兩段螺旋的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，由29個氨基酸組成的鈣結(jié)合基序）構(gòu)成。CaNB不具有磷酸酶活性，但對維持CaN的高度專一性和調(diào)節(jié)CaN活性是必須的。Ca2+離子和CaM結(jié)合到CaN導(dǎo)致其構(gòu)型發(fā)生改變，露出活性中心。因此，CaN的活性是受細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+離子濃度調(diào)節(jié)的，在Ser/Thr蛋白磷酸酶家族中唯有CaN具有這種特性［3-5］。此外，CaN的活性還受內(nèi)源調(diào)控蛋白，例如CaN調(diào)節(jié)蛋白（regulators of calcineurin，RCAN）的調(diào)控［6］。

CaN能催化細(xì)胞內(nèi)許多蛋白脫磷酸化，其中最重要的靶標(biāo)蛋白是活化T細(xì)胞核因子（nuclear fac?tor of activated T cells，NFATc）家族［7］。而且CaN可能是唯一的催化NFATc脫磷酸化的蛋白磷酸酶［8］。在靜息T細(xì)胞中，NFATc位于細(xì)胞質(zhì)中，呈高度磷酸化，一旦T細(xì)胞受到刺激，Ca2+離子遷移并激活CaN催化NFATc調(diào)節(jié)區(qū)域中的13個Ser殘基脫磷酸化［9］，使其露出核定位序列并轉(zhuǎn)運進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ）和細(xì)胞表面配體白細(xì)胞分化簇抗原40配體（cluster of differentiation 40 li?gand，CD40L）、白細(xì)胞分化簇抗原95配體（cluster of differentiation 95 ligand，CD95L）等與免疫相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)［10-11］。NFATc中與CaN結(jié)合的保守序列PxIxIT稱為CaN結(jié)合區(qū)域1（calci?neurin binding region 1，CNBR1），LxVP稱為CaN結(jié)合區(qū)域2（CNBR2）［12］。這兩個保守序列與CaN的結(jié)合使得NFATc的調(diào)節(jié)區(qū)域非常接近CaN的活性中心，促使NFATc中特異的Ser殘基被CaN脫磷酸化。NFATc中的PxIxIT保守序列也存在于其他的能與CaN結(jié)合的蛋白中［13］。因此，CaN不僅調(diào)節(jié)NFATc的活性也調(diào)節(jié)其他的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）和轉(zhuǎn)錄因子Eph樣激酶-1（Eph-like kinase 1，Elk1）的活性［14-16］。此外，CaN也會干擾其他信號途徑如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）依賴性信號途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號途徑［17-18］。但是那些途徑中的何種組分是CaN的底物，它們的脫磷酸化如何調(diào)節(jié)相應(yīng)的信號途徑仍是未知的?？傊?，CaN是唯一的Ca2+離子依賴性Ser/Thr蛋白磷酸酶，目前只有CaN能活化NFATc從而調(diào)節(jié)IL-2等免疫相關(guān)基因的表達(dá)，抑制CaN能完全阻斷適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因此，CaN被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵因子［19］。

CaN抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）如環(huán)孢素A（ciclosporin A，CsA）和他克莫司（tacrolim?us，F(xiàn)K506）是臨床上廣泛使用的有效CNI，主要用于器官移植和皮膚病治療［20-21］。但長期使用這些藥物會伴有腎毒性、高血糖等多種不良反應(yīng)［22-23］。因此，急需研究減少CsA和FK506的副作用，以及開發(fā)新的特異性更高、副作用更小的CNI。

1　藥物-親和素復(fù)合物阻斷底物的CNl

1.1環(huán)孢素A和他克莫司

CsA是來自一種柱盤孢屬真菌Cylindrocur?pon lucidum的由11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽，F(xiàn)K506是來自一種鏈霉菌屬細(xì)菌Streptomyces tsuknbaenis的23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。雖然兩者化學(xué)分類不同，但CsA和FK506的作用機(jī)制極其相近，都是通過與免疫親和素親環(huán)素A（cyclophilin A，CypA）或FK506結(jié)合蛋白12（FK506 binding protein 12，F(xiàn)KBP12）結(jié)合形成 CsA/CyPA或FK506/FKBP12復(fù)合物，才能成為有活性的CNI［24］。

