牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

周　芳，岳　華，張　斌，李　凡，陳　曦，湯　承

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/四川省教育廳重大動物疫病防控技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊，成都 610041)

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牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

周芳，岳華，張斌，李凡，陳曦，湯承*

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/四川省教育廳重大動物疫病防控技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊，成都 610041)

摘要：輪狀病毒(rotavirus，RV)VP6基因是RV的主要分子檢測靶點(diǎn)，但該基因的點(diǎn)突變會影響RV的分子檢測。本試驗的目的是在研究牦牛RV VP6基因遺傳變異的基礎(chǔ)上，建立檢測牦牛RV的RT-PCR方法并應(yīng)用于臨床樣本檢測。采用Prime 5.0設(shè)計引物，從30個牦牛腹瀉樣本中擴(kuò)增得到14個位于931—1 338 bp牦牛RV VP6基因片段。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)相比，牦牛RV VP6基因在931—1 110 bp間出現(xiàn)多處點(diǎn)突變，而在1 100—1 338 bp之間序列高度保守。據(jù)此設(shè)計檢測引物，成功建立了檢測牦牛RV的RT-PCR方法，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，只擴(kuò)增出牦牛RV及BRV的特異片段，對其他無關(guān)病原無擴(kuò)增；檢測下限為0.45 pg·μL-1，靈敏性較好。所建立方法對牦牛RV的檢出率明顯優(yōu)于現(xiàn)有檢測BRV的RT-PCR方法，為牦牛RV病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的方法；對BRV的檢出也與其他方法具有很好的符合率，也可以用于BRV的檢測。對234份犢牦牛腹瀉糞便樣本的RV檢出率：西藏為60.00%(36/60)、青海為95.00%(57/60)；四川為85.19%(46/54)；云南為90.00%(54/60)，證明牦牛RV感染是當(dāng)前導(dǎo)致犢牦牛腹瀉的重要原因。

關(guān)鍵詞：牦牛；輪狀病毒；VP6基因；點(diǎn)突變；RT-PCR

國內(nèi)外研究表明，牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)是引起犢牛腹瀉的主要病因，世界范圍內(nèi)流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。BRV為呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，無囊膜雙鏈RNA病毒，分11個基因節(jié)段，由三層衣殼組成，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6、VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)，其中VP1～VP3為病毒核心蛋白；VP6為內(nèi)衣殼蛋白；VP4和VP7蛋白決定病毒的毒力和P型與G型[3]。VP6作為病毒分組的特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，是RV感染血清抗體檢測的重要候選抗原；因其基因序列在各毒株間高度保守，目前VP6基因已成為RV的主要分子檢測靶點(diǎn)[4-6]。

PCR方法是病原檢測和流行病學(xué)調(diào)查的主要方法。目前國內(nèi)外已建立了多種檢測BRV的RT-PCR方法，靶基因的選擇多是VP6[7-9]。研究表明：盡管VP6基因高度保守，但可以快速發(fā)生點(diǎn)突變而引起抗原漂移[10]。故應(yīng)加強(qiáng)對VP6基因?qū)崟r監(jiān)測，了解其基因序列的變異狀況，以便及時改進(jìn)PCR方法，提高檢測效率[11]。最近，作者實(shí)驗室利用二代測序技術(shù)從牦牛腹瀉糞便樣本鑒定病毒種類時，證實(shí)樣本中存在RV[12]，但采用國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的三種檢測牛RV的RT-PCR方法對該份牦牛RV陽性樣本的檢測結(jié)果卻為陰性，推測其原因可能是牦牛RVVP6基因序列發(fā)生了變異。本研究旨在分析牦牛RVVP6基因分子特征并基于此建立RT-PCR檢測方法，并應(yīng)用該方法對青藏高原腹瀉牦牛糞便樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。

