足底電擊應激時程對大鼠焦慮樣行為的影響

耿婷婷，汪婷婷，姜勁峰，徐旺芳，榮長保

(南京中醫(yī)藥大學，南京　210029)

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足底電擊應激時程對大鼠焦慮樣行為的影響

耿婷婷，汪婷婷，姜勁峰，徐旺芳，榮長保

(南京中醫(yī)藥大學，南京210029)

【摘要】目的觀察足底電擊應激時程對大鼠高架十字迷宮及開場實驗焦慮樣行為的影響。方法選取成年雄性SD大鼠按照體重分層隨機分為對照組和足底電擊組，每組12只。足底電擊組予以不可逃避性足底電擊(0.8 mA，電擊10 s，休息20 s，共5 min，1次/d)結合孤養(yǎng)建立大鼠焦慮模型。分別在足底電擊7 d及14 d后測高架十字迷宮和開場實驗，評估大鼠的焦慮行為。結果7 d及14 d足底電擊后，足底電擊組焦慮樣行為增加，差異具有顯著意義(P<0.01)，入臂總次數明顯低于對照組，運動活性降低。開場實驗足底電擊組進入中心區(qū)次數及中心區(qū)逗留時間低于對照組(P<0.01)，運動總距離、直立次數及理毛次數足底電擊組均明顯低于對照組(P<0.01)，運動探索活性降低。比較7天及14天足底電擊組行為學結果，可見隨著造模天數的增加，大鼠閉臂時間比及閉臂次數比呈現下降趨勢(P<0.05)，焦慮程度降低。開場實驗運動總距離、直立次數及理毛次數14 d低于7 d，差異具有顯著性(P<0.05)，提示大鼠運動探索行為進一步減少，自我關注度降低，抑郁樣行為增加。結論 不同時程的足底電擊應激導致大鼠焦慮樣行為，影響大鼠運動探索活性。隨著造模天數的增加，大鼠行為可能從焦慮樣向抑郁樣改變。足底電擊應激焦慮模型造模時程的選擇7 d優(yōu)于14 d。

【關鍵詞】焦慮；動物模型；足底電擊；行為學

焦慮障礙在現今社會非常普遍，病程緩慢，與眾多負面結果相關，如自殺風險更大，合并內科病，并且當與抑郁共病緩解率低[1]。焦慮障礙的研究需要動物模型的支持。雖然嚙齒類動物焦慮樣行為與人類臨床焦慮定義有所區(qū)別，二者相似的受累腦區(qū)，以及人類抗焦慮藥物對嚙齒類動物行為學的改善，說明嚙齒類動物焦慮樣行為的研究可以對人類的焦慮問題研究提供線索[2]。

應激在神經變性疾病和精神疾病相關的眾多病理生理過程中扮演重要角色[3]。過度的應激反應與焦慮相關[4]。已有研究顯示短期的慢性應激可導致大鼠焦慮樣行為[5]。足底電擊應激是經典應激方式的一種，廣泛地應用于條件恐懼相關研究[6-7]。焦慮與恐懼關系密切[8]，已有不少研究采用不可避免足底電擊應激制造焦慮抑郁動物模型[9-10]。但目前缺少不同時程的足底電擊應激對大鼠焦慮樣行為影響的研究。我們將成年SD大鼠足底電擊不同時程后，觀察不同程度的慢性應激刺激對大鼠高架十字迷宮及開場實驗所示焦慮樣行為的影響，目的是尋找到足底電擊焦慮模型的最佳造模時間節(jié)點，為研究典型焦慮樣行為提供實驗基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物及分組

SPF級SD雄性大鼠24只，體重為200～220 g, 6周齡，由上海實驗動物資源中心(西普爾-必凱)提供【SCXK(滬)2013-0016】。動物飼養(yǎng)在大鼠通風鼠籠中，環(huán)境溫度控制在21～23℃，濕度為 50% 左右，食水自由。實驗于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SYXK(蘇)2014-0001】內進行。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守我國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物適應飼養(yǎng)一周后，按體重分層隨機分為對照組(control group,12只)、足底電擊組(footshock group，FS，12只)。1.1.2儀器與設備

