黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠胸腺指數、脾指數及脾T淋巴細胞增殖的影響

孫向婉，王　蕓，王　鑫，劉曉曄，穆　祥*，董　虹*

(1.北京農學院 獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，北京 100193)

?

黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠胸腺指數、脾指數及脾T淋巴細胞增殖的影響

孫向婉1，王蕓1，王鑫1，劉曉曄2，穆祥1*，董虹1*

(1.北京農學院 獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，北京 100193)

摘要：旨在研究黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠免疫功能的影響。利用環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，檢測黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠胸腺指數、脾指數和脾T淋巴細胞增殖的影響。通過高效液相色譜技術(HPLC)檢測白術發(fā)酵前后的有效成分變化。并通過正交試驗篩選了提高白術有效成分含量的最佳發(fā)酵條件。試驗結果表明：(1)黑曲霉發(fā)酵后的白術能有效提高小鼠免疫功能，其中發(fā)酵白術低、中、高劑量(0.5、1、2 g·kg-1)均能顯著提高胸腺指數(P<0.05)；而中劑量發(fā)酵白術能顯著提高脾指數及小鼠脾T淋巴細胞增殖(P<0.05)；(2)HPLC檢測黑曲霉菌發(fā)酵白術后白術內酯Ⅰ的含量升高；(3)確立提高有效成分白術內酯Ⅰ含量的最佳發(fā)酵條件為接菌量8%，含水量40%，發(fā)酵時間96 h，此條件下白術內酯Ⅰ含量是原來的1.4倍。試驗進一步揭示黑曲霉發(fā)酵白術可通過發(fā)酵后白術內酯Ⅰ含量的升高來增強小鼠免疫功能。

關鍵詞：黑曲霉；發(fā)酵白術；免疫功能；白術內酯I

白術為菊科植物白術(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根莖，是臨床常用的重要中藥之一，其性甘、苦、溫，具有健脾益氣、燥濕利水等功效[1]。白術的藥理作用有抗腫瘤、抗菌、消炎和調節(jié)免疫功能等[2]，其有效成分為揮發(fā)油、內酯類成分、苷類等。內酯類為白術主要有效成分[3]，其中白術內酯Ⅰ具有健脾[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]等廣泛的藥理作用，而不同的炮制方式對白術內酯Ⅰ含量也有一定影響[7]。黑曲霉(Aspergillusniger)作為被允許添加到飼料中的微生物之一，能夠合成和分泌多種酶類，如水解酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶，纖維素酶和丹寧酸酶[8]，而其中的果膠酶、纖維素酶類都可用來降解植物細胞壁，從而利于植物細胞中有效成分的析出。

中藥發(fā)酵作為中藥的一種炮制方式，正是借助于微生物及其代謝產物酶的分解轉化作用，在一定的環(huán)境條件下(如溫度、濕度、空氣、水分等)，通過微生物的發(fā)酵，改變其原有性能，增強或產生新的功效，擴大用藥品種，以適應臨床用藥的需要[9-11]。隨著發(fā)酵中藥技術的發(fā)展，高效利用中藥成為中藥制品研發(fā)的新準則，其中利用中藥發(fā)酵作為飼料添加劑的使用不僅可以節(jié)省成本，也可提高動物的生長性能和免疫功能[12-14]。本試驗目的在于探究黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠部分免疫指標的影響，可初步為發(fā)酵白術對免疫力方面的影響提供依據；分析白術發(fā)酵前后其有效成分白術內酯Ⅰ的變化，可進一步從白術發(fā)酵后其成分變化的角度揭示藥效提高的內在機制；最后利用正交試驗篩選提高白術內酯Ⅰ含量的最優(yōu)發(fā)酵條件，從而優(yōu)化白術的發(fā)酵工藝，得到高效安全的產物，同時也提供了一種提高其有效成分白術內酯Ⅰ含量的新思路，具有一定的臨床參考意義。

1材料與方法

1.1試驗動物

昆明小鼠，清潔級，雌性，18～22 g，購于北京市興隆動物養(yǎng)殖場。

1.2主要儀器與試劑

多功能酶標儀(BIOTEK，型號SYNERGY4)，超凈工作臺(哈爾濱東聯電子技術開發(fā)有限公司，型號：DL-CF-ⅠND)，全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海上登實驗設備有限公司，型號：HZQ160)，CO2培養(yǎng)箱(SANYO，型號：MC0217AC)，高壓液相色譜儀(型號：Waters e2695)，恒溫干燥箱(上海一恒科技有限公司，型號：DK-8D)。白術內酯Ⅰ購于中國食品藥品檢定研究院(純度>99.99%，批號：111975-201501)，白術藥材購于北京同仁堂。甲醇、乙腈為色譜純，購于上海賽默飛世爾科技有限公司，其余試劑均為分析純。黑曲霉(ATCC16404)購于上海復祥生物有限公司。RPMI-1640購于Gibco公司。3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(噻唑藍，MTT)購于Sigma公司。刀豆蛋白(ConA)購于Stanta Cruz。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)購于Sigma 公司。