1材料與方法

1.1病毒(菌)株、臨床樣本

牦牛RV分離株，牛輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株(NCDV1，由本實(shí)驗室保存)；用于特異性驗證的病毒(菌)株及核酸樣本：牦牛源星狀病毒(bovine astrovirus，BAstV)Swun0201、牦牛源牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)swun0603、牦牛源腸炎病毒(bovine enterovirus，BEV)swun0510；牦牛源K99大腸桿菌swun4025、牦牛源都柏林沙門菌swun3736、牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌swun2930、牦牛源空腸彎曲桿菌swun1639；牦牛源冠狀病毒(bovine coronavirus，BCV)、牦牛源細(xì)小病毒、牦牛源kobu病毒核酸樣本以及牦牛源艾美爾球蟲、牦牛源瑞氏隱孢子蟲的DNA樣本由本實(shí)驗室保存。

檢測樣本：50份牦犢牛腹瀉糞便樣本(2014年6月采自于四川省阿壩州紅原縣)、38份肉牛腹瀉糞便樣本(2015年9月采集自重慶纂江縣)用于不同檢測方法的比較；234份犢牦牛(≤3月齡)腹瀉糞便樣本分別于2015年8月采集于四川省阿壩州(n=54)、云南省香格里拉市(n=60)、青海省玉樹市(n=60)、西藏藏族自治區(qū)亞東縣(n=60)，所有樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑及儀器

TrizolTMReagent、PrimescriptTM、pMD19-T克隆載體等購于TaKaRa公司；AXY prepTMDNA膠回收試劑盒購于Axygen公司。DNA Marker、DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購于寶生物工程(大連)股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；紫外分光光度計Cary50Probe(Vatian公司，美國)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)。

1.3引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank收錄的牛A群輪狀病毒的VP6基因序列(登錄號為JF693031)及本實(shí)驗室宏病毒基因組測序結(jié)果(938 bp-ATTTATATTTCATGCTACAGTTGGACTCACACTACGAATTGAATC-TGCAGTTTGTGAATCTGTGCTTGCGGACGC-TTCCGAAACTTTATT-1 029 bp)，利用Primer5.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計擴(kuò)增引物，從30份牦牛腹瀉樣本中擴(kuò)增長度為407 bp位于931—1 338 bp位點(diǎn)的RVVP6基因片段，用于遺傳演化分析并篩選分子檢測靶點(diǎn)，引物序列如下，F(xiàn)：5′-GGTAGCGGCGTTATTTCC-3′、R：5′-CGCCATCTGAGTG-ATTACTC-3′。

特異性檢測引物的設(shè)計：基于上述篩選出的分子檢測靶點(diǎn)，設(shè)計特異性檢測引物，擴(kuò)增長度為231 bp位于牦牛RVVP6基因1 100—1 338 bp位點(diǎn)的目的片段，引物信息見表1。以上引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4RNA的提取與cDNA合成

將臨床糞便樣本與PBS(1∶5)充分重懸混勻，-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，再以12 000 r·min-1離心30 min，取上清，然后按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＜?xì)菌DNA采用酚-氯仿法提取，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5牦牛RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以牦牛RV cDNA為模板，加入檢測引物擴(kuò)增大小為231 bp的牦牛RVVP6基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其克隆至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)8 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送擎科生物有限公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒作為RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，核酸蛋白質(zhì)檢測儀測定其濃度。

1.6反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

采用25 μL體系(預(yù)混酶12.5 μL，牦牛RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品1.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL)，對退火溫度從50～60 ℃進(jìn)行優(yōu)化，再以優(yōu)化的退火溫度對濃度為10 μmol·μL-1的引物用量(0.5～1.5 μL)進(jìn)行優(yōu)化。

1.7敏感性測定

將牦牛RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品10倍遞增稀釋后作為模板(1×100、1×10-1～1×10-6)，用建立的RT-PCR進(jìn)行檢測，確定其檢測限。

1.8特異性評價

用建立的RT-PCR對“1.1”中待檢病原的核酸樣本進(jìn)行檢測，并設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性樣本和陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.9穩(wěn)定性評價

用建立的RT-PCR對3個陽性模板及3份陰性樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測，以評價方法的穩(wěn)定性。

1.10四種RT-PCR方法的比較

采用所建立的RT-PCR方法和文獻(xiàn)報道的3種檢測BRV的RT-PCR方法(表1)，同時對50份牦牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行檢測，比較這4種方法的檢出率。引用的3種方法完全按照文獻(xiàn)報道的最適反應(yīng)條件進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上又選取上述三種方法中檢出率最高的方法和本實(shí)驗室建立RT-PCR方法同時對38份肉牛腹瀉樣本進(jìn)行檢測，比較對BRV的檢出率。每個方法中檢出的陽性樣本，對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

