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    MicroR N A-132在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

    2016-08-08 02:58:20趙繼明彭健
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2016年5期
    關(guān)鍵詞:原位雜交逆轉(zhuǎn)錄結(jié)腸癌

    趙繼明,彭健

    (中南大學湘雅醫(yī)院,湖南 長沙 410008)

    MicroR N A-132在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

    趙繼明,彭健

    (中南大學湘雅醫(yī)院,湖南 長沙 410008)

    目的探討M i croRNA-132(m i R-132)在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義。方法實時逆轉(zhuǎn)錄定量PC R和原位雜交分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達情況。分析m i R-132表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達明顯低于正常結(jié)腸黏膜組織(P<0.01),m i R-132低表達與結(jié)腸癌分期更晚有關(guān)。多元回歸分析表明,m i R-132低表達與結(jié)腸癌患者生存期更短有關(guān)(P<0.01),m i R-132是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。結(jié)論m i R-132表達下調(diào)能夠促進結(jié)腸癌進展,是預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后的可靠指標,m i R-132也具有成為結(jié)腸癌靶向治療靶點的潛力。

    結(jié)腸癌;臨床病理參數(shù);m i R-132家族;預(yù)后

    結(jié)腸癌是全球常見的發(fā)病率和致死率都很高的惡性消化道腫瘤[1]。研究證明結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段、多因素參與的過程。結(jié)腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境等因素密切相關(guān),并且,結(jié)腸癌的發(fā)生涉及到遺傳突變,包括癌基因激活、抑癌基因失活、錯配修復基因突變及基因過度表達等。

    M i croRNAs(m i RNAs)是在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類進化上保守、單鏈小分子非編碼RNAs(17~25個核苷酸)。m i RNAs通過與其靶信使RNA轉(zhuǎn)錄子3'非翻譯區(qū)互補結(jié)合調(diào)控基因表達[2]。m i RNA-132在肺癌[3]和胰腺內(nèi)分泌腫瘤[4]中表達降低,而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]和胃癌中[6]的表達升高。不同腫瘤中m i RNA表達水平不同,提示m i RNAs在腫瘤細胞中功能不同,且m i RNA調(diào)控其潛在靶基因的方式十分復雜。目前尚未見m i R-132在結(jié)腸癌中作用研究的報道,本研究主要分析m i R-132表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1研究對象

    164例結(jié)腸癌組織標本均為湘雅醫(yī)院2009年1 月-2012年12月結(jié)腸癌病例,均經(jīng)手術(shù)治療,手術(shù)前未經(jīng)放化療等其他治療,經(jīng)病理確診均為結(jié)腸癌,患者年齡28~64歲,中位年齡(49±2.4)歲。平均隨訪期為38.1個月(6~58個月)。患者定期接受身體及超聲檢查,如有必要進行CT掃描??偵嫫谑侵甘中g(shù)至死亡間隔時間。

    1.2主要試劑

    RNA提取試劑盒和Taqm an m i RNA檢測試劑盒均購自美國Appl i ed Bi osyst em公司,DEPC購自美國Si gm a公司,乙醇、氯仿和異丙醇均購自北京化學試劑公司。

