不同針灸方法對膝骨關(guān)節(jié)炎模型細胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶影響的比較研究

陳益丹，邱華平，金肖青，彭　芳

(1.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，杭州　310053；2.浙江醫(yī)院，杭州　310013；3.杭州市上城區(qū)紫陽街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，杭州　310002)

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不同針灸方法對膝骨關(guān)節(jié)炎模型細胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶影響的比較研究

陳益丹1,2，邱華平3，金肖青2，彭芳2

(1.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，杭州310053；2.浙江醫(yī)院，杭州310013；3.杭州市上城區(qū)紫陽街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，杭州310002)

【摘要】目的比較針刺、溫針灸、電針三種不同針灸方法對膝骨關(guān)節(jié)炎模型白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的影響，探討不同針灸方法治療膝骨關(guān)節(jié)炎在關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)代謝方面的差異。方法選用新西蘭兔30只，隨機分為正常組、模型組、針刺組、溫針灸組及電針組，每組6只。通過切斷前交叉韌帶建立實驗性膝骨關(guān)節(jié)炎模型，各治療組選取“后三里”、“犢鼻”穴，分別施以單純針刺、溫針灸及電針治療，共治療20次。治療結(jié)束后采用ELISA法檢測各組血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3及TIMP-1水平，并比較組間各指標的差異。結(jié)果與模型組比較，各治療組血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平均明顯下降(P < 0.05或P < 0.01)，溫針灸組MMP-3水平明顯升高(P < 0.05)；各治療組間比較，電針組MMP-3水平低于針刺組、溫針灸組(P < 0.01)，IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平各治療組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。結(jié)論針刺、溫針灸、電針均能調(diào)節(jié)膝骨關(guān)節(jié)炎模型血清中異常的IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平，使軟骨退行性變的部分因素得到控制，從而起到延緩軟骨退變的作用，其中溫針灸的調(diào)節(jié)作用較為顯著。

【關(guān)鍵詞】骨性關(guān)節(jié)炎；針刺；溫針灸；電針；細胞因子；基質(zhì)金屬蛋白酶

關(guān)節(jié)軟骨的退變是骨關(guān)節(jié)炎的特征性病理學改變，正常狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的分解和合成維持著動態(tài)的平衡，這一過程受多種細胞內(nèi)外的蛋白分子及關(guān)節(jié)軟骨酶的調(diào)控。研究表明細胞因子(cytokine) 和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)及其特異性組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMPs)與關(guān)節(jié)軟骨的降解、骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)[1-3]。針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎是被臨床廣泛使用的非手術(shù)方法，多采用單純針刺、電針或溫針灸等方法，不同的針灸方法在臨床均被證實有效[4-6]。近年來針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究表明，各種針灸方法治療膝骨關(guān)節(jié)炎具有延緩軟骨退變的作用[7-9]，但目前不同針灸方法在延緩軟骨退變作用的異同尚不清楚。因此本研究擬通過建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，觀察并比較單純針刺、溫針灸、電針治療在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨代謝相關(guān)指標的變化與異同，為臨床針灸方法的選擇提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物及分組

清潔級新西蘭兔30只，雌雄各半，體重2～2.2 kg，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供【SCXK(浙)2010-0042】，生產(chǎn)單位：新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場。動物實驗環(huán)境設(shè)施為浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心【SYXK(浙)2013-0184】。實驗過程中對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的相關(guān)規(guī)定。動物在實驗環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，一般情況良好開始進行實驗。隨機選取6只作為正常組，其余24只建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。將建模后的24只新西蘭兔根據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為模型組、針刺組、溫針灸組及電針組，每組各6只。

1.2主要試劑及儀器

兔IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測試劑盒(美國Rapibio Lab公司)；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)；Sunrise吸光酶標儀(瑞士TECAN公司)；Baso 2002-2離心機(臺灣貝索公司)；MDF-5410醫(yī)用低溫保存箱(日本SANYO公司)；DK-600型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.3動物模型的建立