表1　四種RT-PCR方法的引物信息

1.11流行病學(xué)調(diào)查

流行病學(xué)調(diào)查樣本為2015年8月四川省阿壩州地區(qū)4個牧場、云南香格里拉地區(qū)6個牧場、青海玉樹地區(qū)6個牧場、西藏遠(yuǎn)東地區(qū)8個牧場，共計234份犢牦牛(≤3月齡)腹瀉糞便樣本，見表2。采用本研究建立好的RT-PCR方法對234份牦牛腹瀉樣本進(jìn)行檢測，分析牦牛RV在青藏高原的流行情況，并且每個地區(qū)隨機(jī)選取4份檢出的陽性樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得的VP6基因片段用于遺傳演化分析。

2結(jié)果

2.1牦牛RVVP6基因片段序列的克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析

從30份腹瀉糞便樣本中擴(kuò)增出14個407 bp的牦牛RVVP6基因片段，相似性比對發(fā)現(xiàn)：14個VP6基因片段間的相似性為94.1%～100%，與GenBank中的BRV相似性為93.4%～97.8%，與其相似性最高的是南非BRV HM988974毒株；與國內(nèi)僅有的一株BRV GU384194相似性為93.4%～96.3%。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明：這14株牦牛RV單獨(dú)的聚為3支(圖1)，第Ⅰ小支包含5株，與中國牛源RV(GU384194)遺傳演化關(guān)系最近，共同聚為一大支；第Ⅱ小支包含3株，與美國恒河猴源RV (FJ422136)遺傳演化關(guān)系最近，共同聚為一大支；第Ⅲ小支包含6株與比利時人源RV(EF554119)遺傳演化關(guān)系最近，共同聚為一大支。

圖1　牦牛RV 大小為407 bp的VP6基因片段的鄰近法演化樹Fig.1　Neighbor-joining consensus tree for size of 407 bp partial VP6 gene fragment of yak RV

14株牦牛RVVP6基因片段與標(biāo)準(zhǔn)毒株(NCDV株，DQ870496)序列比對發(fā)現(xiàn)：在931—1 100 bp之間發(fā)生的點(diǎn)突變位點(diǎn)有7～13處，在1 100—1 338 bp之間有4～6處；與國內(nèi)BRV GU384194毒株的比對結(jié)果是：在931—1 100 bp之間發(fā)生的點(diǎn)突變位點(diǎn)有11～19處，在1 100—1 338 bp之間有4～8處；14個牦牛RVVP6基因序列之間比較，Ⅰ組共同的變異位點(diǎn)有11處，其中6處位于931—1 100 bp，5處位于1 100—1 338 bp。Ⅱ組共同的變異位點(diǎn)有7處，其中6處位于931—1 100 bp，1處位于1 100—1 338 bp；Ⅲ組共同的變異位點(diǎn)有11處，其中9處位于931—1 100 bp，2處位于1 100—1 338 bp。

2.2牦牛RV檢測引物的特異性

采用自行設(shè)計的檢測引物對牦牛RV核酸陽性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖2 A)。測序結(jié)果證明目的片段長度為231 bp，為牦牛RV的特異性序列，與牦牛RVVP6基因序列的相似性為100%。

2.3優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)體系及條件

優(yōu)化的反應(yīng)體系：預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。

2.4敏感性

牦牛RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為45.2 ng·μL-1，敏感性檢測結(jié)果顯示，1×10-5稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品仍可見目的條帶，對RV的核酸最低檢測限為0.45 pg·μL-1(圖3)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)MarkerⅠ；+.陽性樣品；-.陰性對照；1～16.陽性模板、陰性對照、牦牛輪狀病毒、牛輪狀病毒BRV、牛星狀病毒AstV、牛病毒性腹瀉病毒BVDV、牛冠狀病毒BCV、牛腸炎病毒BEV、細(xì)小病毒parvovirus、Kobu病毒、K99大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、空腸彎曲桿菌、艾美爾球蟲、瑞氏隱孢子蟲M.DNA marker Ⅰ；+：DNA sample of Yak RV；-.Negative control；1-16.DNA templete of Yak RV，Negative control，Yak Rotavirus，BRV，AstV，BVDV，BCV，BEV，PV，Kobu virus，E.coli K99，S.Dublin，C.perfringens，CJE，Eimeria，Swiss cryptosporidium圖2　引物和方法的特異性檢測結(jié)果Fig.2　The specificity of the primers and method