1.3發(fā)酵白術的制備及其對小鼠免疫功能的影響

1.3.1發(fā)酵菌種制備將黑曲霉標準菌種接種在馬鈴薯固體培養(yǎng)基[15]，于28 ℃ 培養(yǎng)3 d，然后將活化后的黑曲霉用適量無菌蒸餾水溶解菌落，制成孢子懸液，取4 mL(濃度為1×108個·mL-1)轉接于100 mL液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，即可用于接種發(fā)酵。

1.3.2發(fā)酵白術制備稱取兩份粉碎處理的白術藥材20 g于500 mL錐形瓶，121 ℃ 高壓滅菌20 min。一份作為對照，另一份作為發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入滅菌蒸餾水10 mL，取活化好的黑曲霉菌液2 mL于無菌條件下接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)96 h，然后于50 ℃烘干儲存。

1.3.3動物分組處理與給藥將60只18～22 g雌性昆明小鼠隨機分為6組，每組10只：A空白對照組、B模型組、C未發(fā)酵白術組，D、E、F分別為發(fā)酵白術低劑量、中劑量、高劑量組。適應性喂養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)于溫室內，飼養(yǎng)溫度(20±1) ℃，濕度45%～55%，光照12 h，基礎顆粒飼料飼喂，自由取食，飲水。藥物以蒸餾水溶解，每只各灌胃0.4 mL。按照表1進行分組喂養(yǎng)連續(xù)灌胃相應藥物7 d，第8天除空白對照組外，每組小鼠均釆用腹腔注射的方法，注入環(huán)磷酰胺(Cy)50 mg·kg-1(0.4 mL·只-1·d-1)，連續(xù)注射3 d，制造免疫抑制模型[16]。第11 天進行免疫功能相關指標檢測。

表1　小鼠免疫功能檢測試驗分組及處理

UAMK.Un-fermentedAtractylodesmacrocephalaKoidz；FAMK.FermentedAtractylodesmacrocephalaKoidz；Cy.Cyclophosphamide

1.3.4免疫器官指數測定取小鼠脾和胸腺稱重，按照以下公式計算：

臟器指數= 臟器質量(mg)/動物質量(g)1.3.5小鼠脾細胞懸液的制備及脾T淋巴細胞增殖測定采用MTT 法，將上述分組小鼠無菌取脾，經過研磨，200目細胞篩網過濾，PBS重懸，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀加入適量紅細胞裂解液，1 500 r·min-1離心10 min，PBS洗滌2次，制得單細胞懸液，最后用含10%小牛血清RPMI-1640調細胞濃度5×106·mL-1，并用臺盼藍染色檢測細胞活力大于95%。將細胞接種于96孔板(100 μL·孔-1)，并于每孔加入10 μL ConA刺激(終濃度為5 μg·mL-1)，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，紫色結晶完全溶解后于酶標儀570 nm測定OD值。

1.4HPLC對比分析白術發(fā)酵前后有效成分白術內酯Ⅰ變化

選擇Waters e2695色譜柱 250×4.6 mm，5 μm；流動相水(A)-乙腈(B)梯度洗(0～16 min，60%～76%A)，流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長250 nm；進樣量20 μL。

1.4.1對照品溶液制備精密稱取白術內酯Ⅰ 1 mg，加甲醇制成含白術內酯Ⅰ 0.05 mg·mL-1的對照品溶液。

1.4.2供試品溶液制備精密稱量黑曲霉發(fā)酵樣品1 g，置于磨口錐形瓶中，加甲醇5 mL，超聲提取45 min，離心(3 000 r·min-1)10 min，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，得供試品溶液備用。未發(fā)酵的樣品同法制備。

