DNA條形碼技術(shù)檢測(cè)調(diào)理肉制品摻雜

陳健++岳巧云++邱德義

摘 要：市場(chǎng)上出售的調(diào)理肉制品種類繁多，質(zhì)量良莠不齊，產(chǎn)品與標(biāo)簽不符，摻假、以次充好等商業(yè)欺詐問(wèn)題影響著人們的利益與健康。肉類食品摻假造假問(wèn)題越來(lái)越受重視，但是由于來(lái)源肉類的形態(tài)特征已經(jīng)被嚴(yán)重破壞或者肉味精等添加劑的使用，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無(wú)法快速、準(zhǔn)確、便捷地完成此類產(chǎn)品成分的檢測(cè)。本研究利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)3 個(gè)不同來(lái)源（超市、市場(chǎng)、火鍋店）的36 份調(diào)理肉制品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：有27 份樣品（75%）含有雞源性成分，超市購(gòu)買的調(diào)理肉制品中有2 份（10.5%）檢出配料表未標(biāo)出的肉類成分。本研究證明DNA條形碼技術(shù)可作為調(diào)理肉制品的成分檢測(cè)及溯源的高效檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：調(diào)理肉制品；食品摻假；DNA條形碼；快速檢測(cè)；成分鑒定

速食時(shí)代，越來(lái)越多的美味被“速凍”，且因其豐富多樣的口味、快速便捷的烹飪方法而被現(xiàn)代人青睞[1]。目前市場(chǎng)上的調(diào)理肉制品超過(guò)幾百種，加工品種主要包括：魚糜制品，如丸類和膏類；裹面制品，如裹面肉類、禽塊等；乳化肉制品，如括丸類、脆脆腸等；燒烤煙熏制品，如烤熏肉、熏腸類產(chǎn)品[2]。一些不法商販?zhǔn)艿嚼娴尿?qū)使，用淀粉、食品添加劑，少量甚至完全不添加主料的假冒商品來(lái)欺騙消費(fèi)者。這類假冒偽劣產(chǎn)品不僅口感不佳，更有可能給廣大消費(fèi)者埋下健康隱患[3]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于其成分的研究甚少，僅曲勤鳳等[4]利用測(cè)定15 批次魚糜制品（魚丸），發(fā)現(xiàn)其中11 種魚糜制品含量均<10%。但尚無(wú)對(duì)其他肉丸成分的研究報(bào)道。

對(duì)調(diào)理肉制品成分進(jìn)行溯源不僅可以維護(hù)正常的經(jīng)營(yíng)秩序，保護(hù)消費(fèi)者和生產(chǎn)者的安全并免受欺詐，同時(shí)也能保護(hù)一些動(dòng)物物種免受過(guò)度或非法捕獵[5]。但是傳統(tǒng)上食品來(lái)源物種主要依靠生物的表型及解剖特征等進(jìn)行鑒定。這類食品的物種的原始特征消失，這使得物種鑒別變得相對(duì)困難[6]。近年來(lái)動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展，對(duì)于調(diào)理肉制品成分的鑒定，主要是從蛋白質(zhì)與核酸水平進(jìn)行。在蛋白質(zhì)水平，常用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、液相色譜、高效液相色譜等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這些方法共同的局限性在于對(duì)儀器、試劑和樣品處理要求高，且檢測(cè)加工樣品時(shí)特異性和準(zhǔn)確性較差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7-10]。從DNA水平進(jìn)行的檢測(cè)方法包括DNA探針雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等[3-6]，但是也存在不足之處，需針對(duì)每種物種設(shè)計(jì)不同引物，且通用性差。

