無特定病原體金定鴨微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

趙麗麗，陸濤峰，張曉萍，牛銀杰，陳洪巖*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

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無特定病原體金定鴨微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

趙麗麗#，陸濤峰#，張曉萍，牛銀杰，陳洪巖*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

【摘要】目的 利用微衛(wèi)星標(biāo)記對無特定病原體金定鴨群進(jìn)行遺傳多樣性分析。方法 采用微衛(wèi)星標(biāo)記，對SPF金定鴨種群中71個個體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果 SPF金定鴨種群中17個位點(diǎn)上共檢測到119個等位基因，每個微衛(wèi)星上等位基因數(shù)介于3～13；該SPF金定鴨群體中有13個位點(diǎn)（PIC＞0.5）呈現(xiàn)出高度多態(tài)，平均雜合度為（0.5816±0.0142），其他位點(diǎn)均呈現(xiàn)出中度多態(tài)。僅有5個位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其余12個位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。結(jié)論 該SPF金定鴨群體內(nèi)均存在豐富的遺傳多樣性，滿足建立封閉群的遺傳特征，可以利用該群體繼續(xù)開展無特定病原體金定鴨封閉群的建立。

【關(guān)鍵詞】SPF金定鴨；遺傳多樣性；微衛(wèi)星標(biāo)記

金定鴨是我國著名的蛋鴨地方品種，因其產(chǎn)蛋量高、體型小、飼料利用率高、雜交利用效果明顯、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而馳名中外［1-2］。哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心從國家水禽種質(zhì)資源基因庫江蘇省豐達(dá)水禽育種場引進(jìn)祖代金定鴨種卵，從孵化開始在屏障環(huán)境下進(jìn)行病原微生物的凈化。自1日齡起直至淘汰，全部生命周期都飼養(yǎng)于隔離器中，已經(jīng)排除了高致病性禽流感病毒、雞新城疫病毒、禽腺病毒Ⅲ群、番鴨細(xì)小病毒、禽減蛋綜合征、鵝細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、I型鴨肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨坦布蘇病毒等十種病原體，初步培育出無特定病原體金定鴨F0代核心群。為了了解該群的遺傳多樣性狀況，以便采取更有效的保種措施及更好地開發(fā)利用，本研究采用微衛(wèi)星DNA技術(shù)，選用17個極其高度多態(tài)且

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本試驗(yàn)共采集了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心保存的無特定病原體金定鴨71只，61周齡【SCXK（黑）2011-007】，翅靜脈采血。所有動物經(jīng)過高致病性禽流感病毒、雞新城疫病毒、禽淋巴白血病病毒、番鴨細(xì)小病毒、禽減蛋綜合征、鵝細(xì)小病毒、鴨瘟病毒、I型鴨肝炎病毒、鴨圓環(huán)病毒和鴨坦布蘇病毒等十種病原體檢測，均呈陰性，微生物檢測內(nèi)容在本文中沒有涉及。

1.1.2 PCR相關(guān)試劑

TaqDNA聚合酶、dNTPs及100 bp DNA ladder均購自大連寶生物有限公司。

1.1.3 微衛(wèi)星引物

參照文獻(xiàn)報道，選擇了17對微衛(wèi)星標(biāo)記用于鴨的遺傳多樣性分析［3，5，8］。為了實(shí)現(xiàn)微衛(wèi)星多態(tài)性的熒光半自動檢測，對引物進(jìn)行了熒光修飾，本研究選擇了適用于ABI3130XL下光柵CCD熒光檢測系統(tǒng)的三種熒光集團(tuán)，即 FAM（藍(lán)色）、HEX（綠色）、和LIZ（橙色），其中LIZ為分子量內(nèi)標(biāo)。所用引物和組合見表1。

表1 17個鴨微衛(wèi)星位點(diǎn)的相關(guān)信息Tab.1 The information of 17 microsatellite loci in the ducks

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取采用常規(guī)的酚氯仿抽提法

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR總反應(yīng)體積為25 μL，其中10×PCR buffer、dNTP、Taq酶按照不同試劑盒的推薦量加入，上下游引物（100 pmol/μL）各1 μL，基因組DNA：1 μL，用純水（ddH2O）補(bǔ)足體系到25 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，3 min；94℃變性，40 s；退火溫度（各位點(diǎn)退火溫度參見表 B），40 s；72℃延伸，40 s；30個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測

PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的STR掃描

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測確保擴(kuò)增出目的片斷后，選擇分別以FAM、HEX、TAMRA標(biāo)記的三個位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，以1∶1.5∶1.5體積比混合，取1 μL上樣進(jìn)行STR掃描。熒光引物合成和STR掃描均由金唯智公司完成。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

本研究中采用Excel Microsatellite Toolkit（version 3.1）軟件計算群體內(nèi)各位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）和多態(tài)信息含量（PIC）、群體的期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）；利用GENEPOP version 3.4軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因及基因頻率

該金定鴨群體在17個微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因及等位基因頻率情況如表2所示。結(jié)果表明，金定鴨群體在17個位點(diǎn)上共檢測到119個等位基因，所有位點(diǎn)中等位基因數(shù)最多的為13個，最少的為3個。大部分位點(diǎn)上檢測到的等位基因數(shù)都接近于文獻(xiàn)報道［5，10］。每個位點(diǎn)上存在一個或極少數(shù)優(yōu)勢等位基因，這些優(yōu)勢等位基因可能是品種間或種內(nèi)較為保守的等位基因，同時在部分位點(diǎn)也存在一些低頻率的等位基因，依據(jù)文獻(xiàn)報道［3，5，8］我們選取的微衛(wèi)星全部為二核苷酸重復(fù)序列，但在許多位點(diǎn)上檢測到了單堿基的差異，說明在這些位點(diǎn)的側(cè)翼序列中可能存在著一定程度的單核苷酸多態(tài)性。

2.2 雜合度、多態(tài)信息含量及有效等位基因數(shù)

17個微衛(wèi)星位點(diǎn)在金定鴨群體中的多態(tài)信息含量（PIC）、群體的期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）見表3。結(jié)果表明，該金定鴨群體中有13個位點(diǎn)（PIC＞0.5）呈現(xiàn)出高度多態(tài)，平均雜合度為（0.5816±0.0142），其他位點(diǎn)均呈現(xiàn)出中度多態(tài)。上述信息均表明群體內(nèi)遺傳多樣性較高，各位點(diǎn)多態(tài)性較好，遺傳多樣性水平基本相當(dāng)。依據(jù)Botstein等首先提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量（PIC）指標(biāo)，表明所選位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，適于鴨的遺傳學(xué)分析。

2.3 Hardy-Weinberg平衡

使用GENEPOP軟件對金定鴨群體中17個微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，僅有5個位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其余12個位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明該群體在培育過程中受到明顯的選擇效應(yīng)，與該群體的遺傳背景相符合。

綜上所述，該SPF金定鴨群體在所選的17個微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，表明這些位點(diǎn)能用于封閉群金定鴨遺傳質(zhì)量評價。同時，該群體在一些位點(diǎn)上表現(xiàn)出偏離哈代-溫伯格平衡的現(xiàn)象，表明該群體在培育過程中受到了人工選擇的壓力，這也與該群體的遺傳背景相一致。因此，該群體經(jīng)過基于微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳質(zhì)量檢測，表明該群體符合封閉群的遺傳特征，可以利用該群體繼續(xù)開展無特定病原體金定鴨封閉群的建立。

3 討論

微衛(wèi)星DNA（microsatellite）是上世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種新型遺傳標(biāo)記。由于其具有在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、易于檢測、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，因此在評價遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、疾病診斷和親子鑒定方面顯示出巨大優(yōu)勢，并在動植物的遺傳研究中得到了廣泛應(yīng)用［7，8］，同時也被作為一種重要、成熟的遺傳學(xué)檢測工具廣泛應(yīng)用于各類實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量檢測研究中［9，10］。目前，微衛(wèi)星DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分型方法有瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺電泳和毛細(xì)管電泳等。毛細(xì)管電泳技術(shù)是將熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分子量樣品（內(nèi)參）在同一毛細(xì)管中進(jìn)行電泳，DNA分析儀將結(jié)果自動記錄在計算機(jī)上，利用片段分析軟件進(jìn)行圖像收集和分析，精確計算出微衛(wèi)星等位基因片段的大小。毛細(xì)管電泳檢測PCR產(chǎn)物具有微量、高度自動化、結(jié)果更加準(zhǔn)確等明顯優(yōu)勢，是微衛(wèi)星檢測的發(fā)展方向。