實驗器材：足底電擊箱(SLY-SRC刺激記錄控制器，北京碩林苑科技有限公司)；大鼠通風鼠籠(EVC，蘇州猴皇動物實驗設備科技有限公司)；動物行為錄像及分析采用TopScan-動物行為智能分析系統(Cleversys，America)。

1.2方法

1.2.1實驗方案

為避免大鼠間氣息交流影響情緒狀態(tài)，本實驗足底電擊組均采用孤養(yǎng)，大鼠通風鼠籠設備可避免大鼠間氣息交流。對照組群養(yǎng)，每日撫摸數分鐘，余不作任何處理。足底電擊組每日接受一次足底電擊，電擊參數：0.8 mA，電擊10 s，休息20 s，共5 min。在足底電擊7 d及14 d后測高架十字實驗(10:00～12:30)、開場實驗(14:00～15:00)，評估大鼠的焦慮行為。

1.2.2高架迷宮實驗

高架十字迷宮(Elevated plus maze，EPM)裝置(TopScan-動物行為智能分析系統，Cleversys，America)由兩條相對開放臂(50 cm×l0 cm)和兩條相對閉合臂(50 cm×l0 cm×40 cm)及中央區(qū)(10 cm×l0 cm)連接而成，距離地面50 cm。實驗前將大鼠搬至實驗室適應環(huán)境1 h以上，保持室內安靜，暗光。實驗開始時將大鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，記錄5 min內的活動情況。觀察大鼠進入開臂和閉臂的次數及停留時間。每只大鼠實驗結束后取出，將各臂清理干凈，并用75%的酒精去除氣味。行為學結果(1)閉臂時間比=閉臂時間/(開臂時間+閉臂時間)；(2)閉臂次數比=閉臂次數/(開臂次數+閉臂次數)。(3)入臂總次數=閉臂次數+開臂次數。行為學結果應用SPSS軟件箱式圖法剔除離群值。1.2.3開場實驗

本實驗敞箱長×寬×高為：100 cm×100 cm×40 cm，內面及底面均為藍色，中央區(qū)正上方安置攝像頭。實驗第8天及第15天時，每組大鼠分別進行曠場實驗，實驗前把動物提前1 h搬進測試室適應環(huán)境，實驗開始后，將大鼠放到中央區(qū)固定位置，每次放置頭部固定朝向一側。每只大鼠測量5 min，測量指標包括運動總距離、中央區(qū)停留時間、中央區(qū)進入次數、直立次數及理毛次數，隨后用75%酒精清潔箱內環(huán)境，等酒精揮發(fā)無味后，再進行下1只。

1.3數據分析

2結果

2.1高架十字迷宮行為學結果比較

足底電擊組閉臂次數比、閉臂時間比均較對照組明顯增加，入臂總次數低于對照組(P<0.01)，顯示足底電擊致大鼠焦慮樣行為，導致大鼠運動活性下降。14 d與7 d比較時發(fā)現，足底電擊組14 d閉臂次數比及閉臂時間比較7 d降低(P<0.05)，對照組兩時間點無差異。

2.2 開場行為學結果

足底電擊7 d和14 d與對照組相應時程對比，中央區(qū)進入次數、中央區(qū)停留時間及運動總距離顯著低于對照組(P<0.01，P<0.05)。足底電擊14 d與足底電擊7 d相比，運動總距離進一步下降，大鼠直立次數及理毛次數顯著減少(P<0.05)，而中央區(qū)停留時間及進入次數兩電擊天數之間的差異不大。對照組兩時間點比較，除理毛次數外，其余開場行為學結果未見明顯差異。

Tab.1Comparison of rat's behavior in the elevated plus maze of different footshock-stress duration

時程Duration閉臂次數比CE%(thepercentageofentriestotheclosearm)閉臂時間比CT%(thepercentageoftimespentintheclosearm)入臂總次數TotalentriesFS7d 7days(FSgroup)0.85±0.13**0.95±0.05**10.11±5.82**對照組7d 7days(controlgroup)0.52±0.080.47±0.1328.5±5.01FS14d 14days(FSgroup)0.68±0.10**#0.81±0.14**#14±8.17*對照組14d 14days(controlgroup)0.51±0.070.49±0.1332.4±9.79

注：與對照組相應時程相比，*P<0.05，**P<0.01；與足底電擊7 d相比，#P<0.05。

Note：*P<0.05，**P<0.01,compared with the corresponding duration(control group)；#P<0.05, compared with 7 days(FS group).