    1.3R N A提取及逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

    應(yīng)用RNA提取試劑盒從結(jié)腸癌組織中提取RNA,采用Taqm an m i RNA試劑盒檢測成熟體m i RNA-132的表達水平。內(nèi)參校正:實時逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-t i m e reverse t ranscri pt i onquant i t at i vepol ym erasechai nrect i on,Real-t i m e RT-qPCR)。每個樣品加樣量約為10 ng,由于受到RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響,每個樣品的等體積cDNA含量并不完全相同,為了校正此誤差,試驗中以RNU6為內(nèi)參。采用二步法檢測m i RNA-93相對表達量。第1步,用莖環(huán)引物合成互補DNA。m i RNA逆轉(zhuǎn)錄采用10 ng總RNA 15μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,在PCR管中加入逆轉(zhuǎn)錄混合液7μl,濃度為2 ng/μl的總RNA 5μl,3μl特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。輕輕混勻,在冰上放置5 m i n,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)16℃30 m i n,42℃保溫30 m i n,85℃保溫5 m i n,4℃保溫5 m i n。第2步,采用20μl反應(yīng)體系在ABI7300實時PCR儀中反應(yīng),反應(yīng)體系為2×的Taq m an uni ve RsAl PCR通用混合液 10μl,20×的Taqm an m i RNA特異引物1μl,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4μl,加無RNA酶水5μl補充至體積20μl。循環(huán)條件為94℃預(yù)變性10 m i n,95℃變性15 s,60℃退火60 s,擴增40個循環(huán)后觀察分析結(jié)果。所有的實時定量反應(yīng)包括無模板的對照反應(yīng),均按ABI7300實時PCR儀說明書進行,實驗中Ct檢測值在20~32之外的進行第2次重復檢測。應(yīng)用公式2-Δct計算m i RNA-93的相對表達量。

    1.4原位雜交檢測結(jié)腸癌組織中m i R-132l的表達

    結(jié)腸癌組織標本4 m m連續(xù)切片后,常規(guī)脫蠟脫水,H Cl于37℃反應(yīng)20 m i n增加組織通透性,4%多聚甲醛(0.1m ol/L PBS溶解)室溫條件下固定10 m i n,0.1 m ol/L TEA緩沖液Ⅰ[0.1 m ol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.25%(體積比)]和TEA緩沖液Ⅱ[0.1 m ol/l,三乙醇胺與乙酸酐混合液,濃度0.5%(體積比)]雜交前處理以增加組織陽性雜交的強度。雜交:探針m i R-132用雜交液稀釋至20 nm ol,滴加于組織切片上,45℃水浴鍋內(nèi)雜交18 h。雜交后用TI-kS溶液沖洗3次,每次10m i n,封閉液封閉25m i n(封閉非特異的抗體結(jié)合位點)。雜交后采用Ant i-Di goxi geni n-POD檢測地高辛探針與m i RNA結(jié)合復合物,TSA放大系統(tǒng)增強原位雜交反應(yīng)的陽性信號,NBT/BCIP顯色,顯微鏡下控制顯色反應(yīng),加核快紅復染3 m i n,中性樹膠封片。陽性對照和陰性對照:看家基因β-act i n的寡核苷酸探針做為每次雜交的陽性對照,不加探針的預(yù)雜交液做為每次實驗陰性對照。結(jié)果判斷:光學顯微鏡下對m i R-132在組織切片中每一組織點的表達進行綜合觀察判斷。①根據(jù)陽性染色強度判斷:細胞無染色為0分;細胞呈淺藍色記1分;細胞染成藍色并無背景染色,為中等陽性,記2分;細胞暈紫色,無背景著色,為強陽性,記3分。②根據(jù)陽性細胞數(shù)計分:無陽性細胞計0分;陽性細胞數(shù)≤30%計1分;30%~70%計2分;陽性細胞數(shù)>70%計3分。取兩種計分結(jié)果的乘積,0分為陰性,1、2、3、4、6及9分為陽性。其中1、2分計作弱陽性(+),3、4分計作陽性(++),6分計作強陽性(+++),9分計作強陽性(++++)。

    1.5統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析,LSD檢驗,比較m i R-132在結(jié)腸癌不同臨床分期和病理分級的中表達差異。癌組織和正常組織比較,用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1m i R N A-132在結(jié)腸癌組織中的表達水平

    Real-t i m e R T-qPCR檢測結(jié)果表明,m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達(1.48±0.27)明顯低于正常結(jié)腸組織(4.64±1.21)差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)(見圖1A、B)。