模型組和治療組均采用右側(cè)膝關(guān)節(jié)切斷前交叉韌帶(Anterior Cruciate Ligament Transection,ACLT)制備膝骨關(guān)節(jié)炎模型。3%戊巴比妥鈉1 mL/kg 耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后即予首次肌注青霉素鈉每只40 萬U預防感染，術(shù)野皮膚常規(guī)無菌操作，從右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕骨旁切口進入，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶，確認抽屜試驗陽性，術(shù)中注意止血，用青霉素鈉生理鹽水清理傷口，逐層縫合后放入籠中單獨飼養(yǎng)，自由飲食。術(shù)后5 d每只新西蘭兔每天肌注40 萬U青霉素鈉以預防手術(shù)創(chuàng)口感染。

1.4干預方法

穴位定位根據(jù)新世紀全國高等中醫(yī)藥院校創(chuàng)新教材《實驗針灸學》中“常用實驗動物針灸穴位”的規(guī)定，穴取右側(cè)“犢鼻”、“后三里”穴，犢鼻位于髕韌帶外側(cè)凹陷處；后(足)三里位于小腿背外側(cè)上1/5折點處，約當腓骨頭下1.2 cm，脛骨嵴后1 cm。造模完成一周后開始對各治療組患側(cè)膝關(guān)節(jié)進行針灸治療，穴取“犢鼻”、 “后三里”，隔日治療一次，十次為一個療程，連續(xù)治療二個療程，療程間隔5 d。針刺組單純針刺20 min；電針組采用2/100 Hz疏密波，強度1～2 mA，以新西蘭兔下肢微微抖動為度，每次電針20 min；溫針灸組針刺后將1 cm長度艾段置于針柄上點燃，為避免皮膚局部燙傷可墊紙片，待艾柱燃盡后起針。模型組造模完成后不作針刺處理，同步飼養(yǎng)。正常組不造模、不針刺，同步飼養(yǎng)。模型組、正常組與治療組進行相同的抓取與固定。

1.5血清指標測定

治療結(jié)束后第2天進行血清取材。將動物固定于兔架上耳緣靜脈采血10 mL，靜置后3000 r/min離心10 min，分離血清后分裝于Eppendorf管，-70 ℃低溫冰箱中保存，以備統(tǒng)一檢測。采用ELISA法測定血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的水平，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1各組血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1、MMP-3、TIMP-1濃度比較

與正常組比較，模型組IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1濃度顯著升高(P<0.01)，MMP-3水平明顯降低(P<0.01)，TIMP-1變化無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；針刺組與電針組MMP-3水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；電針組TIMP-1水平較正常組低(P<0.05)。與模型組比較，各治療組血清中IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平均降低(P<0.05或P<0.01)，溫針灸組MMP-3水平明顯升高(P<0.05)。各治療組間比較：電針組MMP-3水平低于針刺組及溫針灸組(P<0.05或P<0.01)，TIMP-1低于針刺組(P<0.05)，IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1水平各治療組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(見表1)。

組別groupsIL-1βTNF-αTGF-β1MMP-1MMP-3TIMP-1空白組Control104.42±26.9921.90±5.872.40±0.890.94±0.2564.84±7.601.93±0.26模型組Model406.28±34.52★★76.40±5.93★★20.31±12.13★★1.45±0.32★★32.02±5.78★★1.89±0.26針刺組Acupuncturegroup74.13±5.71△△14.15±1.19△△2.87±0.55△△0.64±0.18△△39.66±6.56★1.88±0.08溫針灸組Warm-needleacupuncturegroup120.44±29.74△△25,21±6.40△△4.40±2.55△△0.99±0.31△53.57±10.61△1.80±0.26電針組Electro-acupuncturegroup110.05±13.39△△21.24±2.42△△3.59±0.99△△0.80±0.12△△22.23±4.33★★■■※※1.59±0.08★△■

注：與空白組比較，★P< 0.05，★★P< 0.01；與模型組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01；與針刺組比較，■P< 0.05，■■P< 0.01；與溫針灸組比較，※※P< 0.01。

Note：★P< 0.05，★★P< 0.01 vs. control group;△P< 0.05，△△P< 0.01 vs. model group;■P< 0.05，■■P< 0.01 vs. acupuncture group;※※P< 0.01 vs. warm-needle acupuncture group.