CsA-CypA復(fù)合物和FK506-FKBP12復(fù)合物是CaN的非競爭性抑制劑，兩者皆結(jié)合到CaN的BBH-CnB表面且離催化活性中心很近，由此產(chǎn)生空間位阻阻礙底物分子NFATc接近CaN的活性中心，掩蓋NFATc中與CaN結(jié)合的保守序列LxVP，使得CaN不能對NFATc脫磷酸，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活化。但是，小分子底物如磷酸對硝基苯酯（pnitrophenyl phosphate，pNPP）仍能被脫磷酸且活性提高了2～3倍，這可能是由于CaN與CsA-CypA 或FK506-FKBP12結(jié)合改變了其自身構(gòu)象，使得CaN更易與小分子底物結(jié)合，而此種構(gòu)象的改變并不能解除空間位阻對大分子底物的抑制［25-26］。其他的Ser/Thr蛋白磷酸酶如蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1），PP2A和PP2C不受CsACypA復(fù)合物和FK506-FKBP12復(fù)合物的影響［24］。

1.2CaN衍生物-伏環(huán)孢素（voclosporin，VCS）

VCS（ISA247）是新一代CNI，與CsA相比具有更好的免疫抑制效果，較少的不良反應(yīng)［27］。VCS是 CsA上1位氨基酸的甲基被乙烯基取代的半合成抑制劑，存在同分異構(gòu)體，能抑制CaN的是（E）-ISA247。VCS進(jìn)入淋巴細(xì)胞后，與胞內(nèi)CyPA結(jié)合形成VCS-CyPA復(fù)合物，該復(fù)合物再通過抑制CaN，抑制IL-2，IL-4，IFN-γ和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-GSF）的活化。VCS具有與CyPA更高的親和能力，可大幅減少用藥量，從而降低藥物的毒性。體外實驗顯示，VCS的免疫抑制活性是CsA的3～4倍［28］。目前VCS已在銀屑病患者進(jìn)行Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗［29］。

1.3他克莫司衍生物-子囊霉素（ascomycin，F(xiàn)K520）和匹美克莫司（pimecrolimus）

子囊霉素和匹美克莫司都是FK506衍生物，作用方式與FK506相同。子囊霉素是從吸水鏈霉菌（Str.hygroscopicus）產(chǎn)物中分離得到的FK506天然衍生物，在結(jié)構(gòu)上與FK506的區(qū)別僅在于21位上烯丙基轉(zhuǎn)變?yōu)橐一Ｗ幽颐顾?FKBP復(fù)合物可有效抑制CaN的活性（Ki=89 nmol·L-1）、NFATc的轉(zhuǎn)錄活性（IC50=0.8 nmol·L-1）以及體外T細(xì)胞的增殖（IC50=0.7 nmol·L-1）［30-31］。近來有研究表明，子囊霉素-FKBP復(fù)合物不僅能抑制淋巴細(xì)胞非特異性多克隆活化增殖，而且能顯著抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖［32］。匹美克莫司是一個半合成的子囊霉素的衍生物（33-表氯-33-脫氧-子囊霉素，33-epichloro-33-desoxy-ascomycin）。與FK506相比，匹美克莫司-FKBP復(fù)合物抑制CaN的能力只有FK506-FKBP復(fù)合物的約1/3，但匹美克莫司具有更好的親脂性，對皮膚有更好的親和力，用藥后引起全身性免疫應(yīng)答輕微。臨床上匹美克莫司被用于治療中度特異性皮炎［33］。

CsA、FK506及其衍生物的作用模式和抑制效應(yīng)（見表1）。目前，CsA、FK506和它們的衍生物是臨床上廣泛使用的最有效的免疫抑制劑，但這類藥物都必須與其免疫親和素結(jié)合形成復(fù)合物才能起作用。免疫親和素屬于肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶類（peptidylprolyl cis/trans isomerase，PPIase），參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的從頭折疊以及多項重要的細(xì)胞功能［34］。臨床上長期使用CsA和FK506會有較嚴(yán)重的副作用如腎毒性等可能與這類藥物都必須與其免疫親和素結(jié)合形成復(fù)合物才能起作用有關(guān)。但是，這些副作用主要是來自抑制CaN還是來自免疫親和素相關(guān)的機(jī)制仍屬未知。而且，這些副作用是由于CaN-NFATc途徑的調(diào)控引起的還是由于其他的途徑或轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控引起的也不清楚。因此，能特異性地抑制CaN但不抑制PPIase，能特異性地抑制NFATc但不抑制其他轉(zhuǎn)錄因子的藥物，應(yīng)比CsA 和FK506及其衍生物特異性更高，在臨床上副作用更小。

表1　環(huán)孢素A（CsA）、他克莫司（FK506）及其衍生物的作用模式和抑制效應(yīng)