1.4.3色譜條件的方法學考察利用HPLC對上述色譜條件進行線性關系、精密度、穩(wěn)定性、重現性、加樣回收率試驗考察。具體方法如下：精確吸取對照品溶液5、10、20、30、40 μL分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，以白術內酯Ⅰ為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線，得線性回歸方程。 對同一對照品白術內酯Ⅰ溶液，濃度為0.05 mg·mL-1，連續(xù)6次進樣，計算指標成分峰面積的RSD，考察精密度。同一樣品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進樣，計算指標成分峰面積的RSD，考察穩(wěn)定性。取同一白術樣品粉末，精密稱取5份約0.5 g，按照“供試品溶液制備”項下的規(guī)定操作，計算指標成分峰面積的RSD，考察重復性。精密稱取已知含量的白術粉末0.5 g，共6份，按“供試品溶液的制備”項下進行處理，每份各取1.1 mL分別加入濃度為0.5 mg·mL-1的標準品白術內酯Ⅰ 10 μL，計算回收率 。

1.5發(fā)酵條件的篩選

選取時間、含水量和接菌量3個條件進行三因素三水平的正交試驗，以此來篩選提高白術主要有效成分白術內酯Ⅰ含量的發(fā)酵條件。稱取60 ℃條件下烘干的白術藥材粉末1 g (粉碎后過40目篩)，分別放入50 mL的三角錐形瓶中，121 ℃ 高壓滅菌20 min。采用L9(33)正交設計表，按表2所示的條件下，接入活化好的黑曲霉菌進行發(fā)酵。同時，設置一個未發(fā)酵白術的處理作為比較。利用HPLC測定不同條件處理下白術中白術內酯Ⅰ含量。

表2　影響白術內酯Ⅰ含量的發(fā)酵因素水平表

1.6數據處理與分析

2結果

2.1發(fā)酵白術對小鼠免疫功能的影響

2.1.1發(fā)酵白術對小鼠免疫器官指數的影響由圖1可知，模型組小鼠脾指數、胸腺指數均極顯著低于空白對照組(P<0.01)，表明免疫抑制模型制備成功。與模型組相比，中劑量發(fā)酵白術可以顯著提高脾指數(P<0.05)，而未發(fā)酵白術與其他劑量的發(fā)酵白術組、模型組相比差異不顯著(P>0.05)(A)；發(fā)酵中藥三個低、中、高劑量均可以顯著提高胸腺指數(P<0.05或P<0.01)，而未發(fā)酵白術與其相比沒有差異(P>0.05)(B)。此結果說明發(fā)酵白術可以提高免疫抑制小鼠免疫器官指數，有助于提高免疫抑制小鼠的免疫功能。

A.脾指數；B.胸腺指數；與對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01A.Spleen index；B.Thymus index；Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.01；Compared with model，#.P<0.05，##.P<0.01圖1　發(fā)酵白術對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響Fig.1　Effect of fermented Atractylodes macrocephala Koidz on spleen and thymus index of immunosuppressive mice

2.1.2發(fā)酵白術對小鼠脾T淋巴細胞增殖的影響由圖2可知，免疫抑制模型組小鼠T淋巴細胞增殖顯著低于空白組(P<0.05)，表明免疫抑制模型制備成功。與模型組相比，中劑量發(fā)酵白術和未發(fā)酵白術可明顯提高T淋巴細胞增殖(P<0.05)，且與空白組相比差異不顯著。說明中劑量發(fā)酵白術可以提高免疫抑制小鼠脾T淋巴細胞增殖，從而提高其免疫功能。

與對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與模型組相比，#.P<0.05，##.P<0.01Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.01；Compared with model，#.P<0.05，##.P<0.01圖2　發(fā)酵白術對免疫抑制小鼠T淋巴細胞增殖能力的影響Fig.2　Effect of fermented Atractylodes macrocephala Koidz on the T lymphocyte transformation rate of immunosuppressive mice

2.2白術發(fā)酵前后有效成分變化

2.2.1HPLC圖譜采用HPLC初步考察了黑曲霉發(fā)酵白術前后有效成分的變化，試驗中對未發(fā)酵白術(圖3B)和發(fā)酵白術(圖3C)保留時間一致的峰進行監(jiān)測分析，通過標準品對照(圖3A)，結果發(fā)現白術內酯Ⅰ含量有所增加。

A.白術內酯Ⅰ標準品；B.未發(fā)酵白術；C.發(fā)酵白術；D.發(fā)酵白術和未發(fā)酵白術含量比較A.HPLC chromatogram of atractylenolide Ⅰ；B.HPLC chromatogram of Atractylodes macrocephala Koidz；C.HPLC chromatogram of fermented Atractylodes macrocephala Koidz；D.The atractylenolide Iof raw Atractylodes macrocephala Koidz and fermented Atractylodes macrocephala Koidz圖3　黑曲霉發(fā)酵白術與未發(fā)酵白術中白術內酯Ⅰ圖譜Fig.3　HPLC chromatogram of atractylenolide Ⅰ in Atractylodes macrocephala Koidz fermented with Aspergillus niger and without fermentation