Tab.2Comparison of rat's behavior in the open-field test of different footshock-stress duration

時程Duration運動總距離(cm)Totalmovementdistance中央區(qū)進入次數Entrancetimestothecentralzone中央區(qū)停留時間(s)Retentiontimeinthecentralzone直立次數Numbersofrears理毛次數NumbersofgroomingFS7d7days(FSgroup)374.75±210.62*1.87±1.64**2.94±2.84**8.8±5.07**2.75±1.83**對照組7d7days(controlgroup)640.55±216.526.89±2.5714.1±3.5317.2±2.8610±2.24FS14d14days(FSgroup)220.44±191.31*#1.25±1.04**2.49±2.35**4.5±3.17**#1.2±1.03**#對照組14d14days(controlgroup)579.69±381.195.78±2.2210.33±4.7119.86±3.803.86±1.57

注：與對照組相應時程相比，*P<0.05，**P<0.01；與足底電擊7 d相比，#P<0.05。

Note：*P<0.05，**P<0.01,compared with the corresponding duration(control group)；#P<0.05, compared with 7 days(FS group).

3討論

關于如何建立起較為合理的焦慮動物模型，目前應用的造模方法有很多種，包括：高架十字迷宮、空瓶刺激、天敵暴露、飲水沖突等等，但是仍然存在很多不確定因素和干擾因素[5]。應激是精神疾病的重要基礎，與焦慮抑郁密切相關[3]，慢性應激焦慮模型可作為焦慮模型的一種[5]。

應激的不同時程影響動物行為，急性應激時,動物的活動增加,但是隨應激時間的延長,動物的行為活動逐漸減少,表現為由興奮焦慮狀態(tài)過渡到壓抑抑郁狀態(tài)[11]。應激發(fā)生的不同時期(新生期或成熟期)以及不同時程對腦結構功能、行為、認知產生不同的效應[12]，這種影響與應激所致機體神經內分泌改變相關[13]。分別于強迫游泳應激第1,3,7,14和28天觀察應激對大鼠海馬谷氨酸、天冬氨酸及γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)含量的影響，結果顯示第3天開始海馬興奮性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量持續(xù)增高，興奮性氨基酸拮抗劑GABA含量在急性應激時降低，于14 d后開始增高[14]。金玉祥等[15]的研究發(fā)現在不同足底電擊應激時程，大鼠腦內一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達呈現動態(tài)變化：應激早期(1～6 d)NOS陽性神經元的核團數目增多,NOS活性增加；隨著應激時程延長，陽性核團數目逐漸減少，15 d時眾多腦區(qū)的NOS表達較前明顯下降?；谝陨希詰そ箲]模型需要把握應激時程。焦慮與抑郁往往伴發(fā)出現，焦慮反應和抑郁反應之間可能僅僅存在一個時間跨度，短期的刺激可以導致焦慮，而在此基礎上的延長刺激則可導致抑郁發(fā)生[5]。比較大鼠7 d、14 d以及21 d行為學表現，發(fā)現14 d慢性束縛應激大鼠主要表現為焦慮狀態(tài)，而21 d大鼠則主要以抑郁為主[16]。綜合之前的各項研究，我們選擇7 d及14 d這兩個時間節(jié)點觀察足底電擊應激時程對大鼠焦慮樣行為的影響。