2　直接作用于鈣調(diào)磷酸酶的抑制劑

2.1槲皮素（quercetin）

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，不需與任何免疫親和素結(jié)合便可直接作用于CaN的催化亞基，非競爭性可逆抑制CaN。以RⅡ多肽和pNPP為底物的體外CaN活性測定實驗中，槲皮素的IC50分別為11.2±2.0和（281.8±4.0）μmol·L-1。在Jurkat細(xì)胞中，槲皮素亦顯著抑制IL-2的表達(dá)。在免疫細(xì)胞應(yīng)答實驗中，槲皮素還可有效抑制刀豆蛋白A （ConcanavalinA，ConA）誘導(dǎo)的T細(xì)胞和脂多糖誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖［38］。有研究表明槲皮素與FK506-FKBP和CsA-CyPA復(fù)合物具有相似的作用位點［39］。此外，槲皮素作為許多治療肝腎損傷的中藥材的活性成分，可明顯改善CsA所致的腎毒性［40］。

2.2山奈酚（kaempferol）

山奈酚是一個天然黃酮醇化合物，在以pNPP和RⅡ肽為底物的實驗中能抑制純化的CaN活性［41］。山奈酚可直接作用于CaN的催化亞基并抑制其活性，不需要任何媒介蛋白。其他蛋白磷酸酶如PP1和堿性磷酸酶的活性不受山奈酚影響。山奈酚能抑制Jurkat T細(xì)胞中IL-2基因的表達(dá)［41］。奇怪的是，山奈酚在HEK293細(xì)胞中也抑制不依賴CaN的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis facror-α，TNF-α）誘導(dǎo)的NF-κB的活化［42］。

2.3CN585

CN585是一種人工合成的有機(jī)小分子［6-（3，4-二氯苯基）-4-（N，N-二甲基氨基乙?guī)€基）-2-苯基嘧啶］，作用位點位于CaN的催化亞基，無論在體外還是在胞內(nèi)均可非競爭性可逆直接抑制CaN而不需與免疫親和素結(jié)合。以RⅡ多肽為底物的CaN活性測定實驗中，CN585可有效抑制CaN活性（IC50=3.5 μmol·L-1）。在外周血單核細(xì)胞（periph?eral blood mononuclear cell，PBMC）和Jurkat細(xì)胞中，CN585能明顯抑制細(xì)胞因子IL-2的產(chǎn)生〔（IC50=（13±2）μmol·L-1〕，NFAT核轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)錄激活作用〔（IC50=（10±3）μmol·L-1〕和T細(xì)胞的增殖〔IC50=（9.4±1.1）μmol·L-1〕［43］。此外，CN585在有效藥物濃度內(nèi)，不會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，亦不會抑制其他蛋白磷酸酶（PP1，PP2A和PP2C）或CyP18、FKBP12和PPIase1（Pin1）的活性［43］。

2.4CaN424-521-AlD

CaN424-521-AID是一段來自CaN的催化亞基自身抑制區(qū)的肽類抑制劑，為424～521位氨基酸殘基組成的多肽。CaN424-521-AID與CaN結(jié)合后，通過阻止底物蛋白接近CaN的活性中心，從而抑制CaN對底物蛋白的作用。以RⅡ多肽為底物的CaN活性測定實驗顯示，CaN424-521-AID可抑制RⅡ多肽脫磷酸化（IC50=2.5 μmol·L-1）［44］。其中457-482位殘基是CaN424-521-AID起作用的核心區(qū)域，經(jīng)多聚精氨酸修飾后的11R-CaN457-482-AID更易被細(xì)胞吸收，可抑制興奮性神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和CaN誘導(dǎo)的胰島腺泡細(xì)胞活化［45］。

直接抑制CaN活性的抑制劑的作用模式和抑制效應(yīng)見表2。這類抑制劑直接抑制CaN而不需要輔助蛋白，可能具有低毒性。但由于CaN在人體的多項重要生理過程中起著調(diào)節(jié)作用，直接抑制CaN活性的抑制劑除了通過抑制CaN對NFATc的脫磷酸化從而抑制免疫活性外，亦可能會抑制CaN對其他底物的脫磷酸化。因此，特異性地抑制CaN對NFATc的脫磷酸化而不影響CaN對其他底物的脫磷酸化的抑制劑，在臨床上副作用應(yīng)會更小。