3討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種以軟骨進行性破壞，伴隨骨質(zhì)增生反應的退行性疾病，這種軟骨的破壞源自軟骨內(nèi)細胞外基質(zhì)合成與降解穩(wěn)態(tài)的失衡[10]。軟骨基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能有賴各種細胞因子的調(diào)控，其中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)可以引起基質(zhì)降解過程中多種酶的產(chǎn)生，包括基質(zhì)金屬蛋白酶家族，抑制Ⅱ型膠原的合成，引起軟骨基質(zhì)的破壞，抑制軟骨基質(zhì)的修復，最終導致關(guān)節(jié)軟骨的破壞，是KOA病理過程中促進軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的細胞因子[11-12]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)對軟骨細胞的分化和基質(zhì)合成起刺激作用[13]，TGF-β1在正常表達情況下對軟骨是一種保護性因子，但在病理條件下TGF-β1表達的異常升高也會對軟骨造成損壞，并誘發(fā)骨贅形成[14]。TGF-β1對軟骨組織的作用有劑量-效應關(guān)系，當其分泌增多時，可與其他分解性細胞因子協(xié)同作用，抑制細胞增殖，促進軟骨基質(zhì)降解，進一步加重軟骨損傷[15]，因此早期抑制TGF-β1可以影響骨關(guān)節(jié)炎過程中骨贅形成的速度[16]，是治療OA的一種潛在治療方法[17]。基質(zhì)金屬蛋白酶被認為是軟骨退變的有關(guān)媒介，研究表明MMP-1、MMP-3的異常表達在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-19]，膝骨關(guān)節(jié)炎MMP-1、MMP-3水平明顯升高[20-23]。

本研究結(jié)果顯示模型組具有軟骨破壞作用的IL-1β、TNF-α、MMP-1與具有一定軟骨修復作用的TGF-β1水平均明顯升高，取得了與既往研究一致的結(jié)果[15,23-24]，而模型組MMP-3水平較空白組降低，與既往研究結(jié)果不一致[20-22]，Poleni[25]曾報道TGF-β1可降低MMP-3的表達，本研究中MMP-3的降低是否與TGF-β1水平的升高有關(guān)需進一步研究證實。本研究觀察時間點為造模后8周，為骨關(guān)節(jié)炎的早中期病變階段[26]，本研究結(jié)果提示早中期膝骨關(guān)節(jié)炎模型處于軟骨破壞與修復共存的狀態(tài)，而經(jīng)過針刺、溫針灸、電針早期干預治療后可明顯抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1、MMP-1的表達，使保護性和降解性因子之間的失調(diào)趨于平衡。由此可見不同的針灸方法在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制是相似的，均可通過調(diào)節(jié)細胞因子IL-1β、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1及TGF-β1而發(fā)揮其延緩軟骨退變的作用。