2.2.2色譜條件的方法學考察結果按“1.4.3”中所描述的方法，得線性回歸方程：y=2 421 038x-20 208，R2=0.999 9，結果表明白術內酯Ⅰ線性范圍在0.25～2 μg；精密度 RSD為0.11%，表明精密度良好；穩(wěn)定性RSD 為1.02%，結果表明樣品在12 h內穩(wěn)定；重復性 RSD 為2.5%，表明重現性良好。加樣回收率試驗得白術內酯Ⅰ平均回收率為99.46%，RSD 為0.56%(表3)。

表3　白術內酯Ⅰ加樣回收率測定結果

2.3提高白術內酯Ⅰ含量的發(fā)酵條件篩選

為了獲得提高白術中白術內酯Ⅰ含量的發(fā)酵條件，采用正交試驗法研究各因素及其水平組合對其白術內酯Ⅰ含量的影響。按照白術發(fā)酵條件，以表2對應的因素水平進行發(fā)酵，并利用“2.2”中HPLC確立的色譜條件及方法測定白術內酯Ⅰ含量。由表4正交結果表明，最終確定提高白術內酯Ⅰ含量的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C2，即接菌量8%，含水量40%，時間96 h，此條件下白術內酯Ⅰ含量最高。經極差分析，RB=0.07>RC=0.027>RA=0.025，影響因素大小順序為B>C>A。同時測得的未經發(fā)酵處理白術的白術內酯Ⅰ含量為0.122 mg·g-1，由最佳發(fā)酵條件處理的發(fā)酵白術的白術內酯Ⅰ含量為0.172 mg·g-1，即白術在該條件發(fā)酵后，白術內酯Ⅰ含量是原來的1.4倍。

表4　正交試驗白術內酯Ⅰ含量直觀分析表

3討論

3.1黑曲霉發(fā)酵白術對小鼠免疫器官指數及脾T淋巴細胞增殖的影響

白術是臨床常用健脾益氣的藥物之一[17]。大量研究表明，白術水煎劑[18-19]、白術多糖[20]、白術復方[21]可提高動物的免疫功能。本研究考察了黑曲霉菌發(fā)酵白術對環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制小鼠免疫器官指數和脾T淋巴細胞增殖的影響，結果表明與模型組相比，發(fā)酵白術低、中、高劑量(0.5，1，2 g·kg-1)均能顯著提高胸腺指數(P<0.05)；中劑量發(fā)酵白術能顯著提高脾指數及小鼠脾T淋巴細胞增殖(P<0.05)；而未發(fā)酵白術(1 g·kg-1)與模型組相比，免疫器官指數沒有差異(P>0.05)，可提高小鼠脾T淋巴細胞增殖(P<0.05)。環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制模型通常會造成免疫器官指數降低，胸腺指數、脾指數可用來評價小鼠的免疫狀況[22]，通過中樞的胸腺指數和脾指數的增長，說明發(fā)酵白術能促進中樞免疫器官的發(fā)育，從而影響小鼠的免疫功能。淋巴細胞是機體主要免疫細胞，T淋巴細胞作為重要免疫細胞之一，參與免疫調節(jié)反應[23]。本試驗發(fā)現未發(fā)酵白術對T淋巴細胞增殖也有一定促進作用，但對免疫器官指數無影響，而中劑量發(fā)酵白術對免疫器官指數提高和T淋巴細胞增值均有促進作用，這充分說明發(fā)酵白術對小鼠免疫功能的影響優(yōu)于未發(fā)酵白術。有文獻報道在免疫調節(jié)方面，六味地黃發(fā)酵液的功效明顯優(yōu)于六味地黃煎劑[24]，玉屏風散發(fā)酵液的功效明顯優(yōu)于玉屏風散煎劑[25]。

