雞傳染性貧血病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及其在疫苗污染檢測中的應用

任志浩，房立春，欒懷彪，李　陽，王一新，崔治中，?！∷?，趙　鵬

(山東農業(yè)大學動物醫(yī)學院，泰安 271018)

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雞傳染性貧血病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及其在疫苗污染檢測中的應用

任志浩#，房立春#，欒懷彪，李陽，王一新，崔治中，常爽*，趙鵬*

(山東農業(yè)大學動物醫(yī)學院，泰安 271018)

摘要：為了更快速而靈敏地檢測禽弱毒疫苗中雞傳染性貧血病毒(CIAV)的污染，根據(jù)CIAV基因組保守序列設計合成了引物及TaqMan探針，通過優(yōu)化反應條件建立了快速檢測CIAV的實時熒光定量PCR檢測方法。結果顯示，建立的檢測方法靈敏度可達10拷貝·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。該方法與禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥病毒以及馬立克病病毒等病毒基因均無交叉反應，具有很好的特異性；批內重復和批間重復顯示變異系數(shù)均小于2%，呈現(xiàn)良好的可重復性。在模擬試驗中，該方法能夠檢測到1 000羽份弱毒疫苗中1個EID50的低劑量污染，應用該方法從送檢的39種(批)商品化禽用弱毒疫苗中檢測到2份為CIAV陽性。上述結果表明，本研究建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復性好，可用于檢測疫苗中CIAV低劑量的污染。

關鍵詞：雞傳染性貧血病毒；實時熒光定量PCR；弱毒疫苗；污染

雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起雛雞骨髓造血組織和胸腺等淋巴組織的萎縮，并導致感染雞發(fā)生貧血和免疫抑制。自1979年日本學者首次報道CIAV以來[1]，CIAV感染已在我國及其他國家普遍存在[2-6]。由于CIAV感染非常普遍并可以通過種蛋垂直傳播，在養(yǎng)禽場(特別是種禽場)中受到高度重視。

在過去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被證實存在一些外源性病毒的污染，這些病毒主要是能夠通過雞胚垂直傳播的病毒，其中CIAV在禽弱毒疫苗中的污染已在國內外得到證實[1，7]。由于疫苗接種的特殊性，一旦使用污染有外源病毒的弱毒疫苗將使雞場產生近似于人工攻毒的普遍性效果，因此加強對禽弱毒疫苗中CIAV污染的監(jiān)測對于種禽場防控CIAV極其重要。目前，我國獸藥典中針對雞馬立克病活疫苗等生物制品中CIAV的檢測主要是依據(jù)接種SPF雞檢測抗體結果來判斷其中是否存在CIAV污染，但這一方法周期較長并需要嚴格的實驗動物設施。目前，人們把目光集中于分子生物學檢測方法，如PCR等被證實可以從商品化疫苗中檢測出CIAV污染[7]。通常情況下，在禽弱毒疫苗中CIAV等外源病毒污染的劑量比較低，這就需要用非常靈敏而特異的方法來進行檢測。本研究在對大量CIAV基因組分析基礎上設計和合成了相關引物與探針，建立了用于檢測CIAV的TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法，不僅在模擬試驗中被證實可有效檢測疫苗中低劑量的CIAV污染，還成功從商品化疫苗中檢測到CIAV污染。

1材料與方法

1.1毒株和細胞

CIAV-SDLY08株為2008年本實驗室從山東某商品代肉雞中分離鑒定的野毒株[8]，在雞胚上增殖后測定其雞胚半數(shù)感染量(EID50)。雞馬立克病病毒(MDV)、禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥病毒(REV)以及不同亞群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)均由本實驗室分離鑒定和保存。SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細胞(CEF)后用于MDV、REV以及ALV-A/B/J等病毒的增殖。

1.2引物和探針的設計

根據(jù)GenBank已經發(fā)表的以及本實驗室近年來測定但尚未發(fā)表的CIAV全基因組序列，使用Lasergene 7.0 軟件尋找CIAV最保守區(qū)域，應用Primer 5.0 軟件設計了引物和探針(表1)，引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