    本研究進一步采用原位雜交分析方法驗證了m i R-132在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達類型和細胞定位情況。原位雜交分析結(jié)果表明m i R-132主要表達于細胞核,而在正常結(jié)腸組織中呈強陽性表達(見圖2A、B和C)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達降低與正常結(jié)腸組織表達差異有統(tǒng)計學意義,該結(jié)果與Real-t i m e RT-qPCR結(jié)果一致,m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達明顯低于正常結(jié)腸組織。

    2.2m i R-132在結(jié)腸癌中表達降低與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

    將m i R-132原位雜交檢測的中位值3.74作為164例結(jié)腸癌患者的分組閾值,其中m i R-132低表達組104例,高表達組60例,統(tǒng)計分析結(jié)果表明m i R-132低表達組腫瘤與分期和分級相關(guān)(見表1)。m i R-132表達與結(jié)腸癌的其他病理特征無關(guān),如患者年齡、組織類型、腫瘤直徑、化療藥物抗性和腫瘤復發(fā)等。

    2.3結(jié)腸癌中m i R-132表達降低的預(yù)后價值

    Kapl an-M ei er生存曲線分析表明,低表達m i R-132的結(jié)腸癌患者與總生存期相關(guān)(見圖3)。此外,多元回歸分析表明m i R-132低表達(H R 23.74,95%CI:1.58,52.66,P=0.000)、TNM分期(H R 19.94,95%CI:1.27,42.85,P=0.000)和腫瘤組織分級(H R 16.23,95%CI:1.05,39.28,P=0.008)與總生存期相關(guān)(見表2)。多元COX回歸分析進一步校正其他預(yù)后因素,結(jié)果表明m i R-132是影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后因子(見表3)。

    圖1 m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異

    圖2 原位雜交檢測m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異

    表1 m i R-132表達與結(jié)腸癌臨床特征的關(guān)系

    圖3 結(jié)腸癌患者中m i R-132表達的生存曲線

    表3 多元回歸分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素

    表2 結(jié)腸癌中m i R-132表達降低的預(yù)后價值

    3 討論

    結(jié)腸癌早期癥狀不明顯,且無特異性腫瘤標志物,大多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時已處于進展期,當結(jié)腸癌患者接受治療后,復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素,由此導致結(jié)腸癌患者預(yù)后較差。最新研究結(jié)果顯示,與正常神經(jīng)元和胃組織相比,神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌組織中m i R-132表達上調(diào)[5-6]。此外,肺癌、膀胱癌、食管鱗癌、舌部鱗癌、子宮癌及睪丸癌等組織中亦有m i R-132表達下調(diào),提示m i R-132作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。人們試圖探討m i R-132在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的價值,但到目前還沒有發(fā)現(xiàn)有價值的結(jié)論。本研究結(jié)果表明,m i R-132在結(jié)腸癌中表達明顯下降。此外,m i R-132表達降低還與結(jié)腸癌患者侵襲性臨床病理特征和預(yù)后差密切相關(guān)。Li u等[5]在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn),m i R-132能夠作為胃癌患者預(yù)后因子。79例胃癌患者中,m i R-132在癌組織中的表達水平明顯高于相應(yīng)的正常組織。Set t y等在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn),m i R-132在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達更高,且m i R-132過表達與患者預(yù)后差相關(guān)[6]。這兩項結(jié)果與本研究結(jié)果不一致,造成結(jié)果不一致的原因目前尚不清楚,可能是因腫瘤類型、標本量大小及所采取的研究方法不同引起的。本實驗研究發(fā)現(xiàn)m i R-132表達在不同分期、分級結(jié)腸癌中存在明顯的差異表達,提示其表達的下調(diào)可能是結(jié)腸癌進展過程中的重要步驟。國內(nèi)學者楊秀芳等[7]研究m i R-132/212家族在肺癌中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌中過表達m i R-132能夠加快NSCLC細胞增殖,促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,表現(xiàn)出原癌基因的特征;而李書軍等[8]發(fā)現(xiàn)m i R-132在食管鱗癌中的表達明顯降低,與食管癌的臨床分期以及預(yù)后相關(guān),m i R-132表達水平可作為食管癌臨床分期、分級和預(yù)后的潛在指標。上述研究結(jié)果亦支持本實驗結(jié)果。根據(jù)以往研究結(jié)果m i R-132有可能發(fā)揮抑癌作用,也可能發(fā)揮促癌作用,具體發(fā)揮何種作用與腫瘤類型及腫瘤微環(huán)境有關(guān)。本研究結(jié)果表明,結(jié)腸癌組織中m i R-132呈低表達,且m i R-132低表達與分期更晚有關(guān),提示m i R-132表達下調(diào)促進結(jié)腸癌的發(fā)展,因此筆者認為m i R-132在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用。