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)MarkerⅠ；1～7.陽性模板10倍連續(xù)稀釋樣本(1×100、1×10-1～1×10-6)；—.陰性對照M.DNA marker Ⅰ；1-7.10-fold serial dilution of standard temper(1×100，1×10-1-1×10-6)；—.Negative control圖3　敏感性檢測結(jié)果Fig.3　Sensitivity test of the RT-PCR

2.5特異性

該方法能從牦牛RV分離株及BRV標(biāo)準(zhǔn)毒株中檢出目的基因片段，對AstV、BVDV、BCV、BEV、細(xì)小病毒、Kobu病毒、K99大腸桿菌、都柏林沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、空腸彎曲桿菌以及艾美爾球蟲、瑞氏隱孢子蟲的核酸樣本無擴(kuò)增(圖2B)。可見本研究建立的RT-PCR方法不僅能適合牦牛RV的檢測，也適用于BRV的檢測。

2.6穩(wěn)定性

對同一模板的3次重復(fù)檢測結(jié)果一致，證明該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.7四種檢測BRV方法的比較

檢測方法1～4對50份牦牛腹瀉糞便樣本中牦牛RV陽性的檢出率分別為90.0%、0、0、12.0%，且方法1檢出的陽性樣本包含了方法4檢測的所有陽性樣本。可見建立的RT-PCR方法對牦牛RV的檢測效率明顯優(yōu)于引用的3種檢測BRV的方法。方法1和方法4均檢出的陽性樣本以及另外隨機(jī)挑選的10個方法1中檢出的陽性樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的基因片段為輪狀病毒VP6基因片段，證實(shí)該RT-PCR方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

同時使用檢測方法1和方法4對38份肉牛腹瀉糞便樣本檢測，結(jié)果顯示兩種方法檢出BRV的陽性符合率為100%，證實(shí)了建立的RT-PCR方法不僅適用于牦牛RV的檢測，也可以適用于BRV的檢測。

2.8牦牛輪狀病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查

利用本研究建立的牦牛輪狀病毒RT-PCR檢測方法對青藏高原牦牛腹瀉糞便樣本進(jìn)行輪狀病毒的檢測，結(jié)果(表2)顯示：青海地區(qū)樣本的檢出率最高，為95.00%(57/60)；四川地區(qū)樣本的檢出率為85.19%(46/54)；云南地區(qū)樣本的檢出率為90.00%(54/60)；西藏地區(qū)樣本的檢出率最低，為60.00%(36/60)，這一結(jié)果表明，青藏高原牦牛RV感染率很高。對隨機(jī)挑選的16份陽性樣本的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行分析，證實(shí)均為牦牛RV特異片段，同時也進(jìn)一步驗證本研究建立的RT-PCR方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2　牦牛輪狀病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.9青藏高原四個地區(qū)的牦牛輪狀病毒VP6基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)表明：四個地區(qū)牦牛輪狀病毒單獨(dú)的聚在一起，與牛輪狀病毒有明顯的遺傳距離，表明VP6的序列的變異與宿主有關(guān)。從四個地區(qū)的毒株分布來看，青海、西藏、云南的毒株分別單獨(dú)聚在一起，四川的毒株分布在西藏和云南的毒株形成的分支中，似乎有一定的地域分布的趨勢，但由于樣本數(shù)量有限，還需要更多不同地域的毒株來驗證。