本實驗采用高架十字迷宮及開場實驗評價足底電擊應激所致大鼠焦慮樣行為，基于引起焦慮因素，例如未受保護的、升高的區(qū)域或一個開放區(qū)域，焦慮水平被表達為進入厭惡區(qū)域的次數及逗留時間[17]。除此以外，高架十字迷宮的入臂總次數，開場的運動總距離及直立次數可以表征大鼠運動活性及探索欲望[18]，理毛次數反映大鼠對自己的關注度，大鼠運動探索及自我關注的下降，一定程度上反映大鼠抑郁樣行為[19-20]。已有研究表明間隔一周的兩次高架及開場實驗主要指標在初測及復測實驗中均呈較好相關性及較好復測信度[21-22]，可以認為大鼠對高架十字迷宮及開場實驗的適應和記憶效應并未太大影響實驗結果。本研究足底電擊組在高架十字迷宮及開場實驗中均顯示出對開放區(qū)域的回避，表現為閉臂停留時間及進入次數的增多，開場中心區(qū)探索時間及進入次數的減少，焦慮樣行為顯著。與此同時，入臂總次數、開場運動總距離、直立及自我修飾次數較對照組也顯著降低，顯示明顯抑郁樣行為。比較不同造模時間，我們還觀察到隨著足底電擊應激時程的增加，大鼠焦慮樣行為減輕，抑郁程度加重。

綜上所述，足底電擊結合孤養(yǎng)可致大鼠焦慮樣行為，可作為慢性應激焦慮模型的一種。 14 d大鼠的焦慮程度較7 d有所下降，然而大鼠運動探索活性及自我關注度進一步降低，抑郁樣行為增加?？梢哉J為足底電擊應激焦慮模型造模時程的選擇，7 d較14 d更優(yōu)。我們的實驗結果從行為學角度進一步支持應激時程影響動物焦慮抑郁樣行為的觀點，研究應激相關精神疾病應重視應激的時程、強度以及應激類型的差別，這與臨床實際情況更加接近，并且時程影響背后的機制仍需進一步研究。

參考文獻：

[1]Etkin A. Neurobiology of anxiety: from neural circuits to novel solutions?[J]. Depression and anxiety, 2012, 29(5): 355-358.

[2]Adhikari A. Distributed circuits underlying anxiety[J]. Frontiers in behavioral neuroscience, 2014, 8(112):1-5.

[3]Esch T, Stefano G B, Fricchione G L,etal. The role of stress in neurodegenerative diseases and mental disorders[J]. Neuroendocrinology Letters, 2002, 23(3): 199-208.

[4]Habib K E, Gold P W, Chrousos G P. Neuroendocrinology of stress[J]. Endocrinology and metabolism clinics of North America, 2001, 30(3): 695-728.

[5]趙宏波, 白曉暉, 李曉娟, 等. 逍遙散治療慢性束縛應激焦慮模型大鼠行為學評價[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014, 29(5): 1669-1673.

[6]Milad M R, Pitman R K, Ellis C B,etal. Neurobiological basis of failure to recall extinction memory in posttraumatic stress disorder[J]. Biological psychiatry, 2009, 66(12): 1075-1082.

[7]Lisboa S F, Gomes F V, Silva A L,etal. Increased contextual fear conditioning in iNOS knockout mice: additional evidence for the involvement of nitric oxide in stress-related disorders and contribution of the endocannabinoid system[J]. International Journal of Neuropsychopharmacology, 2015: pyv005.

[8]Weinberger D R. Anxiety at the frontier of molecular medicine[J]. New England Journal of Medicine, 2001, 344(16): 1247-1249.

[9]Musazzi L, Milanese M, Farisello P,etal. Acute stress increases depolarization-evoked glutamate release in the rat prefrontal/frontal cortex: the dampening action of antidepressants[J]. PloS one, 2010, 5(1): e8566.

[10]Mallei A, Giambelli R, Gass P,etal. Synaptoproteomics of learned helpless rats involve energy metabolism and cellular remodeling pathways in depressive-like behavior and antidepressant response[J]. Neuropharmacology, 2011, 60(7): 1243-1253.

[11]Beck K D, Luine V N. Food deprivation modulates chronic stress effects on object recognition in male rats: role of monoamines and amino acids[J]. Brain research, 1999, 830(1): 56-71.

[12]Lupien S J, McEwen B S, Gunnar M R,etal. Effects of stress throughout the lifespan on the brain, behaviour and cognition[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2009, 10(6): 434-445.

