肝螺桿菌感染對BALB/c小鼠免疫應(yīng)答干擾的初步研究

馮潔，張泉1，謝建云2，魏曉鋒2，高誠2

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

?

肝螺桿菌感染對BALB/c小鼠免疫應(yīng)答干擾的初步研究

馮潔1，2，張泉1，謝建云2，魏曉鋒2，高誠2

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

【摘要】目的 探討肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus，H.hepaticus）感染對小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞（DC）表面分子形態(tài)和機(jī)體免疫應(yīng)答的干擾。方法 以H.hepaticus（ATCC 51450）灌飼SPF級BALB/c雄性小鼠，于末次接種后5個月體外分離培養(yǎng)骨髓DC，經(jīng)粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細(xì)胞介素-4（IL-4），刺激DC增殖、分化，流式細(xì)胞儀分析DC細(xì)胞表面分子CD11c、CD40、CD80、MHCII的表達(dá)率。此基礎(chǔ)上，用新城疫病毒（NDV）ZJ1株人工接種實驗組和對照組小鼠，每周測定NDV血清抗體效價，比較抗體產(chǎn)生的差異。結(jié)果 實驗組MHC II 和CD40分子的表達(dá)率高于對照組。NDV抗體水平第1周實驗組略低于對照組；第2～5周內(nèi)實驗組小鼠的抗體水平均高于對照組，差異有顯著性；第6周兩組小鼠血清抗體均呈下降趨勢，差異無顯著性。結(jié)論 H.hepaticus感染對小鼠骨髓DC成熟有促進(jìn)作用，能提高M(jìn)HC II和CD40表達(dá)水平，可促進(jìn)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗NDV的抗體水平。

【關(guān)鍵詞】肝螺桿菌；樹突狀細(xì)胞；新城疫病毒；抗體

肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus，H.hepaticus）屬于革蘭陰性菌，呈螺桿或彎曲狀，生長要求苛刻，最早發(fā)現(xiàn)于發(fā)生肝細(xì)胞癌和慢性活動性肝炎的A/J Cr小鼠肝臟（Fox等，1992）［1］。H.hepaticus可長期定殖于嚙齒類動物的肝臟和盲腸，引起慢性肝炎、肝癌、結(jié)腸炎和盲腸炎，病變的嚴(yán)重程度與動物的品系、年齡、性別等因素有關(guān)［2-4］，使用攜帶H.hepaticus的實驗動物進(jìn)行科學(xué)研究時，可能會干擾實驗結(jié)果。

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是重要的抗原提呈細(xì)胞（APC），成熟DC具有強(qiáng)大的抗原呈遞功能并刺激T細(xì)胞活化，介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答［5］。本研究通過對BALB/c小鼠人工感染H.hepaticus，分離骨髓源DC細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后以流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面分子的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，用新城疫病毒（NDV）ZJ1株接種小鼠，測定血清中NDV抗體效價水平，從而探討H.hepaticus感染對于小鼠骨髓源DC表面分子形態(tài)的影響以及對小鼠免疫功能的干擾。

1 材料與方法

1.1 菌株

H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC51450），購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于哥倫比亞選擇性血瓊脂培養(yǎng)基，立即置于放有微需氧產(chǎn)氣袋的密閉厭氧罐中，37℃培養(yǎng)至第7天，收集細(xì)菌。

1.2 病毒

滅活禽新城疫病毒（NDV）ZJ1株，由揚州大學(xué)畜禽傳染病教研室惠贈。

1.3 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠50只，4～6周齡，雄性，體重22～24 g，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供【SCXK（蘇）2012-0004】。所有動物均在揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心動物房進(jìn)行飼養(yǎng)【SYXK（蘇）2012-0029】。

1.4 儀器和試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、腦心浸液、脫纖維裂解馬血SR48、選擇性抗生素SR147和微需氧產(chǎn)氣袋（英國Oxoid公司），RPMI 1640（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），小鼠重組GM-CSF、IL-4（美國Peprotech公司），CD11c、CD40、CD80、MHCII單抗（美國eBiosciences公司），其他相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

Mini Spin離心機(jī)（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（江蘇蘇州凈化設(shè)備廠），細(xì)胞培養(yǎng)6孔板（美國Corning公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），流式細(xì)胞儀FACSAria（美國Becton-Dickinson公司）。