    近來m i RNA家族被證實為腫瘤的有效標志物,并且是腫瘤細胞上皮表型的決定性因素[9]。m i R-132已被證實在多種人類腫瘤中表達下調(diào),被認為是腫瘤細胞遷移和侵襲過程中EM T的負向調(diào)控因子。m i R-132也被認為是增強結(jié)腸癌化療敏感性或誘導腫瘤細胞死亡的新靶點[11],而在一組卵巢腺癌細胞株內(nèi)或獲得性藥物抗性研究中發(fā)現(xiàn)m i R-132表達與紫杉醇和順鉑化療抗性有關(guān)。此外,還有多項研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中m i R-132表達明顯發(fā)生變化,但是這些研究結(jié)果多有相互沖突之處。部分研究屬于m i RNA表達譜特征分析,由于分析時采用的芯片平臺不一樣,可能導致部分結(jié)果差異。相比之下,本研究采用 Real-t i m e RT-qPCR和原位雜交法分析m i R-132在結(jié)腸癌中的表達情況,實驗結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中m i R-132表達明顯下降,而在原位雜交中進一步分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達情況,結(jié)果亦表明m i R-132在結(jié)腸癌中的表達低于正常結(jié)腸組織。提示m i R-132在結(jié)腸癌組織中低表達。本研究還發(fā)現(xiàn),m i R-132低表達組與分期和分級相關(guān),提示m i R-132表達抑制與結(jié)腸癌惡性程度更高密切相關(guān)??傊?,本實驗結(jié)果中m i R-132過表達抑制腫瘤進展,被認為是預(yù)測結(jié)腸癌患者生存的可靠生物標志物,m i R-132是進展期結(jié)腸癌患者潛在的有效治療靶點。

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    (申海菊編輯)

    Expression and roles of microRNA-132 in conlon carcinoma

    Ji-ming Zhao,Jian Peng
    (Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

    Objective To investigate the association of miR-132 expression with clinicopathological characteristics and overall survival in patients with colon cancer.Methods Expression levels of the miR-132 were detected using qRT-PCR andin situhybridization.Associations of miR-132 expression with clinicopathological factors and overall survival were statistically evaluated.Results The expression levels of miR-132 in the colon cancer tissues were significantly lower than those in the normal colon tissues,in line with the findings ofin situhybridization(P<0.01).In addition,the tumors with low miR-132 expression were more likely to have advanced clinical stage(bothP=0.006)and higher grade(P=0.01 and 0.02).Moreover,univariate analysis showed that the colon cancer patients with low miR-132 expression had shorter overall survival(P<0.01). Multivariate statistical analysis further identified miR-132 as an independent prognostic factor for colon cancer (P<0.01).Conclusions miR-132 low-expression may promote the aggressive tumor progression and be recognized as a reliable marker to predict the survival in patients with colon cancer.The three miRNAs could be attractive therapeutic targets in patients with advanced-stage colon cancer.

    colon cancer;clinicopathology;miR-132;prognosis

    R 735.35

    A

    1005-8982(2016)05-0048-05

    10.3969/j.i s sn.1005-8982.2016.05.010

    2015-08-28

    彭健,Tel:13607441906,E-m ai l:158924615@qq.com

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