3　特異性干擾CaN-NFATc相互作用的抑制劑

3.1PxlxlT肽類

PxIxIT肽類是一段來自NFATc中與CaN-結(jié)合的保守序列PxIxIT的衍生物。含有PxIxIT片段的肽類能與NFATc競爭在CaN上的結(jié)合位點，從而阻止CaN對NFATc1、NFATc2、NFATc4脫磷酸化［55］。且在PxIxIT肽類過表達(dá)的細(xì)胞中，CaN對其他底物的脫磷酸化活性都不受影響［55］。從PxIxIT序列組合文庫中篩選得到的16肽的VIVIT多肽較最初的PxIxIT多肽（16肽的SPRIEIT寡肽）的活性高25倍，能更有效地同NFATc競爭在CaN上的結(jié)合位點，阻斷依賴NFATc的轉(zhuǎn)錄。GFP-VIVIT融合蛋白在Jurkat T細(xì)胞的過表達(dá)顯著抑制NFATc-依賴性報告基因的表達(dá)，但不抑制NF-κB-依賴性報告基因的表達(dá)。因此，VIVIT寡肽能比CsA和FK506復(fù)合物選擇性更高地抑制它們的轉(zhuǎn)錄因子［56］。其更易被細(xì)胞吸收的衍生物11R-VIVIT多肽能顯著延長經(jīng)胰島細(xì)胞移植后小鼠的生存期，同時不影響移植后的胰島細(xì)胞生成胰島素［57］。最近一項研究表明，另一PxIxIT多肽衍生序列ZIZIT多肽亦可顯著抑制CaN對NFATc脫磷酸化，其對CaN的親和力較VI?VIT多肽提升了10倍［58］。

3.2NCl3

NCI3是一種吡唑并嘧啶衍生物，可干擾CaNNFATc信號通路。體外實驗，顯示NCI3不抑制CaN活性。但在初級人類T細(xì)胞中，NCI3抑制NFATc脫磷酸化和核轉(zhuǎn)入，以及IL-2基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖。體外實驗顯示NCI3能部分干擾CaN與VIVIT寡肽結(jié)合，由此推測可能是NCI3結(jié)合于CaN后引起CaN構(gòu)型變化，從而干擾NFATc脫磷酸化［59］。NCI3對催化NFATc磷酸化的激酶，cAMP依賴性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），無明顯影響。此外，NCI3對NF-κB途徑也有部分抑制作用。在Jurkat細(xì)胞中進(jìn)行的報告基因研究顯示，NCI3抑制NFATc-熒光素酶報告基因的IC50為2 μmol·L-1，而抑制NF-κB-熒光素酶報告基因的IC50為7 μmol·L-1。NCI3的這些效應(yīng)均能被CaN過表達(dá)消除［59］。

表2　直接抑制鈣調(diào)磷酸酶（CaN）活性的抑制劑

3.3lNCA-6

NFATc-CaN相互作用抑制劑6（inhibitors of NFATc-calcineurin association 6，INCA-6）是在篩選NFATc-CaN相互作用的抑制劑中獲得的一種三苯烯類有機(jī)小分子化合物，分子式為9，10-二氫-9，10［1′，2′］-二三苯烯基-1，4-二酮。INCA-6能可逆共價地與CaN的殘基Cys266結(jié)合，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)改變，掩蓋了其序列上的NFATc和VIVIT肽的結(jié)合位點，選擇性地干擾CaN與NFATc的相互作用，但不影響其他底物的脫磷酸化。在離子霉素（iono?mycin）-刺激的Cl.7W2小鼠T細(xì)胞實驗中，INCA-6抑制NFATc脫磷酸化，核轉(zhuǎn)入，以及IFN-γ和TNFα的表達(dá)［60］。但是，所有的INCA化合物都已被報道有普通的細(xì)胞毒性，排除了它們在初級細(xì)胞中應(yīng)用的可能性［61］。

CaN-NFAT相互作用抑制劑的作用模式和抑制效應(yīng)見表3。這類新型的抑制劑特異性抑制CaN 與NFATc的相互作用，而不影響CaN對其他靶標(biāo)蛋白的脫磷酸化活性，具有更高的選擇性和專一性。因此，這類新型的抑制劑將會有較小的毒副作用。

表3　特異性干擾鈣調(diào)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子（CaN-NFAT）相互作用抑制劑

4　展望

CaN是人體免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵酶，其最重要的靶標(biāo)蛋白是NFATc。近年來，在開發(fā)CsA和FK506衍生物方面已取得了可喜的進(jìn)展，如CsA衍生物VCS具有與CyPA更高的親和能力，可大幅減少用藥量，從而降低藥物的毒性。目前VCS不僅已用于牛皮癬患者臨床治療，而且在眼色素層炎患者治療中也已開始使用［63］。匹美克莫司是FK506衍生物，與FK506相比具有更好的親脂性，對皮膚有更好的親和力，用藥后引起全身性免疫應(yīng)答輕微，但長期使用這類藥物仍會有較嚴(yán)重的副作用如腎毒性和神經(jīng)毒性［64］。如何減少CsA和FK506及其衍生物的副作用是臨床上一個重要的研究課題。

