金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路及其轉(zhuǎn)分化的影響

楊　彬，徐丹丹，孫志鵬，趙佳琦，閆博巍，李曉婷，武　瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

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金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路及其轉(zhuǎn)分化的影響

楊彬，徐丹丹，孫志鵬，趙佳琦，閆博巍，李曉婷，武瑞*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

摘要：為探索金黃色葡萄球菌(S.aureus)對奶牛乳腺成纖維細(xì)胞(BMFB)TGF-β1/Smad信號通路及其轉(zhuǎn)分化的影響，用熱滅活金黃色葡萄球菌(0、104、105、106、107和108 CFU·mL-1)刺激BMFB，24 h后采用Real-time PCR 方法檢測TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的轉(zhuǎn)錄量，Western blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表達(dá)量。使用TGF-β1受體特異性抑制劑SB-431542預(yù)處理細(xì)胞，再用105 CFU·mL-1熱滅活金黃色葡萄球菌刺激細(xì)胞，24 h后采用Real-time PCR方法檢測α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的轉(zhuǎn)錄量，Western blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表達(dá)量，免疫熒光法檢測collagen-Ⅰ蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，不同濃度熱滅活金黃色葡萄球菌處理細(xì)胞的TGF-β1 mRNA的轉(zhuǎn)錄量顯著升高(P <0.05或P <0.01)，其中以105 CFU·mL-1刺激組的TGF-β1 mRNA的轉(zhuǎn)錄量最高。不同濃度滅活的金黃色葡萄球菌處理細(xì)胞的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達(dá)量均能顯著升高(P<0.05或P <0.01)，其中以105 CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達(dá)量最高。抑制劑SB-431542能夠極顯著抑制α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表達(dá)量(P<0.01)。結(jié)果提示，金黃色葡萄球菌能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，本研究為揭示金黃色葡萄球菌性乳腺炎發(fā)生硬化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；奶牛乳腺成纖維細(xì)胞；α-SMA；collagen-Ⅰ；p-Smad2/3

金黃色葡萄球菌是引起臨床、亞臨床及慢性乳腺炎的最主要致病菌之一[1]。金黃色葡萄球菌性乳腺炎能夠?qū)е氯橄俪衫w維細(xì)胞的異常增生，從而引起結(jié)締組織的增生，增生的結(jié)締組織向腺泡腔和導(dǎo)管腔內(nèi)陷，引起乳腺導(dǎo)管的阻塞，最終受損的乳腺區(qū)域由于纖維變性而失去其泌乳功能[2]。器官纖維化的病理特征多表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞的激活和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，并最終導(dǎo)致器官正常結(jié)構(gòu)的消失和功能永久性喪失[3-4]。細(xì)胞外基質(zhì)是一種不可溶性蛋白質(zhì)，包括各型膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白多糖等成分[5]。肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積的主要細(xì)胞，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是肌成纖維細(xì)胞特異的標(biāo)志蛋白[6]。成纖維細(xì)胞并不是終末分化的細(xì)胞類型，而且保留了被激活后分化成纖維母細(xì)胞亞型的能力，肌成纖維細(xì)胞在正常組織器官中很少存在，當(dāng)組織器官受到損傷后由其他類型細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞)轉(zhuǎn)分化而來[7]。

研究證明轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是促進(jìn)組織器官纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一。在纖維變性疾病過程中，實質(zhì)細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞合成并分泌TGF-β1，TGF-β1能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞等細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積[8]。TGF-β1是通過其Ⅰ型受體(TGF-βRⅠ)和Ⅱ型受體(TGF-βRⅡ)及其下游Smad信號分子發(fā)揮作用，TGF-β1/活動素連續(xù)激活TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ，TGF-βRⅠ使細(xì)胞內(nèi)質(zhì)-核信號分子Smad2/3磷酸化，Smad2/3與Smad4結(jié)合后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中參與基因調(diào)控[9-10]。