3討論

由于VP6基因序列的保守性，目前已成為國內(nèi)外檢測RV最重要的分子檢測靶點(diǎn)。但2007年T.K.Kerin等在研究美國人源RV時發(fā)現(xiàn)：VP6基因序列由于發(fā)生點(diǎn)突變、堿基插入等變異能使其發(fā)生快速的變異；新分離到的人源RVVP6基因序列與數(shù)十年前分離到的參考毒株發(fā)生了很大的遺傳變異，22株RV中只有3株與標(biāo)準(zhǔn)參考毒株遺傳演化關(guān)系較近，共同聚為一支，其余占近86.4%的毒株與參考毒株發(fā)生了遺傳偏倚，單獨(dú)聚成支；這種基因序列的變異導(dǎo)致2%～3%的氨基酸殘基被替換，同時也影響了PCR方法的檢測結(jié)果[11]。目前國內(nèi)對輪狀病毒VP6遺傳變異的研究資料很少。從研究擴(kuò)增出的14個VP6基因片段序列比對分析結(jié)果來看，牦牛RVVP6基因序列在遺傳演化的過程中也發(fā)生了較多點(diǎn)突變，主要發(fā)生區(qū)域為931—1 100 bp。這些點(diǎn)突變頻率高的位置是其他毒株的高保守區(qū)域，也是國內(nèi)外建立檢測RV RT-PCR方法的常用引物設(shè)計位點(diǎn)[13-15]。因此，這種點(diǎn)突變對檢測方法造成的影響值得我們思考。鑒于VP6基因既是主要的分子檢測靶點(diǎn)，又是制備亞單位疫苗的重要候選抗原[16-17]，進(jìn)一步研究牦牛RVVP6基因的遺傳演化的特點(diǎn)和對抗原特性影響，這對牦牛輪狀病毒病的分子診斷和亞單位疫苗的研制有重要意義。

本研究基于對牦牛RVVP6基因序列的分析，選擇在最保守區(qū)域設(shè)計檢測引物，成功建立檢測牦牛RV的RT-PCR 方法。該方法特異性好，只能擴(kuò)增牦牛RV和BRVVP6基因片段，對一些常見的引起犢牛腹瀉的其他病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原無擴(kuò)增，且具有良好的重復(fù)性；從靈敏度上來看，該方法的檢測限為0.45 pg·μL-1，與方法4中檢測最低檢測限處于同一個數(shù)量級[9]，具有較好的靈敏性，完全能夠滿足臨床樣本的檢測需求；同時，本方法對BRV的檢出也與國外報道的方法有很好的符合率。因此，本研究建立的RT-PCR方法不僅為牦牛RV的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供有力的工具，同時也可以檢測BRV，具有良好的通用性。

比較試驗表明，其他三種檢測BRV的RT-PCR方法對臨床樣本牦牛RV檢出率顯著低于本研究建立的RT-PCR方法，分析其原因可能與牦牛RVVP6基因核苷酸序列變異有關(guān)。通過把這3種方法中引物序列與作者擴(kuò)增出來的牦牛RVVP6基因序列比對發(fā)現(xiàn)：方法2中[7]下游引物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了3處點(diǎn)突變：997 bp處A→G；1 000 bp處C→T；1 003 bp處C→T。方法3中[8]下游引物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了7處點(diǎn)突變：916 bp處T→G；918 bp處A→T；920 bp處A→T；921 bp處A→C；922 bp處T→A；926 bp處T→A；928 bp處A→T。方法4雖然為解決點(diǎn)突變問題設(shè)計了簡并引物[9]，但這對簡并引物在下游引物結(jié)合位點(diǎn)也有一處發(fā)生了變異，可能是導(dǎo)致對牦牛RV的陽性檢出率低的一個原因。這一結(jié)果也表明了VP6基因序列盡管保守，但也有突變的發(fā)生，我們應(yīng)對VP6進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，不斷地改進(jìn)檢測方法。

犢牦牛腹瀉一直是危害青藏高原地區(qū)牦牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病[12]。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查表明其病因是多方面的，歸納為兩大類：一類為非感染性因素，一類為感染性因素[18-19]。本實(shí)驗室從牦犢牛腹瀉糞便中檢測到的病毒多達(dá)9種[12]。本研究對青藏高原牦牛主產(chǎn)區(qū)的犢牛腹瀉樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，牦牛RV感染在青藏高原普遍存在，是當(dāng)前導(dǎo)致犢牛腹瀉的重要病原，為牦牛腹瀉病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。有資料顯示從人腹瀉糞便中分離到BRV，BRV可以直接感染人引發(fā)疾病[20-21]。本研究建立的遺傳演化樹中第Ⅲ支與人源RV有較近的遺傳演化關(guān)系(圖1)，故牦牛RV的公共衛(wèi)生學(xué)意義值得關(guān)注。