引起CsA和FK506類藥物副作用的原因目前仍不清楚，目前在基礎(chǔ)研究中已發(fā)現(xiàn)一些CaN直接抑制劑如槲皮素和山奈酚，它們直接抑制CaN而不需要輔助蛋白，具有低毒性［38，41］。槲皮素不僅可直接抑制CaN活性，還對人體肝、腎具有保護(hù)作用［40］。而在基礎(chǔ)研究中已發(fā)現(xiàn)的特異性干擾CaN-NFATc相互作用抑制劑如11R-VIVIT多肽和NCI3能特異性抑制NFATc而不影響CaN對其他靶標(biāo)蛋白的脫磷酸化活性，具有更好的選擇性［57，59］。開發(fā)新的選擇性更高、副作用更小的CaN-NFATc抑制劑將是今后免疫抑制劑發(fā)展的重要方向之一。

［1］ Shibasaki F，Hallin U，Uchino H.Calcineurin as a multifunctional regulator［J］.J Biochem，2002， 131（1）：1-15.

［2］ Hudson MB，Price SR.Calcineurin：a poorly un?derstood regulator of muscle mass［J］.Int J Bio?chem Cell B，2013，45（10）：2173-2178.

［3］ Ke HM，Huai Q.Structures of calcineurin and its complexes with immunophilins-immunosuppres?sants［J］.Biochem Biophs Res Comm，2003，311（4）：1095-1102.

［4］ Li HM，Rao A，Hogan PG.Interaction of calcineu?rin with substrates and targeting proteins［J］. Trends Cell Biol，2011，21（2）：91-103.

［5］Klee CB，Ren H，Wang XT.Regulation of the calmodulin-stimulated protein phosphatase，calci?neurin［J］.J Biol Chem，1998，273（22）：13367-13370.

［6］ Tu LH，Liu HP，Luo J.A new family of regulators of calcineurin（RCANs）［J］.Prog Biochem Bio?phys，2010，37（1）：22-28.

［7］Rao A，Luo C，Hogan PG.Transcription factors of the NFAT family：regulation and function［J］. Annu Rev Immunol，1997，15：707-747.

［8］ Graef IA，Chen F，Chen L，Kuo A，Crabtree GR. SignalstransducedbyCa2+/calcineurinand NFATc3/c4 pattern the developing vasculature ［J］.Cell，2001，105（7）：863-875.

［9］Okamura H，Aramburu J，Garcia-Rodriguez C，Viola JPB，Raghavan A，Tahiliani M，et al.Con?certeddephosphorylationofthetranscription factor NFAT1 induces a conformational switch that regulates transcriptional activity［J］.Mol Cell，2000，6（3）：539-550.

［10］ Macian F.NFAT Proteins：key regulators of T-cell development and function［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（6）：472-484.

［11］Serfling E，Berberich-Siebelt F，Chuvpilo S，Jankevics E，Klein-Hessling S，Twardzik T，et al. The role of NF-AT transcription factors in T cell activation and differentiation［J］.Biochim Bio?phys Acta，2000，1498（1）：1-18.

［12］ Gal M，Li S，Luna RE，Takeuchi K，Wagner G. The LxVP and PxIxIT NFAT motifs bind jointly to overlapping epitopes on calcineurin′s catalytic domain distant to the regulatory domain［J］.Struc?ture，2014，22（7）：1016-1027.

［13］Li HM，Zhang L，Rao A，Harrison SC，Hogan PG.Structure of calcineurin in complex with PVI?VIT peptide：portrait of a low-affinity signalling in?teraction［J］.J Mol Biol，2007，369（5）：1296-1306.

［14］Sugimoto T，Stewart S，Guan KL.The calcium/ calmodulin-dependent protein phosphatase calci?neurin is the major Elk-1 phosphatase［J］.J Biol Chem，1997，272（47）：29415-29418.

［15］ Dolmetsch RE，Xu KL，Lewis RS.Calcium oscilla?tions increase the efficiency and specificity of gene expression［J］.Nature，1998，392（6679）：933-936.

［16］ AlzuherriH， Chang KC.Calcineurin activates NF-kappa B in skeletal muscle C2C12 cells［J］. Cell Signal，2003，15（5）：471-478.

［17］ Liu QH，Busby JC，Molkentin JD.Interaction be?tween TAK1-TAB1-TAB2 and RCAN1-calcineurin defines a signalling nodal control point［J］.Nat Cell Biol，2009，11（2）：154-U193.