研究表明金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的慢性奶牛乳腺炎TGF-β1、受體TGF-βRⅠ及collagen-Ⅰ的表達(dá)顯著升高[11]。本課題組前期證明熱滅活的金黃色葡萄球菌能夠誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞α-SMA及collagen-Ⅰ表達(dá)的升高，表明金黃色葡萄球菌可以使奶牛乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，但是金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的機(jī)制仍不清楚。因此，本研究擬從TGF-β1/Smad信號通路的角度探討其在奶牛乳腺纖維化中的作用，為防治金黃色葡萄球菌感染引起奶牛乳腺纖維化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

BMFB由本實驗室分離純化鑒定并凍存；金黃色葡萄球菌由本實驗室保存；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量染料均購自TaKaRa公司；α-SMA抗體、GAPDH抗體均購自Abcam公司；collagen-Ⅰ抗體購自Novus公司；p-Smad2/3抗體購自Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG-HRP、兔抗山羊IgG-HRP、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自北京中衫金橋公司；SB-431542購自Selleck公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自康為世紀(jì)公司；蛋白酶抑制劑購自Sigma公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購自Thermo公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)超敏顯色液均購自索萊寶公司。

1.2熱滅活菌液的制備

將凍存的S.aureus進(jìn)行復(fù)蘇活化，采用平板計數(shù)法計算菌液濃度，用培養(yǎng)基將菌液稀釋為104、105、106、107、108CFU·mL-1，將菌液70 ℃溫育30 min滅活備用。

1.3熱滅活菌液刺激細(xì)胞

將凍存的3～4代BMFB用胰酶消化懸浮，計數(shù)后按1×105·mL-1的濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長匯合鋪成單細(xì)胞層時，對照組以不加菌液的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理組加入不同濃度滅活菌液共培養(yǎng)24 h，分別收集各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDHmRNA的熒光定量PCR檢測，分別收集各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行α-SMA、collagen-Ⅰ 、p-Smad2/3和GAPDH蛋白的Western blot檢測。在檢測抑制劑SB-431542預(yù)處理細(xì)胞后滅活菌液對細(xì)胞中α-SMA和collagen-Ⅰ表達(dá)的影響試驗中，將凍存的BMFB復(fù)蘇培養(yǎng)接種在細(xì)胞培養(yǎng)板，陰性對照組只加細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)及只加SB-431542(10 μmol·L-1)，陽性對照組加入105CFU·mL-1滅活菌液，TGF-β1受體特異性抑制劑處理組加入SB-431542(10 μmol·L-1)孵育1 h，然后加入105CFU·mL-1滅活菌液共24 h，分別收集各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDHmRNA的熒光定量PCR檢測，分別收集各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行α-SMA、collagen-Ⅰ、p-Smad2/3和GAPDH蛋白的Western blot檢測，并進(jìn)行collagen-Ⅰ的免疫熒光檢測。

1.4TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的檢測

根據(jù)GenBank中TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ和GAPDH的序列，設(shè)計并合成引物(表1)，利用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，利用SYBR染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，以GAPDHmRNA的轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參對TGF-β1、α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行計算。

表1　熒光定量PCR用到的引物和序列

1.5Western blot檢測p-Smad2/3、α-SMA和 collagen-Ⅰ 蛋白

待細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時間，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞。然后冰上用RIPA裂解細(xì)胞，細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，吸取裂解液進(jìn)行12 000 r·min-14 ℃離心10 min。吸取上清液，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液沸水煮10 min后進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳。采用BIO-RAD垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳。電泳后，采用BIO-RAD的轉(zhuǎn)印儀將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于封閉液(5%脫脂乳的PBST)室溫封閉2 h，加一抗，4 ℃冰箱過夜。洗膜后將膜孵育在含二抗的PBST溶液中，室溫下孵育1 h，用ECL試劑進(jìn)行顯色，于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測，Western blot條帶采用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析計算，重復(fù)6次，取其平均值，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以目的蛋白質(zhì)灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示相對定量結(jié)果。

1.6免疫熒光方法檢測collagen-Ⅰ的蛋白質(zhì)表達(dá)

細(xì)胞爬片后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS緩沖液沖洗3次，0.5%Triton處理10 min，PBS沖洗3次，正常血清封閉液封閉30 min后，分別滴加一抗兔collagen-Ⅰ抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜。洗滌后滴加熒光FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶100稀釋)，室溫下作用90 min，PBS沖洗3次，防淬滅劑封片、鏡檢、照相。