3.2黑曲霉發(fā)酵白術對其有效成分白術內酯Ⅰ含量的影響

本試驗另一結果發(fā)現白術經黑曲霉發(fā)酵后，經HPLC分析發(fā)現白術有效成分白術內酯Ⅰ含量有所增加。黑曲霉菌能夠合成和分泌纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶[26]此特點，使得黑曲霉在發(fā)酵白術過程中所產生的酶破壞其細胞壁，進而促使白術活性成分白術內酯Ⅰ的溶出。陶蕾等[27]同樣利用黑曲霉菌的發(fā)酵產生酶類的特點，使用黑曲霉菌發(fā)酵中藥材黃柏，發(fā)現經黑曲霉菌液發(fā)酵過的黃柏中游離態(tài)小檗堿含量與未發(fā)酵相比有所提高。眾多研究闡釋中藥發(fā)酵后藥效增強的主要機制之一很大可能在于微生物發(fā)酵中藥可通過微生物的降解作用，最大限度提取藥物的有效成分和活性物質，并生成新的藥物成分[28-29]。研究表明白術內酯Ⅰ為白術健脾益氣[30]的主要成分，白術內酯Ⅰ可拮抗腫瘤患者體內的免疫抑制作用，提高T淋巴細胞的增殖活性，降低免疫抑制因子的表達，從而激活機體對腫瘤的免疫應答[31-32]。因此發(fā)酵白術可拮抗免疫抑制小鼠免疫功能低下這一現象，原因很大可能在于白術經黑曲霉一定條件發(fā)酵之后其有效成分白術內酯Ⅰ含量升高。本試驗今后會對發(fā)酵過程中白術其他有效成分進行研究分析，更為全面地闡釋發(fā)酵白術提高免疫功能的作用機制。

3.3提高白術內酯Ⅰ含量的發(fā)酵條件篩選

本研究最后通過正交試驗探究了提高白術有效成分白術內酯Ⅰ含量的最佳發(fā)酵條件，發(fā)現不同發(fā)酵條件對白術內酯Ⅰ含量影響不同。說明研究發(fā)酵條件對提高中藥有效成分含量具有重要意義。本試驗最終確定白術發(fā)酵條件為A2B1C2，即黑曲霉接種量8%，含水量40%，時間為96 h，此條件下白術內酯Ⅰ含量最高。經極差分析，RB=0.07>RC=0.027>RA=0.025，影響因素大小順序為B>C>A，同時測得的未經發(fā)酵處理的白術其白術內酯Ⅰ含量為0.122 mg·g-1，由最佳發(fā)酵條件處理的發(fā)酵白術其白術內酯Ⅰ含量為0.172 mg·g-1，可見白術在該條件發(fā)酵后，白術內酯Ⅰ含量是原來的1.4倍。劉雙等[33]在中藥神曲發(fā)酵工藝研究中談到優(yōu)化工藝利于得到安全有效的神曲，更利于建立質量標準。陳富文等[34]從發(fā)酵菌種、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量等因素考察，以高效液相色譜法(HPLC)測定發(fā)酵后醇提液的總峰面積來代表發(fā)酵后總有效化學成分含量，對復方中藥制劑質量評價有一定的參考意義?？梢姡瑑?yōu)化發(fā)酵工藝利于得到安全有效的產物，對中藥在質量方面的評價具有重要意義。

總之，本研究發(fā)現黑曲霉發(fā)酵白術可提高免疫抑制小鼠免疫器官指數及脾T淋巴細胞增殖，優(yōu)于未發(fā)酵組；且白術發(fā)酵后其有效成分白術內酯Ⅰ含量增加，初步闡釋了發(fā)酵白術藥效增加的作用機制可能在于提高了其有效成分的含量；通過正交試驗確定了提高白術內酯Ⅰ的最佳發(fā)酵條件，有利于質量可控，從而有助于發(fā)酵白術臨床藥效的發(fā)揮，為其在臨床上使用提供一定參考依據。

參考文獻(References)：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95.

Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia 2010(the first part)[M].Beijing：China Medical Science Press，2010：95.(in Chinese)

[2]黃海英.白術活性成分的提取、純化及功能性研究[D].南昌：南昌大學，2006.

HUANG H Y.Studies on extraction、purification and function of the active components inAtractylodesmacrocephalaKoidz[D].Nanchang：Nanchang University，2006.(in Chinese)

[3]彭騰，李鴻翔，鄧赟，等.白術內酯類成分及其藥理作用研究進展[J].中國藥房，2012，23(39)：3732-3734.

PENG T，LI H X，DENG Y，et al.Atractylenolide and pharmacological effects studies of Atractylodes Macrocephala Koidz[J].ChinaPharmacy，2012，23(39)：3732-3734.(in Chinese)

[4]李偉，文紅梅，崔小兵，等.白術健脾有效成分研究[J].南京中醫(yī)藥大學學報(自然科學版)，2006，22(6)：366-367.