表1　本研究中所使用引物及探針

1.3熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化

取保存的CIAV病毒液參照說明書以病毒核酸提取試劑盒提取病毒DNA，以“1.2”中合成引物擴增相應DNA片段，PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并以OMEGA公司凝膠回收試劑盒進行回收純化。純化產物與pMD 18-T載體連接后轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落使用質粒提取試劑盒提取質粒后進行酶切鑒定，并送商業(yè)公司測序驗證。驗證后陽性質粒標準品使用核酸定量系統(tǒng)對其進行定量并計算其拷貝數(shù)。以不同稀釋度的陽性質粒標準品為模板，將熒光定量PCR上下游引物和探針加入到反應體系中，于ABI 7500型熒光定量PCR儀進行擴增。分別選用10、25、50 nmol·mL-1的引物濃度和5、12.5、25 nmol·mL-1的探針濃度，使用矩陣法對上下游引物、探針濃度進行篩選和優(yōu)化，以得到最佳反應體系和反應條件。

1.4熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復性檢測

將1×108拷貝·μL-1的重組質粒進行10倍梯度稀釋至濃度范圍1×108～1×101拷貝·μL-1，進行熒光定量PCR反應，進行敏感性檢測。同時以等量的質粒DNA為模板，進行常規(guī)PCR反應，取擴增產物5 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，計算兩種方法所能檢測出的最低模板濃度，比較兩者敏感性的差異。分別以ALV-A/B/J、MDV、CIAV、REV的DNA或cDNA為模板，使用所建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，同時設置滅菌超純水為陰性對照。對不同梯度濃度稀釋的質粒標準品進行實時熒光定量PCR檢測，每個梯度進行3次反應，通過組內的CT值變異系數(shù)(標準偏差/重復值平均數(shù))評估所建立方法的重復性。另外，取3份CIAV陽性組織樣品，以其為模板進行熒光定量PCR檢測，分析該方法的批內和批間重復性。批內重復：將上述3份DNA分別設立3個重復，在同一條件下同時檢測，計算批內變異系數(shù)；批間重復：將上述3份DNA在同一條件下進行3次獨立的熒光定量PCR檢測，計算批間變異系數(shù)。

1.5熒光定量PCR在檢測CIAV污染中的應用

將定量好的CIAV分別以無菌的PBS稀釋至2×103、2×102、2×10、2×1、2×0.1 EID50·mL-1，然后分別以包含不同病毒含量的上述PBS稀釋5瓶同一批次的雞痘活疫苗(1 000羽份)，即分別人為污染了103、102、10、1、0.1 EID50·1 000-1羽份CIAV的5瓶雞痘活疫苗，另用2 mL無菌PBS稀釋1瓶同一批次的雞痘活疫苗(1 000羽份)作為空白對照。上述不同疫苗以病毒核酸提取試劑盒提取病毒DNA后按照本研究建立的方法進行熒光定量PCR檢測，同時以本研究引物進行常規(guī)PCR檢測。按照上述操作在MDV活疫苗中人工加入不同劑量的CIAV模擬不同劑量的污染。

另外，對四家種禽企業(yè)送檢的39種(批)弱毒疫苗提取核酸后按照上述操作分別使用本研究建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR進行檢測，對于兩種方法結果不一致的參照《中國獸藥典》使用SPF雞檢查法進行復核檢測。

2結果

2.1實時熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化

對實時熒光定量PCR的反應條件進行了優(yōu)化，確定引物和探針的最佳濃度分別為10和25 μmol·mL-1。反應體系為20 μL，其中含10 μL 2×Premix ExTaq(2×)(Probe qPCR)，ROX plus 緩沖液，上、下游引物各0.5 μL，探針0.4 μL，模板2 μL，用滅菌超純水補足體積。反應條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃34 s(收集熒光信號)，擴增40個循環(huán)。使用優(yōu)化后的條件進行實時熒光定量PCR反應，以10倍梯度稀釋(1×108～1×101拷貝·μL-1)的陽性質粒標準品為模板進行擴增，獲得了檢測CIAV的動力學曲線(圖略)和標準曲線(圖略)。結果顯示在模板為108～101拷貝·μL-1濃度時具有良好的線性關系，R2值達到0.996?？截悢?shù)對數(shù)值(x)與CT值的關系為y=-3.215x+41.4。說明標準品的起始模板濃度與CT值呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2實時熒光定量PCR的敏感性、特異性和重復性試驗

