仙臺(tái)病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立

周潔，趙麗娟，2，陶凌云，倪麗菊，高誠*，陳洪巖3*

（1.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，哈爾濱 150001）

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仙臺(tái)病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立

周潔1，趙麗娟1，2，陶凌云1，倪麗菊1，高誠1*，陳洪巖3*

（1.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；
3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，哈爾濱 150001）

【摘要】目的 建立一種快捷、靈敏的檢測方法，即反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方（RT-LAMP）用于仙臺(tái)病毒（SeV）的檢測。方法 根據(jù)GenBank公布的SeV序列（DQ219803.1），在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)了六套LAMP引物，利用LAMP Real-Time Turbidimeter LA-320C儀監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程并篩選最佳引物、反應(yīng)條件，建立對(duì)SeV核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-LAMP檢測方法，并可通過加入目測熒光檢測試劑肉眼判斷結(jié)果。對(duì)所建立的方法進(jìn)行了敏感性、特異性評(píng)估并對(duì)92份樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果 該方法在63℃恒溫下作用60 min，SeV RNA獲得了高效率的特異性擴(kuò)增，與其余常見小鼠病毒無交叉反應(yīng)；最低檢出量為2.1TCID50SeV，比RT-PCR方法高102倍；肉眼判斷結(jié)果與Real-Time Turbidimeter LA-320儀監(jiān)測結(jié)果一致；通過對(duì)92份樣品的RT-LAMP，RT-PCR和間接ELISA方法的檢測比對(duì)，三者符合率為100%。結(jié)論 建立的SV RT-LAMP檢測方法具有快速、特異、靈敏，操作簡單的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】仙臺(tái)病毒；RT-LAMP；實(shí)時(shí)監(jiān)控；快速檢測

仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）又名hemagglutinating virus of Japan（HVJ），是引起嚙齒類動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一，一年四季均可發(fā)病，但以春季多發(fā)，具有傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)，在多數(shù)情況下呈隱性感染，難以從群體中清除。鼠群感染后可導(dǎo)致孕鼠繁殖率下降，新生仔死亡率增加。SeV是清潔級(jí)及以上等級(jí)實(shí)驗(yàn)用鼠的必檢項(xiàng)目，同時(shí)它也可感染靈長類動(dòng)物［1，2］。目前SeV項(xiàng)目的檢測普遍采用國標(biāo)推薦的間接ELISA方法檢測血清抗體，ELISA方法具有快捷、方便、敏感、易于大批量檢測和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，無疑是較為理想的檢測方法，在今后相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)，間接ELISA方法還將是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測的主流。但該方法不適用于裸小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測。裸小鼠即無胸腺的免疫缺陷小鼠，是醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，特別是在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品與生物制品的安全性評(píng)價(jià)及有效藥品的篩選等實(shí)驗(yàn)方面有著特殊的價(jià)值［3］。因裸小鼠有免疫缺陷，因此感染病毒后不易產(chǎn)生抗體，用ELISA方法檢測裸鼠的病毒抗體易產(chǎn)生假陰性。在我們?nèi)粘z測工作中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠存在非特異性抗體增高的現(xiàn)象，即特異性抗原孔A值增高的同時(shí)，對(duì)照孔的A值也同時(shí)增高，說明用間接ELISA方法檢測費(fèi)轉(zhuǎn)基因小鼠病毒抗體的本底值較高，易產(chǎn)生假陽性。因此亟需建立一種高效、便捷、穩(wěn)定的直接檢測抗原的方法，以便應(yīng)用于所有類型小鼠的檢測。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（即LAMP法）是日本學(xué)者Notomi等［4］在2000年發(fā)明一種新型的核酸擴(kuò)增新技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4～6條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63℃左右）下作用30～60 min，即可完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。其擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。LAMP技術(shù)自開發(fā)以來已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒的定性定量檢測，臨床疾病的診斷，動(dòng)植物中致病微生物的檢測，胚胎性別鑒定等相關(guān)領(lǐng)域［5-8］，由于LAMP反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，其濁度與所含的DNA量成正比，根據(jù)這一特性，日本研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時(shí)監(jiān)控濁度儀，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時(shí)監(jiān)控［9］。本研究利用 LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀實(shí)時(shí)監(jiān)測RT-LAMP反應(yīng)進(jìn)程，篩選到最佳反應(yīng)體系，建立了針對(duì)SeV的RTLAMP檢測方法。所建立反應(yīng)體系具有良好的特異性，敏感快捷，其結(jié)果分析與肉眼可視化判定的一致性，具有推廣應(yīng)用的前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及待檢材料