LI W，WEN H M，CUI X B，et al.Invigorating spleen active ingredient research onAtractylodesmacrocephalaKoidz[J].JournalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine(NaturalScience)，2006，22(6)：366-367.(in Chinese)

[5]WANG C，DUAN H，HE L.Inhibitory effect of atractylenolide I on angiogenesis in chronic inflammationinvivoandinvitro[J].EurJPharmacol，2009，612(1-3)：143-152.

[6]SHAN G S，ZHANG L X，ZHAO Q M，et al.Metabolomic study of raw and processed Atractylodes macrocephala Koidz by LC-MS[J].JPharmBiomedAnal，2014，98：74-84.

[7]潘利文，宋捷.白術內酯Ⅰ體內外的抗黑色素瘤研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2015，35(8)：682-685.

PAN L W，SONG J.Study on inhibiting effects of atractylenolide Ⅰ against melanomainvirtoandinvivo[J].ChineseJournalofHospitalPharmacy，2015，35(8)：682-685.(in Chinese)

[8]PINTO G A S，LEITE S G F，TERZI S C，et al.Selection of tannase-producingAspergillusnigerstrains[J].BrazJMicrobiol，2001，32(1)：24-26.

[9]ZHANG X H，CAO F L，SUN Z Y，et al.Effect of feedingAspergillusniger-fermented Ginkgo biloba-leaves on growth，small intestinal structure and function of broiler chicks[J].LivestSci，2012，147(1-3)：170-180.

[10]王延年，董雪，喬延江，等.中藥發(fā)酵研究進展[J].世界科學技術(中醫(yī)藥現代化)，2010，12(3)：437-441.

WANG Y N，DONG X，QIAO Y J，et al.Fermentation of traditional Chinese medicine[J].WorldScienceandTechnology(ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica)，2010，12(3)：437-441.(in Chinese)

[11]MIYAKE Y，FUKUMOTO S，OKADA M，et al.Antioxidative catechol lignans converted from sesamin and sesaminol triglucoside by culturing with Aspergillus[J].JAgricFoodChem， 2005，53(1)：22-27.

[12]劉觀忠，安勝英，王鳳霞．發(fā)酵中藥對肉仔雞生產性能和血液生化指標的影響[J].飼料工業(yè)，2011，32(23)：47-49.

LIU G Z，AN S Y，WANG F X.Effects of fermented Traditional Chinese Medicines on perfeormance and blood biochemical indices of broilers[J].FeedIndustry，2011，32(23)：47-49.(in Chinese)

[13]秦俊杰．發(fā)酵型黃芪黨參飼料添加劑的評價研究[D].北京：中國農業(yè)科學院，2011.

QIN J J.Study on the evaluation of the fermented feed additive ofAstragalusmembranaceusandCodonopsispilosula[D].Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2011.(in Chinese)

[14]張凱，楊志強，王學智，等.發(fā)酵型黃芪提取物對肉仔雞生產性能及免疫球蛋白的作用研究[J].湖北農業(yè)科學，2011，50(6)：1216-1218.

ZHANG K，YANG Z Q，WANG X Z，et al.Study on effects of fermentedradixAstragalusextraction on growth，immunoglobulin of broiler chicken[J].HubeiAgriculturalSciences，2011，50(6)：1216-1218.(in Chinese)

[15]范秀蓉，李廣武，沈萍.微生物學試驗[M].北京：高等教育出版社，1999.

FAN X R，LI G W，SHEN P.Laboratory experiments in microbiology[M].Bejing：Higher Education Press，1999.(in Chinese)

[16]楊憲勇.應用環(huán)磷酰胺構建C57BL/6J小鼠免疫抑制模型[J].中國組織工程研究，2012，16(40)：7486-7490.

YANG X Y.Establishing a C57BL/6J mouse immunosuppressive model induced by cyclophosphamide[J].ChineseJournalofTissueEngineeringResearch，2012，16(40)：7486-7490.(in Chinese)

[17]陳文，何鴿飛，姜曼花，等.近10年白術的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18(2)：338-340.

CHEN W，HE G F，JIANG M H，et al.Progress onAtractylodesmacrocephalaKoidz in recent five years[J].ShizhenMedicineandMateriaMedicaResearch，2007，18(2)：338-340.(in Chinese)

[18]黃利，李利民，唐麗燕.白術水煎劑對小鼠免疫功能的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28(1)：114-115.