［18］ Ninomiya-Tsuji J，Kishimoto K，Hiyama A，Inoue J，Cao ZD，Matsumoto K.The kinase TAK1 can acti?vate the NIK-I kappa B as well as the MAP kinase cascadeintheIL-1signallingpathway［J］. Nature，1999，398（6724）：252-256.

［19］ Crabtree GR，Olson EN.NFAT signaling：choreo?graphing the social lives of cells［J］.Cell，2002，109：S67-S79.

［20］ Taylor AL，Watson CJE，Bradley JA.Immunosup?pressive agents in solid organ transplantation：mechanisms of action and therapeutic efficacy ［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2005，56（1）：23-46.

［21］ Maged M，El-Batawy Y，Bosseila MAW，Mashaly HM，Hafez VSGA.Topical calcineurin inhibitors in atopic dermatitis：a systematic review and metaanalysis［J］.J Dermatol Sci，2009，54（2）：76-87.

［22］ Guitard J，Rostaing L，Kamar N.New-onset dia?betes and nephropathy after renal transplantation ［J］.Contrib Nephrol，2011，170：247-255.

［23］Rezzani R.Exploring cyclosporine A-side effects and the protective role-played by antioxidants：the morphological and immunohistochemical studies ［J］.Histol Histopathol，2006，21（3）：301-316.

［24］ LiuJ，F(xiàn)armerJD，LaneWS，F(xiàn)riedmanJ，Weissman L，Schreiber SL.Calcineurin is a common target ofcyclophilin-cyclosporinAand FKBP-FK506 complexes［J］.Cell，1991，66（4）：807-815.

［25］ Ke HM，Huai Q.Structures of calcineurin and its complexes with immunophilins-immunosuppres?sants［J］.Biochem Biophs Res Comm，2003，311（4）：1095-1102.

［26］ Rodriguez A，Roy J，Martinez-Martinez S，Lopez-Maderuelo MD，Nino-Moreno P，Orti L，et al.A conserved docking surface on calcineurin medi?ates interaction with substrates and immunosup?pressants［J］.Mol Cell，2009，33（5）：616-626.

［27］ Li PM，Zhang M，Zhang XL.Progress in research of the novel calcineurin inhibitor voclosporin［J］. Chin J New Drugs（中國新藥雜志），2013，22 （24）：2841-2846.

［28］ Birsan T，Dambrin C，F(xiàn)reitag DG，Yatscoff RW，MorrisRE.Thenovelcalcineurininhibitor ISA247：a more potent immunosuppressant than cyclosporine in vitro［J］.Transplant Int，2004，17 （12）：767-771.

［29］ Naidoo P，Rambiritch V.Voclosporin（ISA247）for plaque psoriasis［J］.Lancet，2008，372（9642）：888-889.

［30］ Liu J，Albers MW，Wandless TJ，Luan S，Alberg DG，Belshaw PJ，et al.Inhibition of T-cell signal?ing by immunophilin ligand complexes correlates with loss of calcineurin phosphatase-activity［J］. Biochemistry，1992，31（16）：3896-3901.

［31］Sinclair PJ，Wong F，Staruch MJ，Wiederrecht G，Parsons WH，Dumont F，et al.Preparation and in vitro activities of naphthyl and indolyl ether derivatives of the FK-506 related immunosuppres?sive macrolide ascomycin［J］.Bioorg Med Chem Lett，1996，6（18）：2193-2196.

［32］ Zheng XJ，Ren XF，Chen G，Tao LM，Xiong SD，Wang Y.The biological activities of a novel immu?nosuppressive agent FK520［J］.Curr Immunol（現(xiàn)代免疫學(xué)），2007，27（1）：7-11.

［33］ Stuetz A，GrassbergerM，MeingassnerJG. Pimecrolimus（Elidel，SDZ ASM 981）-preclinical pharmacologic profile and skin selectivity［J］. Semin Cutan Med Surg，2001，20（4）：233-241.

［34］ Kang CB，Ye H，Dhe-Paganon S，Yoon HS.FKBP Family proteins：immunophilins with versatile bio?logical functions［J］.Neurosignals，2008，16 （4）：318-325.

［35］Fruman DA，Klee CB，Bierer BE，Burakoff SJ. Calcineurin phosphatase-activity in lymphocytes-T is inhibited by FK-506 and cyclosporine-A［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（9）：3686-3690.

［36］ Aspeslet L，F(xiàn)reitag D，Trepanier D，Abel M，Naicker S，Kneteman N，et al.ISA（TX）247：a novelcalcineurininhibitor［J］.TransplantP，2001，33（1-2）：1048-1051.