每個病理學(xué)知識點的發(fā)現(xiàn)到證實躍為理論，都伴隨著曲折有趣的科研歷程，折射出醫(yī)學(xué)前輩的科學(xué)智慧，融合教學(xué)法在病理實習(xí)課中，大膽實施以問題為中心，以學(xué)生為主人的教學(xué)方式，注重培養(yǎng)學(xué)生主支、獨立、探索、多渠道的獲取知識，這本身就激發(fā)學(xué)生對醫(yī)學(xué)知識無限的探索欲望，使學(xué)生科研增加，而融合教學(xué)法，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新的思維模式有肋于挑戰(zhàn)舊觀念，提出新問題，從而激發(fā)學(xué)生們的科研興趣[10]。

1.5 方法

1.5.1 模型建立

SPF級雄性BALB/c小鼠50只，經(jīng)H.hepaticus特異性16S rRNA基因擴(kuò)增證實無H.hepaticus感染。隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組各25只，分別飼養(yǎng)于隔離器。禁食12 h后，實驗組灌飼H.hepaticus菌液0.2 mL（1×108CFU/mL），對照組灌飼等量PBS，連續(xù)三次，每次間隔48 h。

1.5.2 小鼠骨髓DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)

實驗組小鼠感染H.hepaticus后第5個月，根據(jù)文獻(xiàn)［6-8］，每組各取8只小鼠脫頸處死，無菌取股骨和脛骨，用RPMI 1640培養(yǎng)基沖出骨髓細(xì)胞，400目濾網(wǎng)過濾兩次后收集細(xì)胞懸液，離心棄上清，加入0.8%Tris-NH4Cl破解紅細(xì)胞，離心、洗滌，以每孔2 ×106個細(xì)胞接種于6孔板，每孔加入終濃度為50 ng/mL小鼠重組IL-4和GM-CSF置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱誘導(dǎo)培養(yǎng)。48 h后半量換液，加入新的含20 ng/mL小鼠重組IL-4和50 ng/mL小鼠重組 GMCSF的10%FCS RPMI 1640，繼續(xù)培養(yǎng)，每培養(yǎng)48 h半量換液，至第10天棄懸浮細(xì)胞，收集半貼壁的樹突狀細(xì)胞（所有溶液均用無熱原水配置）。對照組作同等處理。

1.5.3 DC表面分子的流式細(xì)胞術(shù)分析

收集的細(xì)胞1000 r/min離心8 min棄上清，PBS洗一遍后將細(xì)胞懸浮于100 μL PBS中，兩組細(xì)胞分別加入大鼠抗小鼠CD11c、CD40、CD80和MHCII類分子熒光標(biāo)記抗體，置4℃避光標(biāo)記30 min，1000 r/min離心8 min，棄上清，再用PBS洗兩次將細(xì)胞懸浮于100 μL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)率。

1.5.4 小鼠人工接種

感染H.hepaticus后第5個月每組選取15只小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只注射0.2 mL滅活NDV。分別于接種NDV后第1、2、3、4、5、6周經(jīng)頜下靜脈叢采血分離血清，以血凝抑制法（HI）檢測血清中抗NDV的抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)

培養(yǎng)基中加入小鼠重組GM-CSF、IL-4，光學(xué)顯微鏡下觀察，培養(yǎng)24 h內(nèi)樹突狀細(xì)胞懸浮生長，24 h后可見許多小而圓的半貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)2～3 d后培養(yǎng)孔底部觀察到細(xì)胞集落，且細(xì)胞集落隨著培養(yǎng)時間的延長變多。培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞呈懸浮生長且集落增多，高倍鏡下可見細(xì)胞集落增多，細(xì)胞周圍呈樹突狀突起（圖1）。

2.2 DC表面分子表達(dá)分析

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)率如圖2所示，實驗組和對照組CD11c表面分子的表達(dá)率分別為：87.8%、85.6%；CD40表面分子實驗組和對照組表達(dá)率分別為57.6%、38.8%；CD80表面分子實驗組和對照組表達(dá)率分別為89.8%、88.7%；MHCII表面分子實驗組和對照組表達(dá)率分別為3.6%、0.2%?？梢姼温輻U菌感染能夠促進(jìn)DC表面分子CD40和MHCII類分子表達(dá)。

2.3 BALB/c小鼠接種NDV后的抗體水平檢測

由表1和圖3可知，實驗組接種NDV后第1到第5周內(nèi)血清抗體效價均逐漸升高，第6周時呈下降趨勢；對照組接種NDV后第1、2周血清抗體水平持平，未出現(xiàn)上升，2到5周逐漸上升，第6周呈下降趨勢。除第1周實驗組小鼠抗體水平略低于對照組外，2至6周內(nèi)實驗組抗體水平均高于對照組?？梢姼温輻U菌感染能夠提高BALB/c小鼠對NDV的抗體水平。