BHK-21細(xì)胞、SeV病毒天津株、小鼠細(xì)小病毒（MVM）、鼠痘病毒（Ect）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼腸孤病毒3型（Reo-3）和小鼠肝炎病毒（MHV）種毒均購自中國藥品生物制品檢定所，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心增殖保存；現(xiàn)地試驗(yàn)樣品為上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站檢測的客戶送檢樣品，采樣在上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK（滬）2013-0056】。

1.1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清（Gibco）、QIAamp Viral RNA Mini Kit （Qiagen）；Loopamp RNA Amplification Kit、Loopamp?Fluorescence Detection Reagent、Loopamp?Reaction Tube Detection Reagent、LAMP real-time turbidimeter （LA-302）儀（日本榮研株式會(huì)社）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病毒核酸的提取

用QIAamp Viral RNA Kit試劑盒提取總RNA，QlAamp?DNA Mini Kit試劑盒提取總DNA，具體操作方法參照說明書。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照 GenBank中 SeV的全基因組序列（DQ219803.1），用BioEdit軟件進(jìn)行分析后選擇120nt-1694nt的 NP基因保守區(qū)，利用在線軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)六套引物（包括外引物F3/ B3和內(nèi)引物FIP和BIP），利用LAMP real time turbidimeter LA-302對(duì)不同引物對(duì)的反應(yīng)進(jìn)程和結(jié)果進(jìn)行監(jiān)測、篩選，并確定引物混合液的反應(yīng)比例。

1.2.3 SeVRT-LAMP檢測反應(yīng)體系的建立

根據(jù)Loopamp RNA Amplification Kit說明書，摸索SeVRT-LAMP的反應(yīng)體系中各組分的濃度及比例，將含有反應(yīng)液的反應(yīng)管至于LAMP real-time turbidimeter LA-302儀器中進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，根據(jù)該儀器預(yù)設(shè)的參考標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定反應(yīng)速度曲線峰值超過0.1時(shí)判為陽性。

1.2.4 SeV RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定

（1）SeV RT-LAMP產(chǎn)物的LAMP real-time turbidimeter LA-302儀鑒定：提取 SeV細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA，用已建立的 SeV RT-LAMP檢測，同時(shí)提取BHK-21正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照。利用LAMP realtime turbidimeter LA-302儀實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)情況，以圖文的形式顯示反應(yīng)過程中各反應(yīng)速率和時(shí)間。設(shè)定有效反應(yīng)時(shí)間為1 h，即在1 h內(nèi)當(dāng)LAMP real-time turbidimeter LA-302儀分析線形圖的線形峰值超過預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)0.1時(shí)，柱形圖底部顯示為紅色，即反應(yīng)判為陽性，其中藍(lán)色部分代表反應(yīng)產(chǎn)物的量，數(shù)值越高表示產(chǎn)物的量越大。

（2）SeV RT-LAMP產(chǎn)物的可視化鑒定：在反應(yīng)管中預(yù)先加入熒光目視檢測試劑（fluorescence detection reagent），待反應(yīng)結(jié)束后用肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化。陽性樣品的反應(yīng)液顏色呈綠色熒光，陰性無色透明。

1.2.5 SeV RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

取SeV、MHV、Ect、PVM、MVM和Reo-3等幾種小鼠常見病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，用1.2.1的方法提取各自核酸，采用所建立的SeV RT-LAMP方法的引物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 SeV RT-LAMP的敏感度試驗(yàn)