[13]De Kloet E R, Jo?ls M, Holsboer F. Stress and the brain: from adaptation to disease[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6(6): 463-475.

[14]吳東輝, 楊權, 許崇濤. 應激對大鼠海馬谷氨酸, 天冬氨酸和 γ—氨基丁酸含量的影響[J]. 中華精神科雜志, 2003, 36(2): 98-100.

[15]金玉祥, 陳嘉峰. 應激性防御反應過程中腦內一氧化氮合酶陽性神經元分布的變化[J]. 神經解剖學雜志, 2000, 16(1): 29-32.

[16]姜幼明.逍遙散對慢性束縛應激焦慮模型大鼠杏仁核CRF1型受體及受體后信號通路的調節(jié)作用[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2012

[17]Carola V, D'Olimpio F, Brunamonti E,etal. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice[J]. Behavioural brain research, 2002, 134(1): 49-57.

[18]王麗娜, 郭小兵, 馬金芳, 等. 青年與老齡昆明小鼠焦慮動物模型結構維度比較[J]. 中華行為醫(yī)學與腦科學雜志, 2013, 22(6): 514-516.

[19]許晶, 李晚秋. 慢性應激抑郁模型的建立及其評價[J]. 中國行為醫(yī)學科學, 2003, 12(1): 14-17.

[20]王丹. 抑郁癥動物模型及行為學評價[J]. 西安文理學院學報: 自然科學版, 2012, 15(2): 51-53.

[21]宗紹波, 魏盛, 蘇云祥, 等. 焦慮大鼠模型高架十字迷宮實驗的復測信度檢驗及參數相關性分析[J]. 中國醫(yī)藥導報, 2011, 8(30): 5-7.

[22]孫世光, 王婧婧, 李自發(fā), 等. 曠場實驗: 昆明小鼠行為學評價方法的重測信度檢驗[J]. 中華行為醫(yī)學與腦科學雜志, 2010 (12): 1093-1095.

〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]國家自然科學基金面上項目(81373747)。

[作者簡介]耿婷婷(1990-)，女，碩士生。研究方向：針灸效應規(guī)律及其機制研究。 [通訊作者]姜勁峰(1967-)，男，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：針灸效應規(guī)律及其機制研究。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0069-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.013

The influence of footshock stress duration on anxiety-like behavior in rats

GENG Ting-ting，WANG Ting-ting，JIANG Jin-feng，XU Wang-fang，RONG Chang-bao

(Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of footshock (FS) -stress duration on anxiety-like behavior in the elevated plus-maze and open-field tests. MethodsRats (24) were randomly divided into 2 groups: the control group and the FS group. In the FS group, the anxiety model of rat was produced by inevitability footshock (5 minutes in total, once a day; 0.8mA, lasted for 10 seconds, 20 seconds interval) combined with separation. Anxiety-like behavior was evaluated by elevated plus maze and open-field tests after 7 and 14 days of FS-stress. ResultsAfter 7 days and 14 days of FS-stress, FS group showed significantly enhanced anxiety-like behavior and reduced locomotion indicated by total entries as compared to the control group (P<0.01). In the open field test, the entrance times and the retention time in the central zone, the total movement distance, the numbers of rears and grooming in rats in the FS group were lower than those in the control group, which showed lower locomotion and exploratory activity in the FS groups (P<0.01，P<0.05).Compared to 7 days of FS-stress, both CT% (the percentage of time spent in the close arm) and CE% (the percentage of entries to the close arm) were reduced after 14 days of FS-stress showing the decreasing anxiety (P<0.05), as well as the total movement distance and the numbers of rears and grooming (P<0.05). The reduced locomotion and exploratory activity and self-regarding in the FS group demonstrated the enhanced depression-like behavior in rats.ConclusionsChronic FS-stress contributes to lower locomotion and exploratory activity in rats and leads to anxiety-like behavior in rats. The increased duration of chronic FS-stress may lead to the behavior change from anxiety-like behavior to depression-like behavior, and 7-days is better than 14-days in making the anxiety model in rats.

【Key words】Anxiety; Animal model; Footshock; Behavior