4結(jié)論

成功建立檢測牦牛輪狀病毒的RT-PCR檢測方法，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，靈敏性也較好。建立的方法對牦牛RV的檢出率明顯優(yōu)于現(xiàn)有檢測BRV的RT-PCR方法，為牦牛RV病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的方法；對BRV的檢出也與其他方法具有很好的符合率，也可以用于BRV的檢測。對青藏高原牦牛輪狀病感染的病原進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查表明牦牛RV感染是當(dāng)前導(dǎo)致犢牦牛腹瀉的重要原因。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]BADARACCO A，GARAICOECHEA L，RODRGUEZ D，et al．Bovine rotavirus strains circulating in beef and dairy herds in Argentina from 2004 to 2010[J]．VetMicrobiol，2012，158(3-4)：394-399．

[2]MINAMI-FUKUDA F，NAGAI M，TAKAI H，et al.Detection of bovine group A rotavirus using rapid antigen detection kits，RT-PCR and next-generation DNA sequencing[J].JVetMedSci，2013，75(12)：1651-1655.

[3]ALFIERI A F，ALFIERI A A，BARREIROS M A，et al.G and P genotypes of group A rotavirus strains circulating in calves in Brazil 1996-1999[J].VetMicrobiol，2004，99(3-4)：167-173.

[4]GONZALEZ D D，MOZGOVOJ M V，BELLIDO D，et al.Evaluation of a bovine rotavirus VP6 vaccine efficacy in the calf model of infection and disease[J].VetImmunolImmunopathol，2010，137(1-2)：155-160.

[5]WISE A G，SMEDLEY R C，KIUPEL M，et al.Detection of group C rotavirus in juvenile ferrets (Mustela putorius furo) with diarrhea by reverse transcription polymerase chain reaction：sequencing and analysis of the complete coding region of the VP6 gene[J].VetPathol，2009，46(5)：985-991.

[6]STIPP D T，ALFIERI A F，LORENZETTI E，et al.VP6 gene diversity in 11 Brazilian strains of porcine group C rotavirus[J].VirusGenes，2015，50(1)：142-146.

[7]范晴，謝芝勛，劉加波，等.牛輪狀病毒TaqMan實(shí)時熒光RT-PCR快速檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(4)：105-108.

FAN Q，XIE Z X，LIU J B，et al.Detection of bovine rotavirus by TaqMan based real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay[J].ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2011，38(4)：105-108.(in Chinese)

[8]王潔清.牛輪狀病毒RT-PCR檢測和基于VP6重組抗原檢測血清抗體ELISA方法初步建立[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

WANG J Q.Detection of bovine rotavirus by RT-PCR and establishment of indirect ELISA to detect bovine rotavirus antibody with VP6 protein[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2009.(in Chinese)

[9]BASERA S S，SINGH R，VAID N，et al.Detection of rotavirus infection in bovine calves by RNA-PAGE and RT-PCR[J].IndianJVirol，2010，21(2)：144-147.

[10]NYAGA M M，ESONA M D，JERE K C，et al.Genetic diversity of rotavirus genome segment 6(encoding VP6) in Pretoria，South Africa[J].Springerplus，2014，3：179.

[11]KERIN T K，KANE E M，GLASS R I，et al.Characterization of VP6 genes from rotavirus strains collected in the United States from 1996-2002[J].VirusGenes，2007，35(3)：489-495.

[12]CHEN X，ZHANG B，YUE H，et al.A novel astrovirus species in the gut of yaks with diarrhea in the Qinghai Tibetan plateau，2013[J].JGenVirol，2015.doi：10.1099/gv.0.000303.

[14]GAUTAM R，ESONA M D，MIJATOVIC-RUSTEMPASIC S，et al.Real-time RT-PCR assays to differentiate wild-type group A rotavirus strains from Rotarix?and Rota Teq?vaccine strains in stool samples[J].HumVaccinImmunother，2014，10(3)：767-777.