注：A.分離培養(yǎng)3 d（×200）；B.分離培養(yǎng)5 d（×400）。圖1 樹突狀細(xì)胞形態(tài)Note.A.3 days after isolation（×200）；B.5 days after isolation（×400）.Fig.1 Morphological observation of the murine dendritic cells

表1 接種NDV后不同時間內(nèi)小鼠的血清抗體效價（n=15）Tab.1 Serum antibody titer of the mice after inoculation with NDV at different times

3 討論

嚙齒動物螺桿菌在全球范圍內(nèi)普遍流行，已被公認(rèn)為是嚙齒類實驗動物重要的致病菌，發(fā)達(dá)國家或國際知名實驗動物供應(yīng)商已將其納入實驗大小鼠病原體監(jiān)測列表，而H.hepaticus尚未列入我國實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)實驗室使用嚙齒動物進(jìn)行實驗時通常不對該菌進(jìn)行檢測，使得感染難以被發(fā)現(xiàn)。對于機(jī)體免疫正常的小鼠H.hepaticus多為隱性感染，通常無明顯的病理變化，H.hepaticus可引起機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，引起迅速而有力的I型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IgG和IgM抗體，伴隨抗H.hepaticus抗體產(chǎn)生、膽酸濃度改變、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平升高，并引起多種細(xì)胞因子濃度升高［9］。使用攜帶H.hepaticus的實驗動物進(jìn)行藥理學(xué)、免疫學(xué)等科學(xué)研究時，可能會對實驗產(chǎn)生干擾，從而混淆實驗結(jié)果。

DC是一種專職抗原提呈細(xì)胞，能夠激活T、B細(xì)胞（特別是T細(xì)胞）的特異性免疫反應(yīng)及免疫耐受。DC的分化發(fā)育主要經(jīng)歷四個階段：造血干細(xì)胞→DC前體細(xì)胞→未成熟的DC細(xì)胞→成熟的DC細(xì)胞［5］。在外來抗原的刺激下，成熟 DC表面的MHCII分子與T細(xì)胞受體結(jié)合，傳導(dǎo)抗原特異性刺激信號，同時，共刺激分子刺激T細(xì)胞活化，在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起著重要的作用［10］。我們從感染H.hepaticus 5個月的BALB/c小鼠和未感染H.hepaticu的對照組小鼠骨髓中分出DC細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，可在10 d左右擴(kuò)增出大量DC細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)對兩組細(xì)胞DC表面的共刺激分子（CD11c、CD40、CD80和MHCII）的表面分子的表達(dá)率進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，MHCII和CD40分子在實驗組的表達(dá)率要高于對照組的表達(dá)率。由此推測，H. hepaticus感染可能會對小鼠骨髓中DC的成熟起促進(jìn)作用，且能提高M(jìn)HC II和CD40分子的表達(dá)水平，提示或許對抗體的產(chǎn)生水平有一定的促進(jìn)作用。

圖2 實驗組與對照組小鼠DC表面分子表達(dá)率Fig.2 Expression rate of DC cell surface molecules in the experimental and control groups of mice

有研究表明［11］，用單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）分別接種感染H.hepaticus 1個月和未感染H.hepaticus的C57BL/6小鼠，1周后感染H.hepaticus小鼠的DC表面分子CD40、CD80、CD86和MHCII分子水平較對照組顯著降低，說明H.hepaticus感染抑制了DC表型成熟，這與本文結(jié)果有一定的差異。我們分析可能的原因在于本文僅單純性研究感染H. hepaticus對BALB/c小鼠骨髓來源DC表面分子表達(dá)率的影響，而文獻(xiàn)報道的結(jié)果則可能是H.hepaticus和HSV-1共同作用導(dǎo)致。另外也可能與動物品系、DC細(xì)胞來源及感染的時間等因素有關(guān)，還有待進(jìn)一步深入研究。此外，本實驗還用NDV ZJ1株分別接種已感染H.hepaticus和未感染H.hepaticus的BALB/c小鼠，結(jié)果顯示，在不同時間段，H.hepaticus感染可以促進(jìn)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗NDV的抗體水平，這可能與H. hepaticus感染可刺激DC細(xì)胞表面CD40和MHC II類分子表達(dá)水平有一定的關(guān)系。綜上所述，H.hepaticus感染會對免疫學(xué)實驗產(chǎn)生干擾而影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此在進(jìn)行動物實驗尤其是免疫學(xué)相關(guān)實驗時，應(yīng)盡量選擇不攜帶H.hepaticus的動物，以排除其對實驗的干擾。

圖3 接種NDV抗原后不同時間小鼠的血清抗體水平的比較Fig.3 Comparison of antibody titer of the mice after inoculation with NDV antigenat at different times

參考文獻(xiàn)

［1］ Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG，et al.Helicobacter hepaticus sp.nov.，a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice［J］.Clin Microbiol，1994，32：1238-1245.