1.7統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05或P<0.01為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1金黃色葡萄球菌對BMFBα-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

用104、105、106、107、108CFU·mL-1的熱滅活菌液刺激BMFB 24 h，熒光定量PCR方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1 mRNA結(jié)果顯示，不同濃度的熱滅活菌均可以使α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，其中以105CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和TGF-β1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平最高(圖1)。

A.α-SMA；B. collagen-Ⅰ；C.TGF-β1；*.P<0.05；**.P<0.01圖1　熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB的α-SMA、collagen-I和TGF-β1熒光定量PCR分析Fig.1　Real-time PCR analysis of α-SMA，collagen-Ⅰ，TGF-β1 in BMFB stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA)

2.2 金黃色葡萄球菌對BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

用104、105、106、107、108CFU·mL-1的滅活菌液刺激BMFB 24 h，Western blot方法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的熱滅活菌均可以使α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，其中以105CFU·mL-1刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高(圖2)。

A.Western blot圖；B～D.Western blot平均灰度值；*.P<0.05；**.P<0.01A.Western blot image；B-D.The Western blot average grey value；*.P<0.05；**.P<0.01圖2　熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3免疫印跡分析Fig.2　Western blot analysis of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 in BMFB stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA)

2.3SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的表達(dá)

分別用105CFU·mL-1的滅活菌刺激BMFB 24 h，用SB-431542預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入105CFU·mL-1滅活菌液，熒光定量PCR方法檢測α-SMA和collagen-Ⅰ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，與滅活菌刺激組比較，SB-431542預(yù)處理后加滅活菌刺激組的α-SMA和collagen-Ⅰ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P<0.01)(圖3)。Western blot方法檢測結(jié)果顯示，與滅活菌刺激組比較，SB-431542預(yù)處理后加滅活菌刺激組的α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)(圖4)。說明SB-431542能夠顯著抑制BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ的表達(dá)。免疫熒光方法檢測結(jié)果顯示，SB-431542預(yù)處理后加滅活菌刺激組的collagen-Ⅰ熒光染色強(qiáng)度較滅活菌刺激組明顯減弱(圖5)。

A.α-SMA的熒光定量PCR分析；B.collagen-Ⅰ的熒光定量PCR分析；*.P<0.05；**.P<0.01A.Real-time PCR analysis of α-SMA；B.Real-time PCR analysis of collagen-Ⅰ；*.P<0.05；**.P<0.01圖3　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ mRNA的表達(dá)Fig.3　SB-431542 inhibits HKSA induced α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA in BMFB

A.Western blot圖；B～D.Western blot平均灰度值；*.P<0.05；**.P<0.01A.Western blot image；B-D.The Western blot average grey value；*.P<0.05；**.P<0.01圖4　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB α-SMA、collagen-Ⅰ和p-Smad2/3蛋白表達(dá)的免疫印跡分析Fig.4　Western blot analysis of HKSA induced α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 in BMFB and inhibition by SB-431542

A.未刺激對照組；B.滅活菌刺激組；C.SB-431542預(yù)處理后滅活菌刺激組A.BMFB without stimulation；B.BMFB stimulated with HKSA；c.BMFB treated with SB-431542 and HKSA圖5　SB-431542抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB collagen-Ⅰ 蛋白表達(dá)的免疫熒光染色(200×)Fig.5　Immunofluorescence staining of HKSA induced collagen-Ⅰ in BMFB and inhibition by SB-431542 (200×)

3討論

金黃色葡萄球菌感染能夠誘導(dǎo)奶牛乳腺細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6等促炎性細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)[12-13]。這些細(xì)胞因子參與了組織的損傷修復(fù)及肉芽組織的增生。在肉芽組織增生過程中，成纖維細(xì)胞被激活并表達(dá)α-SMA，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，這些肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)并造成細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[14]。成纖維細(xì)胞能夠產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子并對多種炎性細(xì)胞因子(如TGF-β1、IL-1、IL-6等)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)外源TGF-β1能夠使奶牛乳腺成纖維細(xì)胞α-SMA和collagen-Ⅰ的表達(dá)水平顯著增高[15]，成纖維細(xì)胞在急慢性炎癥及炎癥消退中發(fā)揮重要作用[7]。活菌會導(dǎo)致細(xì)胞在幾小時之內(nèi)死亡，本研究用熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB能顯著促進(jìn)TGF-β1、α-SMA、collagen-Ⅰ mRNA的升高，其原因可能是由于金黃色葡萄球菌刺激成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，而TGF-β1是促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)合成的關(guān)鍵細(xì)胞因子。