將提取的SeV RNA進(jìn)行10倍比稀釋為100～ 10-6的7個(gè)稀釋度，用所建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，監(jiān)測實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線。同時(shí)針對(duì)仙臺(tái)病毒保守基因NP蛋白序列設(shè)計(jì)PCR引物如下（產(chǎn)物長度為766 bp）：

F：5’-GGAGTAAACGCCGATGTCAAA-3’

R：5’-GCTGCATTGCCTTGTTCTGTA-3’

將倍比稀釋7個(gè)樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.7 SeV RT-LAMP的現(xiàn)地試驗(yàn)

對(duì)本站送檢的92份小鼠樣品采集全血，提取核酸用所建立的RT-LAMP方法、RT-PCR以及間接ELISA診斷試劑盒進(jìn)行檢測，比較三種方法的試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SeV RT-LAMP引物的篩選及反應(yīng)體系建立

用在線軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)6套引物，按照Loopamp RNA

Amplification Kit設(shè)定25 μL反應(yīng)體系：2×反應(yīng)緩沖液（RM）12.5 μL、FIP（40 pmol/L）1 μL、BIP （40 pmol/L）1 μL、F3（5 pmol/L）1 μL、B3（5 pmol/ L）1 μL、酶溶液（EM）1 μL、去離子水2.5 μL、SeVA RNA模板5 μL。LAMP real-time Turbidimeter LA-302儀63℃擴(kuò)增時(shí)間1 h。濁度儀實(shí)時(shí)跟蹤結(jié)果柱狀圖（見圖1）顯示Block A中的1、2和3號(hào)孔擴(kuò)增反應(yīng)明顯，4、5和6號(hào)孔有不同程度的擴(kuò)增，陰性對(duì)照無擴(kuò)增反應(yīng)。而濁度儀實(shí)時(shí)跟蹤結(jié)果曲線圖顯示僅1、2和3號(hào)孔在60 min內(nèi)出現(xiàn)了陽性峰值，且以1號(hào)孔擴(kuò)增效率最高，因此選定1號(hào)孔對(duì)應(yīng)引物為本方法的工作引物（表1）。

表1 SeV RT-LAMP引物序列Tab.1 Sequences of the primers used for RT-LAMP detection of SeV

2.2 SeV RT-LAMP的可視化鑒定比較

從儀器監(jiān)控的反應(yīng)進(jìn)程（見圖2）可見，SeV反應(yīng)體系在32 min左右啟動(dòng)，峰值超過0.1，陰性對(duì)照無反應(yīng)，結(jié)果與預(yù)期相符。反應(yīng)結(jié)束后用肉眼觀察，SeV的反應(yīng)顏色呈綠色熒光，陰性對(duì)照無色透明（見圖3），與real-time turbidimeter LA-302儀監(jiān)測結(jié)果一致，表明添加FD后所呈現(xiàn)的顏色反應(yīng)具有特異性。

2.3 SeV RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

以SeV為陽性對(duì)照，RNA洗脫液為陰性對(duì)照，檢測PVM、Reo-3、MHV、MVM和Ect等病毒，結(jié)果（見圖4）顯示只有SeV檢測結(jié)果為陽性，其余病毒均為陰性，表明所選引物對(duì)SeV具有強(qiáng)特異性。

注：1-6.引物；7.陰性對(duì)照。圖1 SeV RT-LAMP引物的Real Time Turbidimeter LA-302儀篩選結(jié)果Note：1-6.Primers；7.Negative control.Fig.1 Screening results of SeV RT-LAMP primers by real-time turbidimeter LA-302

注：1.SeV細(xì)胞培養(yǎng)物；2.陰性對(duì)照；3.BHK-21正常細(xì)胞對(duì)照。圖2 SeV RT-LAMP產(chǎn)物的real-timeLA-320 Turbidimeter儀鑒定分析Note.1.SeV strains；2.Negative control；2.BHK-21 cell lines.Fig.2 Analysis of the SeV RT-LAMP products identified by real-time tubidimeter