HUANG L，LI L M，TANG L Y.Effect ofAtractylodesmacrocephalaKoidz Decoction on the immune function of mice[J].PharmacologyandClinicsofChineseMateriaMedica，2012，28(1)：114-115.(in Chinese)

[19]LEE J C，LEE K Y，SON Y O，et al.Stimulating effects on mouse splenocytes of glycoproteins from the herbal medicineAtractylodesmacrocephalaKoidz[J].Phytomedicine，2007，14(6)：390-395.

[20]孫文平，李發(fā)勝，陳晨，等.白術多糖對小鼠免疫功能調節(jié)的研究[J]．中國微生態(tài)學雜志，2011，23(10)：881-882，886.

SUN W P，LI F S，CHEN C，et al.Immunomodulation of Atractylodis polysaccharides in mice[J].ChineseJournalofMicroecology，2011，23(10)：881-882，886.(in Chinese)

[21]黃爭榮，王泳，王榕平，等.參苓白術散對荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 的影響[J]．光明中醫(yī)，2010，25(9)：1584-1586.

HUANG Z R，WANG Y，WANG R P，et al.Effect of Shenlinbaizhu Powder on the level of IL-2、IFN-γ、TNF-α in Tumor-bearing Mice[J].GuangmingJournalofChineseMedicine，2010，25(9)：1584-1586.(in Chinese)

[22]趙迎虎，張明軍，劉進輝，等.中藥制劑對小鼠耐力及免疫器官指數影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010(1)：14-17.

ZHAO Y H，ZHANG M J，LIU J H，et al.Effects of traditional Chinese medicine preparation on the endurance and immune organ index in mice[J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，2010(1)：14-17.(in Chinese)

[23]徐占云，秦睿玲，褚耀誠，等.枸杞多糖對雛雞淋巴細胞體外增殖及分泌IL-2的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報，2013，44(2)：322-328.

XU Z Y，QIN R L，CHU Y C，et al.Effects ofLyciumbarbarumpolysaccharide on cell proliferation of chicken lymphocytes and IL-2 excretioninvitro[J]．ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(2)：322-328.(in Chinese)

[24]郭芳，劉秀書，孟祥琴，等.六味地黃發(fā)酵液的免疫調節(jié)作用[J].河北醫(yī)科大學學報，2001，22(2)：72-74.

GUO F，LIU X S，MENG X Q，et al.Immunomodulating activity of fermented decotion of Liuweidihuang[J].JournalofHebeiMedicalUniverisity，2001，22(2)：72-74.(in Chinese)

[25]徐啟華，趙堃，曹軍.玉屏風散發(fā)酵液對免疫抑制小鼠免疫功能的調節(jié)作用[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2006，27(6)：643-646.

XU Q H，ZHAO K，CAO J.The regulating effect of yupingfeng-ferment-product on the immune function of immunosuppressive mice[J].JournalofQiqiharMedicalCollege，2006，27(6)：643-646.(in Chinese)

[26]劉金海.黑曲霉菌在生物發(fā)酵飼料上的應用及其產品對動物抗病力的影響[D].長春，吉林大學，2012.

LIU J H.Applications ofAspergillusNigermedia in biological fermentation feed and effects of its production on animal disease-resistant ability[D].Changchun：Jilin University，2012.(in Chinese)

[27]陶蕾，王宏偉，許冠英，等.黑曲霉發(fā)酵對黃柏中游離態(tài)小蘗堿含量的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011 (2)：41-43.

TAO L，WANG H W，XU G Y，et al.Effect ofAspergillusnigerfermentation on the contents of free berberine in Cortex phellodendri[J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，2011(2)：41-43.(in Chinese)

[28]韓春楊，劉翠艷，牛鐘相．中藥制劑發(fā)酵前后成分的變化及對肉雞部分免疫指標和生長的影響[J]．畜牧獸醫(yī)學報，2005，36(11)：1223-1227.

HAN C Y，LIU C Y，NIU Z X.Component changes of Chinese herb before and after fermentation and the effect on some immune indices and growth performance of broiler chickens[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2005，36(11)：1223-1227.(in Chinese)

[29]安勝英，馬學會，劉觀忠.發(fā)酵中藥添加劑對肉仔雞免疫機能和抗氧化機能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報，2015，46(5)：863-867.

AN S Y，MA X H，LIU G Z.Effects of fermented Chinese herbs on immunty and antioxidants ability of broilers[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(5)：863-867.(in Chinese)

[30]郝延軍，桑育黎，李寶林，等.白術內酯Ⅰ及白術內酯Ⅲ對唾液淀粉酶活性的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(9)：1617-1618.