TGF-β1/Smad信號通路在許多組織發(fā)生纖維化過程中起重要作用[8]，Smads作為TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號傳遞分子調(diào)控細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smad2/3是活化型Smad蛋白，為TGF-β1下游調(diào)節(jié)因子，肝、腎纖維化的形成與Smad2/3密切相關(guān)[16-17]。本研究用熱滅活金黃色葡萄球菌刺激BMFB能夠促進(jìn)TGF-β1 mRNA、α-SMA、collagen-Ⅰ、p-Smad2/3的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高，提示金黃色葡萄球菌可能通過TGF-β1/Smad信號通路誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。106、107、和108CFU·mL-1濃度的滅活菌液刺激BMFB誘導(dǎo)TGF-β1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有105CFU·mL-1誘導(dǎo)的水平高，可能是由于高濃度菌液刺激BMFB產(chǎn)生的其他細(xì)胞因子(如TNF-α)抑制了TGF-β1的分泌所致[18]。

SB-431542可通過阻斷TGF-β1與Ⅰ型受體的結(jié)合，改善TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)產(chǎn)生的纖維化。研究表明乙醇能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并且促進(jìn)TGF-β和collagen-Ⅰ的升高，SB-431542能夠減弱乙醇誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的激活[19]。SB-431542通過抑制Smad2/3的磷酸化而抑制百草枯誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[20]。本研究發(fā)現(xiàn)SB-431542抑制熱滅活金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB α-SMA和collagen-Ⅰ的表達(dá)，提示SB-431542通過抑制TGF-β1/Smad信號通路從而抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)BMFB轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。

4結(jié)論

金黃色葡萄球菌能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導(dǎo)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.025

收稿日期：2016-01-12

基金項目：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士后啟動基金

作者簡介：楊彬(1982-)，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，講師，博士，主要從事奶牛乳腺炎致病機(jī)制的研究，E-mail: yangbin_nm@126.com *通信作者：武瑞，教授，E-mail: fuhewu@126.com

中圖分類號：S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1495-07

The Effect ofStaphylococcusaureuson TGF-β1/Smad Signaling Pathway and Transdifferentiation in Bovine Mammary Fibroblasts

YANG Bin，XU Dan-dan，SUN Zhi-peng，ZHAO Jia-qi，YAN Bo-wei，LI Xiao-ting，WU Rui*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity，Daqing163319，China)

Abstract:This study aimed to investigate the effect of Staphylococcus aureus (S.aureus) on TGF-β1/Smad signaling pathway and transdifferentiation in bovine mammary fibroblasts (BMFB).BMFB were stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA) at 104，105，106，107，108 CFU·mL-1.The transcription of TGF-β1，α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA were detected by Real-time PCR after 24 h.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 protein were detected by Western blot.BMFB were pretreated with TGF-β1 receptor-specific inhibitor SB-431542，BMFB were stimulated with heat-killed S.aureus (HKSA) at 105 CFU·mL-1.The transcription of α-SMA and collagen-Ⅰ mRNA were detected by Real-time PCR after 24 h.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 protein were detected by Western blot.Immunofluorescence was used to detect collagen-Ⅰ expression.The results showed that the transcription level of TGF-β1 mRNA，expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 increased significantly at different concentration after 24 h stimulation compared with unstimulated BMFB (P<0.05).The expression of TGF-β1，α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 reached the maximal level at 105 CFU·mL-1.The expression of α-SMA，collagen-Ⅰ and p-Smad2/3 were significantly reduced by pretreating BMFB with SB-431542 (P<0.01).The results indicate that TGF-β1/Smad signaling pathway plays an important role in S.aureus induced BMFB transdifferentiation.

Key words:Staphylococcus aureus；bovine mammary fibroblasts；α-SMA；collagen-Ⅰ；p-Smad2/3