通過對重組質粒各稀釋度樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，本方法對重組質粒進行擴增最低可以檢測到10個病毒核酸分子拷貝，而常規(guī)PCR方法在103個病毒核酸分子拷貝時能勉強觀察到目的條帶(圖略)，表明本研究所建立的實時熒光定量PCR方法比普通PCR靈敏度高出約100倍。用所建立的實時熒光定量PCR方法對ALV-A/B/J、MDV、REV的DNA或cDNA進行檢測均無擴增信號，而質粒標準品有良好的擴增，表明該方法具有良好的特異性(圖略)。取3份CIAV陽性肝組織樣品，提取組織DNA，進行3次實時熒光定量PCR檢測。結果顯示，批內重復和批間重復的變異系數(shù)均小于2%(表2)，表明該方法具有良好的可重復性和穩(wěn)定性。

2.3實時熒光定量PCR檢測弱毒疫苗中CIAV污染

利用建立的熒光定量PCR檢測方法對人工混入不同弱毒疫苗中五個不同污染劑量的CIAV污染檢測結果顯示可檢測到1 EID50·1 000-1羽份的低劑量污染，而空白疫苗檢測為陰性，顯示所建立的CIAV熒光定量方法不僅具備較高的靈敏度，還具有非常好的特異性。而使用同一引物進行常規(guī)PCR檢測，僅僅可以檢測到103EID50·1 000-1羽份(表3)。

使用建立的熒光定量PCR方法從39種(批)弱毒疫苗中檢測到2份CIAV陽性，盡管疫苗送檢時標簽已撕掉，廠家未知，但巧合的是這兩份樣品均為FPV活疫苗；將這2份FPV活疫苗接種SPF雞后分別在35和42 d時均檢測到CIAV特異性抗體，判定為CIAV污染陽性，但以常規(guī)PCR檢測這2份樣品判定為陰性。

表2　重復性試驗結果

表3　熒光定量PCR檢測人工污染不同劑量CIAV結果

3討論

在過去的二十多年中，很多禽用弱毒疫苗被證實存在一些外源性病毒的污染，這種現(xiàn)象主要是使用了污染有其他病毒的SPF雞胚或毒種生產疫苗造成的，這些病毒主要是能夠通過雞胚垂直傳播的病毒，如ALV、REV、CIAV等。目前針對外源病毒污染的報道最多的是ALV[9-13]和REV[14-16]，此外就是CIAV污染[1，7]。

目前對疫苗中外源病毒污染的檢測主要包括細胞培養(yǎng)檢查法以及經典的SPF雞檢查法，但是絕大多數(shù)疫苗(如MDV活疫苗)的檢測非常復雜和困難，這是因為MDV等接種CEF細胞后能夠產生細胞病變，使污染的病毒復制受到干擾。盡管經典的SPF雞檢查法相對可靠，但其周期較長成本也比較高，更重要的是對于一般種禽場存在困難，因為這需要特定的設備并要求長期飼養(yǎng)SPF雞備用。因此越來越多的檢測機構試圖通過分子生物學檢測方法來檢測疫苗中ALV、REV和CIAV的污染。

但是，對于常規(guī)的分子生物學檢測方法來講，在檢測ALV和REV時經常會檢測到假陽性的結果，這是因為對REV來講，存在著REV與其他病毒的基因重組。早已證實，REV的基因成分能夠整合進其他病毒的基因組中，報道最多的是MDV等基因組較大的病毒基因組中[17-19]，例如2004年在我國已經分離到整合進REV的LTR基因片段的天然MDV重組野毒株[20-21]。除了MDV外，最容易整合進REV基因成分的是FPV[22-24]，在我國FPV疫苗以及野毒株中整合進REV基因片段的研究也已有報道[25]。而對ALV來講，內源性ALV的干擾無疑是非常嚴重的，一般的分子生物學檢測會受到內源性ALV的干擾而出現(xiàn)假陽性。

相對于上述ALV和REV基因的復雜性，CIAV基因組較小并且其基因組非常保守。CIAV屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，有3個開放閱讀框(ORF)，分別編碼衣殼蛋白(VP1) 、分子伴侶(VP2)和凋亡素(VP3)，在3個ORF中只有VP1的變異相對較大，但不同毒株之間同源性也非常高[3-6]，因此可以用常規(guī)的分子生物學方法來檢測疫苗中CIAV的污染，例如邵紅霞等就建立了針對CIAV的PCR檢測方法并在一些商品化疫苗中檢測出CIAV的污染[7]。