DNA條形碼技術(shù)作為一種新興的物種鑒定技術(shù)，與其他技術(shù)相比較，有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[5]。它是一種靈敏、快速、廉價(jià)和可靠的方法，可識(shí)別和跟蹤大量的原料和加工的食品類商品（即使是深度加工的食品），以及檢測(cè)食品中的過(guò)敏原或有毒成分[6，11-12]。目前，DNA條形碼技術(shù)在漁類產(chǎn)品、禽畜肉類、可食用植物、加工食品鑒定中均有廣泛地應(yīng)用[13-14]。它是一種應(yīng)用生物本身所具有的、有足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段（細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ，（cytochrome oxidase Ⅰ，CO Ⅰ）對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的生物身份識(shí)別技術(shù)[15-17]。目前該技術(shù)在生物學(xué)各相關(guān)領(lǐng)域中也得到廣泛應(yīng)用[18-23]。本研究嘗試通過(guò)DNA條形碼技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的調(diào)理肉制品的成分進(jìn)行分析鑒定、溯源調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從本地某菜市場(chǎng)、超市、火鍋店分別采集調(diào)理肉制品樣本36 份。

DNA提取試劑盒（目錄號(hào)DP304）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（目錄號(hào)DP210）、克隆試劑盒（目錄號(hào)VT202-02）、重組菌落鑒定試劑盒（目錄號(hào)VI102）、dNTP、Loading buffer、DNA Marker II、SYBR Green I等PCR試劑 天根生化科技（北京）有限公司；Ex-Taq DNA聚合酶 廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoPico 17微量臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；DYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀 北京科學(xué)深藍(lán)科技有限公司；Veriti 96 ABIApplied Biosystems梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；MD-02N-220 Major Science金屬浴 美國(guó)Major Science公司；Alliance 4.7 UVITEC凝膠成像儀 英國(guó)Uvitec公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

剪切、稱取待測(cè)樣品25 g，用去離子水將其表面洗凈晾干后，用研磨棒將其研磨至粉末。取一小部分（約30 mg）置于1.5 mL離心管中，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)提取基因組DNA。

1.3.2 DNA的擴(kuò)增[24]

1.3.2.1 引物

PCR擴(kuò)增所用引物為：

LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3；

HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。

1.3.2.2 擴(kuò)增條件與反應(yīng)體系

參考廖俊蕾等[25]的方法。

Ex-Taq DNA聚合酶擴(kuò)增條件：94 ℃變性5 min；94 ℃、30 s；50 ℃、30 s；72 ℃、1 min；30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10 倍PCR緩沖液5 μL；正向引物（20 nmol/μL）2 μL；反向引物（20 nmol/μL）2 μL；dNTP（10 μmol/μL）2 μL；Ex-Taq（5 U/μL）1 μL；模板DNA（50 ng/μL）3 μL；無(wú)菌水定容到50 μL。

1.3.3 DNA純化

采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.3.4 克隆

采用pGM-T連接試劑盒，按照試劑盒使用手冊(cè)對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定克隆陽(yáng)性。

1.3.5 測(cè)序和分析

每個(gè)樣品隨機(jī)挑選12 個(gè)陽(yáng)性菌株送交上海立菲生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯校對(duì)無(wú)誤后，在GenBank和BOLD中進(jìn)行比對(duì)和相似度分析，并記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA條形碼數(shù)據(jù)的獲得及分析

3 個(gè)不同來(lái)源（超市、市場(chǎng)、火鍋店）的36 份調(diào)理肉制品的DNA條形碼（CO Ⅰ基因片段）片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1～3所示。

N. 陰性對(duì)照；B. 空白對(duì)照；1～12. 檢測(cè)樣品；M. MarkerⅡ。

N. 陰性對(duì)照；B. 空白對(duì)照；1～19. 檢測(cè)樣品；M. MarkerⅡ 。

N. 陰性對(duì)照；B. 空白對(duì)照；1～5. 檢測(cè)樣品；M. MarkerⅡ。

由表1～3可知，所有樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物均檢測(cè)到1 條約658 bp的擴(kuò)增片段，未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化回收后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

B. 空白對(duì)照；1～12. 單克隆菌落；M. MarkerⅡ。

由圖4可知，挑選的12 個(gè)白色菌落均擴(kuò)增出目的條帶，證明目的條帶準(zhǔn)確轉(zhuǎn)化入大腸桿菌內(nèi)，挑選這12 個(gè)陽(yáng)性菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后送測(cè)序。