［2］ Ward JM，F(xiàn)ox JG，Anver MR，et al.Chronic active hepatitis and associated liver tumors in mice caused by a persistent bacterial infection with a novel Helicobacter species［J］.J Natl Cancer Inst. 1994，86（16）：1222-1227.

［3］ Cahill RJ，F(xiàn)oltz CJ，F(xiàn)ox JG，et al.Inflammatory bowel disease：an immunity-mediated condition triggered by bacterial infection with Helicobacter hepaticus［J］.Infect Immun.1997，65：3126 -3131.

［4］ Hailey JR，Haseman JK，Bucher JR，et al.Impact of Helicobacter hepaticus infection in B6C3F1 mice from 12 National Toxicology Program 2-year carcinogenesis studies［J］.Toxicol Pathol. 1998，26：602-611.

［5］ Jonuleit H，Schmitt E，Schuler G，et al.Induction of interleukin 10-producing，nonproliferating CD4（+）T cell with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells［J］.J Exp Med，2000，192（9）：1213-1222.

［6］ Inba K，Inaba M，Romanin N，et al.Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone-marrow culture supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor ［J］.J Exp Med，1992，176：1693-1702.

［7］ Cao X，Zhang W，He L，et al.Lymphotactin gene-modified bone marrow dendritic cells act as more potent adjuvants for peptide delivery to induce specific antitumor immunity［J］.J Immunol，1998，161：6238-6244.

［8］ Lutz MB，Kukutsch N，Ogilvie AL，et al.An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow［J］.Immunol Methods，1999，223（1）：77-92.

［9］ Chahlavi A，Rabkin S，Todo T，et al.Effect of prior exposure to herpes simplex virus 1 on viral vector mediated tumor therapy in immunocompetent mice［J］.Gene Ther，1999，6：1751-1758.

［10］ Smaroula D，Julius MC，Robert L.Function of CD80 and CD86 on monocyte and stem cell derived dendritic cells［J］.Exp Mol Pathol，2003，75：217.

［11］ Gulani J，Norbury CC，Bonneau RH，et al.The effect of Helicobecter hepaticus infection on immune responses specific to herpes simplex virus type 1 and characteristics of dendritic cells［J］. Comp Med.2009，59（6）：534-544.

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0304-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.017

Corresponding author：GAO Cheng，E-mail：gaochengdgb@126.com

［基金項目］上海市科技創(chuàng)新行動計劃（14140900600，11140901000）；上海市科委研發(fā)平臺專項（15DZ2292400）。

［作者簡介］馮潔（1981-），女，副研究員，E-mail：moyifj@163.com

［通訊作者］高誠，研究員，E-mail：gaochengdgb@126.com

［收稿日期］2016-02-22

Preliminary observation on the interference effect of Helicobacter hepaticus infection on the immune response in BALB/c mice

FENG Jie1，2，ZHANG Quan1，XIE Jian-yun2，WEI Xiao-feng2，GAO Cheng2
（1.School of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2.Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203）

【Abstract】Objective To determine the interference effect of H.hepaticus infection on the functional characteristics of dendritic cell（DC）surface molecules and immune response in mice.Methods Male BALB/c mice were inoculated with H.hepaticus（ATCC 51450）.Murine bone marrow-derived dendritic cells（DC）were isolated and co-cultured which were stimulated by GM-CSF and IL-4 at the fifth month after the last inoculation.Then the DCs were subjected to FACS analysis for surface markers（CD11c，CD40，CD80 and MHCII）detection.On this basis，virus suspension of Newcastle disease virus（NDV）ZJ1 strain was inoculated into the mice.Serum was collected for detection of the NDV antibody titer in serum weekly to explore the difference of antibody titer between the two groups.Results The expression rates of CD40 and MHCII on the mouse DCs in experimental group were higher than that in the control group.The NDV antibody titer of experimental group was slightly lower than that in the control group in the first week.During the 2nd to 5th weeks，the titer was higher than that in the control group，with a very significant difference.In the 6th week，the titer of both the two groups tended to fall.Conclusions H.hepaticus infection can promote bone marrow DC maturation in mice，stimulate the expression rates of MHC II and CD40，and enhance the NDV antibody levels.

【Key words】Helicobacter hepaticus；Dendritic cells；Newcastle disease virus，NDV；Antibody；Immune response；Mice