通常，在禽弱毒疫苗中CIAV污染的劑量是非常小的，這可能導致一般的PCR方法無法有效檢測出一些低劑量的CIAV污染。本研究通過對大量CIAV毒株(約90株以上)的分析，選取CIAV最保守的基因區(qū)域建立了針對CIAV的TaqMan探針實時熒光定量檢測方法，并證實其靈敏度、特異性和可重復性均非常良好。為了驗證所建立的方法在檢測疫苗中CIAV污染的最低限度，作者在MDV等弱毒疫苗中分別人工加入了不同劑量的CIAV，然后使用所建立的方法進行檢測，通過模擬試驗觀察此方法在檢測弱毒疫苗中CIAV污染的可行性。結果顯示所建立的熒光定量PCR方法展示了靈敏度優(yōu)勢，該方法可以檢測出MDV等弱毒疫苗中1EID50/1 000羽份的CIAV污染，這種污染劑量已經很低了。實際上，即使再低劑量的污染檢測不到我們也無須擔心，因為那種劑量的污染已經接近于零的水平，感染雞后不會導致任何不良結果。所建立熒光定量PCR檢測方法靈敏度優(yōu)勢在檢測商品化疫苗中得到了更好的體現(xiàn)，利用常規(guī)PCR方法對市場上購買的39種(批)弱毒疫苗檢測均未檢測到CIAV陽性，但本研究建立的熒光定量PCR方法則檢測到2種FPV弱毒疫苗中存在CIAV污染，并進一步通過接種SPF雞的經典金標準得到了證實，這一結果提示對于商品化弱毒疫苗中CIAV污染的監(jiān)測仍需高度重視。本研究建立的方法將有助于企業(yè)能夠準確而快速地檢測禽弱毒疫苗中的CIAV污染，為防控CIAV的傳播提供可借鑒的手段。

4結論

根據(jù)CIAV基因組保守序列設計合成引物及TaqMan探針，建立了快速檢測CIAV的實時熒光定量PCR檢測方法。建立方法的檢測靈敏度可達10拷貝·μL-1，該方法能夠檢測到1 000羽份弱毒疫苗中1個EID50的低劑量污染。應用該方法從送檢的39種(批)商品化禽用弱毒疫苗中檢測到2份為CIAV陽性。建立的熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強，重復性好，可用于檢測疫苗中CIAV低劑量的污染。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.020

收稿日期：2016-04-10

基金項目：農業(yè)部財政項目“禽垂直傳播性疾病診斷技術研究”

作者簡介：任志浩(1992-)，男，山東青島人，碩士生，主要從事動物分子病毒學研究，E-mail：zhren92@163.com；房立春(1991-),男，山東濟南人，碩士生，主要從事動物分子病毒學研究，E-mail：18854881003@163.com。兩人對本研究有同等貢獻，為并列第一作者 *通信作者：趙鵬，E-mail：zhaopeng@sdau.edu.cn;常爽，E-mail：changshuang81@126.com。趙鵬、常爽并列通信作者

中圖分類號：S852.659.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1459-06

Development and Application of a Quantitative PCR for Detection of Chicken Infectious Anemia Virus Contamination in Attenuated Vaccines

REN Zhi-hao#，F(xiàn)ANG Li-chun#，LUAN Huai-biao，LI Yang，WANG Yi-xin，CUI Zhi-zhong，CHANG Shuang*，ZHAO Peng*

(CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

Abstract:To detect the contamination of Chicken infectious anemia virus (CIAV) in attenuated vaccines for poultry，primers and TaqMan probes were designed and synthesized based on the published CIAV genome sequence，and a real-time quantitative PCR method for detecting the CIAV was established by optimizing the reaction conditions.Results analysis showed that the sensitivity of the qPCR may increase detection to 10 copies·μL-1，and the method was approximately 100-fold higher than the sensitivity of the conventional PCR.This detection method had good specificity，and showed no cross-reactions with ALV，REV and MDV genes，the CV (coefficient of variation) of intra-assay and inter-assay were less than 2%，and also showed that the method had the characteristics of better repeatability.In our experiment，a low dosage of 1 EID50·1 000-1plumes and in 2 positive (5.1%) of 39 samples were detected for CIAV detection from commercial poultry vaccines by qPCR method.In this study，suggesting that this method provides a high sensitivity，strong specificity and better repeatability system for detection of a low dosage CIAV contamination in attenuated vaccines.

Key words:chicken infectious anemia virus；real-time PCR；live vaccine；contamination