表2 17個鴨微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)及等位基因頻率Tab.2 Allele size and corresponding frequencies at 17 microsatellite loci in the ducks

本研究利用毛細(xì)管電泳技術(shù)，建立了SPF金定鴨群體遺傳質(zhì)量研究的方法，該方法包含了17個鴨微衛(wèi)星位點(diǎn)。通過對SPF金定鴨種群中71個個體的遺傳多樣性分析，共檢測到119個等位基因，每個微衛(wèi)星座位上等位基因數(shù)介于3～13個之間，大部分位點(diǎn)上檢測到的等位基因數(shù)都接近于文獻(xiàn)報道［2，11，12］。該SPF金定鴨群體中有13個位點(diǎn)（PIC ＞0.5）呈現(xiàn)出高度多態(tài)，平均雜合度為（0.5816±0.0142），其他位點(diǎn)均呈現(xiàn)出中度多態(tài)，僅有5個位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其余12個位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。結(jié)果表明，該SPF金定鴨群體在所選的17個微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，說明這些位點(diǎn)能用于封閉群金定鴨遺傳質(zhì)量評價。同時，該群體在一些位點(diǎn)上表現(xiàn)出偏離哈代-溫伯格平衡的現(xiàn)象，表明該群體在培育過程中受到了人工選擇的壓力，這也與該群體的遺傳背景相一致。

表3 17個鴨微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異參數(shù)Tab.3 Genetic variations at 17 microsatellite loci in the ducks

表4 17個鴨微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)Tab.4 Hardy-Weinberg equilibrium test of 17 microsatellites in the ducks

綜上所述，本研究對利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對培育的無特定病原體金定鴨種群的遺傳多樣性進(jìn)行了遺傳質(zhì)量檢測，表明該群體符合封閉群的遺傳特征，可以利用該群體繼續(xù)開展無特定病原體金定鴨封閉群的建立。從而可以為后期實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體金定鴨的培育的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化和種子庫的建立提供重要的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）03-0299-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.03.016

Corresponding author：CHEN Hong-yan，E-mail：chenhongyan@caas.cn.

［基金項(xiàng)目］中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2016350）。

［作者簡介］趙麗麗（1983-），女，博士，助理研究員。研究方向：獸醫(yī)微生物和免疫學(xué)。E-mail：zhaolili213@163.com；陸濤峰（1982-），男，博士，助理研究員。研究方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail：taofenglu@126.com。#為共同第一作者。

［通訊作者］陳洪巖（1963-），男，研究員。研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail：chenhongyan@caas.cn.分布在不同連鎖群上的微衛(wèi)星標(biāo)記，結(jié)合PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)，從分子水平對該群無特定病原體金定鴨的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，以期獲得該群體的遺傳學(xué)參數(shù)，為SPF金定鴨封閉群的培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

［收稿日期］2016-02-23

Analysis of the DNA genetic diversity in SPF Jinding duck population

ZHAO Li-li，LU Tao-feng，ZHANG Xiao-ping，NIU Yin-jie，CHEN Hong-yan*
（State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Harbin 150001，China）

【Abstract】Objective To analyze the DNA genetic diversity in SPF Jinding duck population using microsatellite markers.Methods The DNA genetic diversity in 71 SPF Jinding ducks were analyzed by microsatellite markers.Results A total of 152 alleles were detected at 17 microsatellite loci，and the numbers of alleles at each locus varied from 3 to 13. Thirteen microsatellite loci showed a high level of average PIC values（PIC＞0.5），the hererozygosity（H）was 0.5816± 0.0142.Other loci showed a middle level of the average PIC values.Only 5 microsatellite loci were in Hardy-Weinberg equilibrium，although 12 microsatellite loci were not in（P＜0.01）.Conclusions The results revealed that the genetic variabilities in the SPF Jinding duck population are rich，and this population meets to the genetic characteristics of the closed colony animals，so it can be used to establish the closed colony of SPF Jinding duck.

【Key words】Jinding duck population；Genetic diversity；Microsatellite DNA