［37］ Grassberger M，Baumruker T，Enz A，Hiestand P，Hultsch T，Kalthoff F，et al.A novel anti-inflam?matory drug，SDZ ASM 981，for the treatment of skin diseases：in vitro pharmacology［J］.Br J Dermatol，1999，141（2）：264-273.

［38］ Wang H，Zhou CL，Lei H，Wei Q.Inhibition of cal?cineurin by quercetin in vitro and in Jurkat cells ［J］.J Biochem，2010，147（2）：185-190.

［39］ Lei H，Luo J，Tong L，Peng LQ，Qi Y，Jia ZG，et al.Quercetin binds to calcineurin at a similar region to cyclosporin A and tacrolimus［J］.Food Chem，2011，127（3）：1169-1174.

［40］Wu LP，Li QX.Protective effects of quercetin on nephrotoxicity induced by cyclosporine A in rats ［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther（中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)），2007，12（6）：659-662.

［41］Wang H，Zhou CL，Lei H，Zhang SD，Zheng JQ，Wei Q.Kaempferol：a new immunosuppres?sant of calcineurin［J］.Iubmb Life，2008，60 （8）：549-554.

［42］ Lee S，Kim YJ，Kwon S，Lee Y，Choi SY，Park J，et al.Inhibitory effects of flavonoids on TNF-alphainduced IL-8 gene expression in HEK 293 cells ［J］.Bmb Rep，2009，42（5）：265-270.

［43］ ErdmannF，WeiwadM，KilkaS，KaranikM，Patzel M，Baumgrass R，et al.The novel calcineurin inhibi?tor CN585 has potent immunosuppressive proper?ties in stimulated human T cells［J］.J Biol Chem，2010，285（3）：1888-1898.

［44］ Sagoo JK，F(xiàn)ruman DA，Wesselborg S，Walsh CT，Bierer BE.Competitive inhibition of calcineurin phosphatase activity by its autoinhibitory domain ［J］.Biochem J，1996，320：879-884.

［45］ Terada H，Matsushita M，Lu YF，Shirai T，Li ST，Tomizawa K，et al.Inhibition of excitatory neuro?nal cell death by cell-permeable calcineurin autoin?hibitory peptide［J］.J Neurochem，2003，87（5）：1145-1151.

［46］Gualberto A，Marquez G，Carballo M，Young?blood GL，Hunt SW，Baldwin AS，et al.p53 transactivation of the HIV-1 long terminal repeat is blocked by PD 144795，a calcineurin-inhibitor with anti-HIV properties［J］.J Biol Chem，1998，273（12）：7088-7093.

［47］Baba Y，Hirukawa N，Tanohira N，Sodeoka M. Structure-based design of a highly selective cata?lytic site-directed inhibitor of Ser/Thr protein phos?phatase 2B（calcineurin）［J］.J Am Chem Soc，2003，125（32）：9740-9749.

［48］ Baumgrass R，Zhang YX，Erdmann F，Thiel A，Weiwad M，Radbruch A，et al.Substitution in po?sition 3 of cyclosporin A abolishes the cyclophilinmediated gain-of-function mechanism but not im?munosuppression［J］.J Biol Chem，2004，279 （4）：2470-2479.

［49］ Prescott TAK，Panaretou B，Veitch NC，Simmonds MSJ.A yeast chemical genetics approach identi?fies the compound 3，4，5-trimethoxybenzyl iso?thiocyanate as a calcineurin inhibitor［J］.Febs Lett，2014，588（3）：455-458.

［50］Cen JR，Shi MS，Yang YF，F(xiàn)u YX，Zhou HL，Wang MQ，et al.Isogarcinol is a new immunosup?pressant［J］.PLoS One，2013，8（6）：e66503.

［51］ Ogasawara Y，Yoshida J，Shiono Y，Miyakawa T，Kimura K.New eremophilane sesquiterpenoid compounds，eremoxylarins A and B directly inhibit calcineurin in a manner independent of immu?nophilin［J］.J Antibiot，2008，61（8）：496-502.

［52］ Baumgrass R，Weiwad M，Erdmann F，Liu JO，Wunderlich D，Grabley S，et al.Reversible inhibi?tion of calcineurin by the polyphenolic aldehyde gossypol［J］.J Biol Chem，2001，276（51）：47914-47921.

［53］ Brill GM，Premachandran U，Karwowski JP，Henry R，Cwik DK，Traphagen LM，et al.Dibefurin，a nov?el fungal metabolite inhibiting calcineurin phospha?tase activity［J］.J Antibiot，1996，49（2）：124-128.