注：1.1.SeV細(xì)胞培養(yǎng)物；2.BHK-21正常細(xì)胞對(duì)照；3.陰性對(duì)照。圖3 RT-LAMP反應(yīng)體系加入目測熒光染料顯色Note.1.SeV strains；2.BHK-21 cell lines；3.Negative control.Fig.3 Visualization of the RT-LAMP reaction products by fluorescence detection reagent

2.4 SeV RT-LAMP的靈敏度試驗(yàn)

提取病毒滴度為0.21×105TCID50的SeV細(xì)胞培養(yǎng)物中總RNA，測定其濃度為86 ng/μL，進(jìn)行10倍比稀釋為100～10-6的7個(gè)稀釋度，用所建立的SeV RT-LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增，LAMP Real Time Turbidimeter（LA-302）的監(jiān)測曲線（見圖5）顯示，1號(hào)孔到3號(hào)孔都有顯著的擴(kuò)增，4號(hào)孔有一定程度的擴(kuò)增。在1 h時(shí)間內(nèi)，隨著模板濃度的降低，擴(kuò)增時(shí)間逐漸延后，但擴(kuò)增斜率基本保持不變，4號(hào)孔相對(duì)較為滯后，在68 min左右峰值超過0.1。結(jié)果顯示4號(hào)孔即8.6×10-3ng/μL為其最低檢出量。上述7份樣品的RT-PCR檢測結(jié)果（見圖6），當(dāng)RNA濃度稀釋至0.86 ng/μL時(shí)RT-PCR方法能檢出，經(jīng)測序證實(shí)檢出片段正確。由此可見RT-LAMP方法的敏感性明顯高于RT-PCR方法。

2.5 SeV RT-LAMP的現(xiàn)地試驗(yàn)

上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站送檢的92份小鼠樣品采集全血，提取核酸用所建立的RT-LAMP方法、RT-PCR進(jìn)行檢測，血清用間接ELISA診斷試劑盒進(jìn)行檢測，其中RT-LAMP和RT-PCR方法各檢出陽性4份，二者符合率100%；間接ELISA方法根據(jù)EBI試劑盒說明書判定標(biāo)準(zhǔn)檢出陽性4份，弱陽性1份（判為疑似），用中國生物藥品鑒定所小鼠仙臺(tái)病毒試劑盒重復(fù)檢測檢出陽性樣品為4份，與其余兩種方法符合率100%，經(jīng)過對(duì)樣品編號(hào)核實(shí)，EBI試劑盒檢出弱陽性樣品為轉(zhuǎn)基因小鼠，其弱陽性結(jié)果可能為非特異性本底增高。從反應(yīng)時(shí)間看，所建RT-LAMP方法全程反應(yīng)僅1 h，其效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其余兩種方法。

注：1.SeV；2.MHV；3.Ect；4.PVM；5.MVM；6.Reo-3；7.陰性對(duì)照。圖4 特異性試驗(yàn)SeV LAMP的Real Time TurbidimeterLA-302分析Note.1：SeV；2：MHV；3：Ect；4：PVM；5：MVM；6：Reo-3；7：Negative control.Fig.4 Specific test of SeV LAMP with a LA-320 real-time tubidimeter

注：1～7.100～10-6稀釋度的SeV；8.陰性對(duì)照。圖5 不同稀釋度的SeV RT-LAMP Real Time Turbidimeter（LA-302）分析Note.1-7：100-10-6serial dilutions of SeV；8：Negative control.Fig.5 Validation of SeV RT-LAMP assay by serial dilutions of virus with a turbidimeter（LA-320）

注：M.DL2000 marker；1～7.100-10-6稀釋度的SeV；8.陰性對(duì)照。圖6 不同稀釋度SeV的RT-PCR檢測Note.M.DL2000 marker；1-7.100-10-6serial dilutions of SeV；8.Negative control.Fig.6 RT-PCR detection of of SeV in different dilutions