HAO Y J，SANG Y L，LI B L，et al.Effect of atractylode I、III on saliva amylase activity in rats of diarrhea and spleen deficiency[J].LishizhenMedicineandMateriaMedicaResearch，2006，17(9)：1617-1618.(in Chinese)

[31]熊蘊珠.白術內酯Ⅰ對MyD88+人卵巢癌細胞分泌的免疫抑制因子TGF-β1、IL-17A、IL-10和IL-4的影響[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2014.

XIONG Y Z.The effect of atractylenolide I on immune inhibitory cytokines：TGF-B1、IL-17A、IL-10 and IL-4 secretion of MyD88+ human ovarian cancer cells[D].Chengdu：Chengdu University of TCM，2014.(in Chinese)

[32]王蔥蔥.白術內酯I對MyD88+人卵巢癌細胞的吲哚胺-2，3雙加氧酶(indoleamine-2，3-dioxygenase IDO)的表達及外周血T淋巴細胞增殖活性的影響[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2014.

WANG C C.Atractylenolide I acting on MyD88+ human ovarian cancer cells have an effect on expression of indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)and T lymphocyte proliferation activity in peripheral blood[D].Chengdu：Chengdu University of TCM，2014.(in Chinese)

[33]劉雙，楊靜，江振作，等.中藥“神曲”發(fā)酵工藝及質量標準研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2015，32(5)：318-320.

LIU S，YANG J，JIANG Z Z，et al.Research progress of fermentation technology and quality standard of Shenqu[J].TianjinJournalofTraditionalChineseMedicine，2015，32(5)：318-320.(in Chinese)

[34]陳富文，史高峰，王國英，等.響應面法優(yōu)化復方中藥發(fā)酵工藝[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(4)：73-77.

CHEN F W，SHI G F，WANG G Y，et al.Optimization of fermentation process of compound Chinese Medicine by response surface methodology[J].ChineseJournalofInformationonTraditionalChineseMedicine，2014，21(4)：73-77.(in Chinese)

(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.026

收稿日期：2016-01-21

基金項目：國家自然科學基金(31572558；31272144)；北京市科技新星(Z141105001814041)；北京市農業(yè)科技項目(20150126)

作者簡介：孫向婉(1991-)，女，碩士生，主要從事中藥提高動物免疫機制研究，E-mail：804501313@qq.com *通信作者：董虹，副教授，Tel：010-80799480，E-mail：donghong523@163.com;穆祥，教授，Tel：010-80789515，E-mail：muxiang1109@sina.com

中圖分類號：S853.73

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1502-09

Effect ofAspergillusniger-FermentedAtractylodesmacrocephalaKoidz on the Spleen Index，Thymus Index and T Lymphocyte Proliferation of Mice

SUN Xiang-wan1，WANG Yun1，WANG Xin1，LIU Xiao-ye2，MU Xiang1*，DONG Hong1*

(1.BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversityofAgriculture，Beijing102206，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

Abstract:This study aimed to study the effect of Aspergillus niger-fermented Atractylodes macrocephala Koidz on the immune function of mice.An immunosuppression mice model (cyclophosphamide) was utilize to study the effect of fermented Atractylodes macrocephala Koidz on spleen index，thymus index and T lymphocyte proliferation.High performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze the changes in the active omponents of Atractylodes macrocephala Koidz with or without fermentation by Aspergillus niger.Orthogonal experiment was conducted to select the best conditions.The results showed that：1)The low，middle and high dose groups (0.5，1，2 g·kg-1) of fermented Atractylodes macrocephala Koidz can effectively increase thymus index (P<0.05).In addition，middle dosage group of fermented Atractylodes macrocephala Koidz can effectively increase spleen index and T lymphocyte proliferation (P<0.05)；2) The results of HPLC showed that the content of atractylenolide Ⅰ was effectively increased in the Atractylodes macrocephala Koidz processed by Aspergillus niger compared with unfermented Atractylodes macrocephala Koidz；3) The best fermentation conditions were as follows：inoculum concentration was 8%；water content was 40%；fermentation time was 96 h，under the optimized conditions，the content of atractylenolide Ⅰ was 1.4 times of those in raw Atractylodes macrocephala Koidz.These results indicated that fermented Atractylodes macrocephala Koidz could improve immune function of mice by increasing the content of atractylenolide Ⅰ.

Key words:Aspergillus niger；fermented Atractylodes macrocephala Koidz；immune function；atractylenolide Ⅰ