［54］Perrino BA.Regulation of calcineurin phospha?tase activity by its autoinhibitory domain［J］. ArchBiochemBiophys，1999，372（1）：159-165.

［55］ AramburuJ，Garcia-CozarF，RaghavanA，Okamura H，Rao A，Hogan PG.Selective inhibition of NFAT activation by a peptide spanning the calcineurin targeting site of NFAT［J］.Mol Cell，1998，1（5）：627-637.

［56］Aramburu J，Yaffe MB，Lopez-Rodriguez C，Cantley LC，Hogan PG，Rao A.Affinity-driven peptide selection of an NFAT inhibitor more selective than cyclosporin A［J］.Science，1999，285（5436）：2129-2133.

［57］ Kuriyama M，Matsushita M，Tateishi A，Moriwaki A，Tomizawa K，Ishino K，et al.A cell-permeable NFAT inhibitor peptide prevents pressure-overload cardiac hypertrophy［J］.Chem Biol Drug Design，2006，67（3）：238-243.

［58］ Qian ZQ，Dougherty PG，Liu T，Oottikkal S，Hogan PG，Hadad CM，et al.Structure-based optimiza?tion of a peptidyl inhibitor against calcineurin-nu?clear factor of activated T cell（NFAT）interaction ［J］.J Med Chem，2014，57（18）：7792-7797.

［59］Sieber M， Karanik M， Brandt C， Blex C，Podtschaske M，Erdmann F，et al.Inhibition of calcineurin-NFAT signaling by the pyrazolopyrimi?dine compound NCI3［J］.Eur J Immunol，2007，37（9）：2617-2626.

［60］ Roehrl MHA，Kang SH，Aramburu J，Wagner G，Rao A，Hogan PG.Selective inhibition of calci?neurin-NFAT signaling by blocking protein-protein interaction with small organic molecules［J］.Proc NatlAcadSciUSA，2004，101（20）：7554-7559.

［61］ Kang SH，Li HM，Rao AJ，Hogan PG.Inhibition ofthecalcineurin-NFATinteractionbysmallorganic molecules reflects binding at an allosteric site ［J］.J Biol Chem，2005，280（45）：37698-37706.

［62］ Mulero MC，Aubareda A，Orzaez M，Messeguer J，Serrano-Candelas E，Martinez-Hoyer S，et al. Inhibiting the calcineurin-NFAT（nuclear factor of activated T cells）signaling pathway with a regula?tor of calcineurin-derived peptide without affecting general calcineurin phosphatase activity［J］.J Biol Chem，2009，284（14）：9394-9401.

［63］Schultz C.Voclosporin as a treatment for nonin?fectious uveitis［J］.Ophthalmol Eye Dis，2013，5：5-10.

［64］Ling SY，Huizinga RB，Mayo PR，F(xiàn)reitag DG，Aspeslet LJ，F(xiàn)oster RT.Pharmacokinetics of voclosporin in renal impairment and hepatic im?pairment［J］.J Clin Pharmacol，2013，53（12）：1303-1312

（本文編輯：賀云霞）

Signaling pathway inhibitors of calcineurin-nuclear factor of activated T cells：research progress

WU Peng-fei，LIU Jun-lin，CUI Zhi-feng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Calcineurin（CaN）serves as a key enzyme in human immune regulation.The most important target of this enzyme is the transcription factors of nuclear factors of activated T cells （NFATc）.The discovery of the immunosuppressive function of CaN inhibitors（CNIs），ciclosporin A （CsA）and tacrolimus（FK506），has helped overcome the immune rejection of organ transplantion and changed organ transplantion fundamentally.Both of these drugs are still widely used in clinical and basic research，but their therapeutic effects are limited by their serious side effects，including renal tox?icity and neurotoxicity.Therefore，the development of new CNIs with higher specificity and fewer side effects in the clinic is a focus of research.In this paper，the newly discovered and synthesized CNIs in recent decades，including the CsA and FK506 derivatives，direct inhibitors of CaN，as well as the inhibitors that specifically interfere with CaN-NFATc interaction，were summarized.

calcineurin；nuclear factor of activated T cells；immunosuppressants；ciclosporin A；tacrolimus

Fourdation item：The project supported by Scientific Research Foundation of Zhejiang Province（LY12C14008）

Tel：（0571）88320741，E-mail：zfcui@zjut.edu.cn

R966

A

1000-3002-（2016）04-0397-08

浙江省自然科學(xué)基金（LY12C14008）

吳鵬飛，男，碩士研究生，主要從事酶抑制劑的篩選和研究。

崔志峰，E-mail：zfcui@zjut.edu.cn，Tel：0571-88320741

2015-03-02接受日期：2015-05-27）