3 討論

核酸檢測對(duì)于仙臺(tái)病毒早期檢測以及轉(zhuǎn)基因小鼠、免疫缺陷小鼠的檢測等有著重要的意義，本研究旨在通過建立一種新型的核酸檢測方法，從而讓仙臺(tái)病毒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域的檢測變得更為精準(zhǔn)便捷。LAMP方法相比較傳統(tǒng)PCR而言有著檢測更迅速、靈敏，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件（尤其是縣市基層）的快速檢測使用等優(yōu)點(diǎn)，因而有很大潛力。

由于LAMP反應(yīng)高效的特點(diǎn)，一般在較低的反應(yīng)速率下仍可產(chǎn)生大量的產(chǎn)物，而低反應(yīng)速率和LAMP反應(yīng)的原理矛盾，屬于假陽性反應(yīng)。目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法多采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，只能分析LAMP反應(yīng)的最終結(jié)果，且存在氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)室的危險(xiǎn)，由于缺乏對(duì)反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對(duì)檢測結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定［10］。而本研究在建立方法的過程中采用real-time Tubidimeter（LA-320）混濁儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。其原理是通過加熱使LAMP反應(yīng)進(jìn)行，同時(shí)在反應(yīng)管一側(cè)裝有650 nm的發(fā)光二極管（LED），控制入射光強(qiáng)度，在其相對(duì)一側(cè)裝有光電二極管（photodiode，PD），控檢測射光強(qiáng)度，由于LAMP反應(yīng)中生成副產(chǎn)物白色硫酸鎂沉淀，造成光強(qiáng)度差異。在計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)軟件上，通過調(diào)整反應(yīng)基線和每6 s檢測一次濁度，用自動(dòng)設(shè)定臨界值的方式由LAMP real-time turbidimeter（LA-302）儀給出的Ct值與RNA的拷貝數(shù)之間存在較好的線性關(guān)系.當(dāng)實(shí)時(shí)濁度判斷曲線超過閾值時(shí)即判斷為陽性，否則為陰性，因此，這種方式不但可以實(shí)時(shí)監(jiān)控，也可以進(jìn)行模板核酸的定量［9，11，12］。使用該儀器可以直觀、實(shí)時(shí)的觀察反應(yīng)的進(jìn)行情況，并通過設(shè)置分析標(biāo)準(zhǔn)可以排除假陽性和非特異反應(yīng)等干擾因素，同時(shí)也可避免LAMP產(chǎn)物開蓋電泳檢測對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的威脅。

與早期核酸檢測方法相比，RT-LAMP可通過一步法完成且反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，沒有核酸的變復(fù)性過程，既節(jié)省了時(shí)間又減少了RNA酶和擴(kuò)增核酸的污染機(jī)會(huì)［13］。更重要的是，擴(kuò)增反應(yīng)只有在六條引物完全與識(shí)別的靶序列中八個(gè)結(jié)合區(qū)匹配的情況下才能順利進(jìn)行，所有這些特性在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)背景，使檢測特異性得到改善［14］。

引物的設(shè)計(jì)及篩選是成功建立RT-LAMP方法的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)仙臺(tái)病毒N基因的保守序列設(shè)計(jì)了6組引物，擴(kuò)增結(jié)果顯示其中4組引物均可用于檢測，根據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)控曲線最終確定了啟動(dòng)時(shí)間最早峰值最高的1號(hào)引物組為最優(yōu)引物。敏感性與特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于仙臺(tái)病毒的檢測，RT-LAMP擴(kuò)增敏感性比RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)，且特異性良好，與常見的幾種小鼠病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)。LAMP擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)管中預(yù)先加入熒光目視檢測試劑，陽性樣品呈現(xiàn)肉眼可見的綠色熒光，可直接觀察無需瓊脂糖凝膠電泳從而進(jìn)一步防止氣溶膠的污染。