[15]LIN Y P，KAO C L，CHANG S Y，et al.Determination of human rotavirus VP6 genogroups Ⅰ and Ⅱ by reverse transcription-PCR[J].JClinMicrobiol，2008，46(10)：3330-3337.

[16]DENNEHY P H.Rotavirus vaccines：an overview[J].ClinMicrobiolRev，2008，21(1)：198-208.

[17]LAPPALAINEN S，PASTOR A R，MALM M，et al.Protection against live rotavirus chanllenge in mice induced by parenteral and mucosal delivery of VP6 subunit rotavirus vaccine[J].ArchVirol，2015，160(8)：2075-2078.

[18]MATTHIJNSSENS J，TARAPOREWALA Z F，YANG H，et al.Simian rotaviruses possess divergent gene constellations that originated from interspecies transmission and reassortment[J].JVirol，2010，84(4)：2013-2026.

[19]MATTHIJNSSENS J，CIARLET M，HEIMAN E，et al.Full genome-based classification of rotaviruses reveals a common origin between human Wa-Like and procine rotavirus strains and human DS-1-like and bovine rotavirus strains[J].JVirol，2008，82(7)：3204-3219.

[20]DURMAZ R，KALAYCIOGLU A T，ACAR S，et al.Prevalence of rotavirus genotypes in children younger than 5 years of age before the introduction of a universal rotavirus vaccination program：report of rotavirus surveillance in Turkey[J].PLoSOne，2014，9(12)：e113674.

[21]DOAN Y H，NAKAGOMI T，ABOUDY Y，et al.Identification by full-genome analysis of a bovine rotavirus transmitted directly to and causing diarrhea in a human child[J].JClinMicrobiol，2013，51(1)：182-189.

(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.021

收稿日期：2016-01-21

基金項目：“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD13B06)；四川省科技計劃項目青年基金(2014JQ0044)

作者簡介：周芳(1990-)，女，黑龍江德都人，碩士生，主要從事動物病原分子生物學(xué)研究，E-mail：1103306587@qq.com *通信作者：湯承，博士，教授，Tel/Fax：+86-28-85528276，E-mail：tangcheng101@163.com

中圖分類號：S852.653；S852.659.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1465-09

Establishment and Application of an RT-PCR Assay for Yak Rotavirus Based on the Sequence Analysis of Yak RotavirusVP6 gene

ZHOU Fang，YUE Hua，ZHANG Bin，LI Fan，CHEN Xi，TANG Cheng*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities/InnovativeResearchTeamonAnimalEpidemicPreventionandControlofEducationDepartmentofSichuan，Chengdu610041，China)

Abstract:Rotavirus (RV) VP6 gene is the main target gene of molecular detection，but the gene point mutations affects the molecular detection of RV.The purpose of this experiment was to establish a detection method of yak RV by RT-PCR method which applied in clinical samples based on the study of genetic variation yak RV VP6.The fragments of yak RV VP6 ranged in 931-1 338 bp were obtained with the primers designed by Prime 5.0 software from 30 samples of yak diarrhea.Sequence analysis showed that，yak RV VP6 genes represented multiple point mutations in the section of 931-1110 bp compared with bovine rotavirus (BRV)，while the section between 1 100-1 338bp was highly conserved.According to this result，the assay has successfully established a method with good specificity and stability.The primer could amplify the specific fragment of yak RV and BRV，with no amplification of other unrelated pathogens.The detection limit of viral nucleic acid of the assays was 0.45 pg·μL-1.With a remarkable detection rate in yak RV，the RT-PCR method provided a useful tool for the diagnosis and epidemiological investigation of yak RV disease.Additionally，this method can also be used in BRV detection.The RV detection rate in 234 samples of yak diarrhea from different provinces were 60.00% in Tibet (36/60)，95.00% in Qinghai (57/60)，85.19% in Sichuan(46/54) and 90.00% in Yunnan (54/60)，respectively.The result shows that RV infection is an important cause of yak diarrhea.

Key words:yak；rotavirus；VP6 gene；point mutation；RT-PCR