單純針刺、溫針灸、電針三種不同針灸方法治療模型膝骨關(guān)節(jié)炎比較發(fā)現(xiàn)，在調(diào)節(jié)TGF-β1及MMP-1方面是一致的，均能顯著降低TGF-β1及MMP-1水平。本研究結(jié)果顯示溫針灸在改善MMP-3的表達優(yōu)于針刺組及電針組，且對IL-1β、TNF-α、TGF-β1及MMP-1均能調(diào)節(jié)至正常水平，表明溫針灸通過抑制IL-1β、TNF-α、TGF-β1及MMP-1水平，升高MMP-3水平實現(xiàn)修復關(guān)節(jié)軟骨的作用，從而延緩軟骨退變，治療膝骨關(guān)節(jié)炎。臨床也證實治療膝骨關(guān)節(jié)炎溫針灸總體療效優(yōu)于單純針刺[27]，緩解關(guān)節(jié)僵硬癥狀優(yōu)于電針[28-29]。膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)屬于“痹癥”范疇，寒濕在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中至關(guān)重要，因此溫針灸在針刺基礎(chǔ)之上結(jié)合艾灸的溫熱效應，起到改善局部循環(huán)，溫經(jīng)通絡(luò)的作用，能明顯改善疼痛、關(guān)節(jié)活動等癥狀[5]。本研究結(jié)果提示臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎，采用針刺、溫針灸、電針進行早期干預均具有延緩軟骨退變的作用，其中溫針灸療法在調(diào)節(jié)失衡的炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3及TGF-β1優(yōu)勢明顯。

由此我們得出結(jié)論：膝骨關(guān)節(jié)炎的早期針灸干預治療，單純針刺、溫針灸、電針均有較明顯的調(diào)節(jié)軟骨代謝相關(guān)因子的作用，但效應仍有一定的差異性，其中溫針灸作用最為明顯，其具體作用機制需進一步深入研究。

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〔修回日期〕2016-12-25

[基金項目]浙江省自然基金項目(LQ13H270001)；浙江省中醫(yī)藥管理局項目(2012ZQ003)；浙江省中西醫(yī)結(jié)合老年醫(yī)學重點學科項目(2012-XK-A04)。

[作者簡介]陳益丹(1978-)，女，博士生，研究方向：針灸治療骨性關(guān)節(jié)炎的臨床和基礎(chǔ)研究。E-mail: chenyidan0908@126.com。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0042-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.008

A comparative study on influence of cartilagemetabolism factors onknee osteoarthritis experimental model with acupuncture, warm needle acupuncture and electro-acupuncture

CHEN Yi-dan1,2，QIU Hua-ping3，JIN Xiao-qing2，PENG Fang2

(1. Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2. Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，China； 3. Ziyang Community Health Service Center of Shangcheng District， Hangzhou 310002,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the influence of acupuncture,warm-needle acupuncture, electro-acupuncture on cartilage metabolism-related factors of the experimental knee osteoarthritis model, and explore the similarities and differences of mechanism in different kinds of acupuncture treatment. MethodsNew Zealand rabbits were equally randomized into control, model,acupuncture, warm-needle acupuncture and electro-acupuncture groups. KOA model was duplicated by anterior cruciate ligament transaction (ACLT). After KOA model was established one week, acupointsof“Dubi”(ST35),“Zusanli”(ST36) were used for treatment with different acupuncture treatmentstwenty times totally. The concentration of IL-1β, TNF-α, TGF-β1,MMP-1,MMP-3 and TIMP-1 in serum were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). ResultsIn comparison with control group, the concentration of IL-1β, TNF-α, TGF-β1,MMP-1 increased significantly in model group(P < 0.05),while MMP-3 reduced significantly(P < 0.05); compared with model group, IL-1β,TNF-α, TGF-β1,MMP-1 reduced significantly in each treatmentgroup(P < 0.05 or P < 0.01),MMP-3 increased significantlyin warm-needle acupuncture group(P < 0.05); comparison of IL-1β,TNF-α, TGF-β1,MMP-1in serum was not statistically significant (P >0.05) between treatment groups; MMP-3, TIMP-1 were significantly lower in electro-acupuncture group compared with acupuncture and warm-needle acupuncture group (P < 0.05 or P < 0.01).ConclusionsAcupuncture,warm-needle acupuncture and electro-acupuncture all can regulate cartilage metabolism-related factors and effectively delay cartilage degeneration,especially warm-needle acupuncture.

【Key words】Osteoarthritis; Acupuncture; WarmNeedleAcupuncture; Electro-acupuncture; Cytokine; Matrix metalloproteinase