本實(shí)驗(yàn)用所建立的方法與間接ELISA方法及RT-PCR方法對(duì)上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站送檢的92份小鼠樣品同時(shí)檢測并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了比較。三種方法的陽性檢出率100%符合，但由于樣品數(shù)量（尤其是陽性樣品的數(shù)量）有限，并不能完全體現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)價(jià)值，在今后SeV的檢測工作中將繼續(xù)進(jìn)行 RTLAMP與其余檢測方法的比較研究。任何一種方法都具優(yōu)缺點(diǎn)，間接ELISA方法檢測血清中抗體，簡便快捷，可以滿足常規(guī)動(dòng)物檢測需要；而RT-LAMP和RT-PCR檢測抗原，因此對(duì)于發(fā)病早期尚未產(chǎn)生抗體的動(dòng)物、免疫缺陷不易產(chǎn)生抗體的動(dòng)物以及在檢測時(shí)易發(fā)生A本底值升高的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，采用抗原檢測方法更為準(zhǔn)確。LAMP法最大的弊端在于實(shí)驗(yàn)中對(duì)于污染控制要求極為嚴(yán)格，本研究所建立方法采用濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)控并用目測法判定結(jié)果，盡量降低了開蓋跑膠造成污染的可能性，該方法操作簡便、敏感性特異性好，便于推廣，進(jìn)一步優(yōu)化、完善后在仙臺(tái)病毒的檢測方面有一定應(yīng)用潛力。

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【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）03-0293-06

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.015

［基金項(xiàng)目］上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃（11140901000）；上海市科委研發(fā)平臺(tái)專項(xiàng)（15DZ2292400）。

［作者簡介］周潔（1978-），女，博士，副研究員，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)及免疫學(xué)方面的研究。Email：zhoujie0526@163.com。

［通訊作者］高誠（1961-），男，研究員。Email：gaochengdgb@126.com。陳洪巖（1963-），男，研究員。Email：chenhongyan@caas.cn。rect ELISA，and the coincidence rate was 100%.Conclusions This established SeV RT-LAMP detection method is fast，specific，highly sensitive，easy to perform under simple conditions，and is suitable for rapid detection of Sendai viirus.

Corresponding author：GAO Cheng，E-mail：gaochengdgb@126.com；CHEN Hong-yan，Email：chenhongyan@caas.cn

［收稿日期］2016-02-02

Establishment of a visualized detection method of Sendai virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

ZHOU Jie1，ZHAO Li-juan1，2，TAO Ling-yun1，NI Li-ju1，GAO Cheng1*，CHEN Hong-yan3*
（1.Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203，China；2.College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou 225009；3.Experimental Animal Center，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001）

【Abstract】Objective To establish a simple and sensitive detection method of Sendai virus（SeV）by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）technique.Methods According to the published Gen-Bank sequences（DQ219803.1），six pairs of primers were designed targeting the conserved region of SeV.The amplification products were detected with a LAMP real-time Turbidimeter.（LA-302）.Through optimizing the LAMP primers and reaction conditions，a rapid and specific detection method of SeV was established.Meanwhile，the amplified products were colored by fluorescence detection reagent after completion of the reaction，so that the amplification could be visualized and detected by naked eyes.Then，methodological evaluation of the RT-LAMP was tested.Results The method of RT-LAMP showed a highly efficient amplification for SeV viral target gene which was performed at 63℃ for 60 min with the LAMP real-time Turbidimeter（LA-302）.The detection limit was 2.1 TCID50，100 times higher than that of RT-PCR，and no crossreaction with other RNA and DNA viruses of mice was observed.The results of SeV LAMP reaction was visualized and the tube could be directly observed by naked eyes with the addition of fluorescence detection reagent.The results were consistent with the results detected by real-time tubidimeter.92 clinical samples were detected byRT-LAMP，RT-PCR and indi-

【Key words】Sendai Virus；RT-LAMP；Real time；Rapid detection