以品牌B的墨魚丸的CO Ⅰ基因擴(kuò)增序列為例，DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)Mega 6.0軟件驗(yàn)證圖譜為有效序列，去掉兩端的引物得到全長(zhǎng)有效序列為658 bp。序列在GenBank和BOLD中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，克隆后測(cè)出的序列與GenBank中公布的原雞（登錄號(hào)：gb|KF954727.1|）全線粒體序列中的細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ相似性為99.85%，僅有一對(duì)堿基差異。

由圖6可知，在BOLD中比對(duì)的結(jié)果為100%的原雞，從而可確定這段DNA條形碼序列為原雞的序列。

2.2 某菜市場(chǎng)購(gòu)買的調(diào)理肉制品成分鑒定

由表1可知，在某菜市場(chǎng)購(gòu)買的12 種調(diào)理肉制品中共檢測(cè)出6 種不同的成分，其中9 種（除魚丸、魚腸、墨魚丸外）的成分僅為原雞（Gallus gallus），并未檢測(cè)出該名稱食品相符的肉類成分。如：牛肉丸僅含有原雞（Gallus gallus），但沒(méi)有檢測(cè)到牛源性成分。另外3 種魚肉類調(diào)理肉制品——魚腸、墨魚丸、魚丸的成分較為正常，除有雞源性成分外還含有魚肉成分。但是菜市場(chǎng)均為散裝售賣方式，無(wú)法查其配料成分，從而無(wú)法確認(rèn)鑒定結(jié)果與配料是否有出入。

2.3 某超市購(gòu)買的調(diào)理肉制品成分鑒定

由表2可知，在某超市購(gòu)買的19 種8 個(gè)品牌的調(diào)理肉制品中，總共檢測(cè)出6 種不同的成分，其中品牌A的5 種產(chǎn)品（經(jīng)典墨魚丸、墨魚膠外）、品牌C的香菇貢丸、品牌E的親親腸、品牌G的經(jīng)典撒尿牛肉丸共8 份樣品僅檢測(cè)出原雞（Gallus gallus）成分，而這8 份樣品的配料表中標(biāo)示其他成分均未檢出。品牌A的經(jīng)典墨魚丸和品牌B墨魚丸產(chǎn)品的配料表標(biāo)示含有墨魚和魚糜，但鑒定的成分分別為原雞、魷魚（Dosidicus gigas）和原雞、鰱魚，可以肯定的是這2 個(gè)樣品存在使用雞肉摻假的行為。從該結(jié)果中可以看出，不管是菜市場(chǎng)低價(jià)出售的還是大品牌的調(diào)理肉制品，都存在使用雞肉作為添加肉源的行為，對(duì)于雞肉過(guò)敏癥或有禁忌的人應(yīng)避免進(jìn)食該類食品。

2.4 某火鍋店肉制食品成分鑒定

由表3可知，在某火鍋店食用的肉制食品有5 種產(chǎn)品（3 種切片肉、2 種肉丸），共檢測(cè)出3種不同的成分，其中雞肉、肥牛、肥羊、牛肉丸名副其實(shí)，均檢測(cè)出相應(yīng)的成分。但是羊肉丸檢測(cè)出的成分較復(fù)雜，含有原雞（Gallus gallus）、家牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）3 種成分，不排除有摻假的可能。

3 討 論

調(diào)理肉制品因其原料高度破碎化，且添加諸多食品添加劑，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法已無(wú)法完成成分的鑒定[6]。

本研究使用DNA條形碼技術(shù)對(duì)3 類不同來(lái)源的36 份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，有27 份樣品（75%）含有雞源性成分，說(shuō)明大部分廠家使用廉價(jià)雞肉作為其他肉類的替代品，但大部分食品并沒(méi)有進(jìn)行顯著的標(biāo)示。因菜市場(chǎng)和火鍋店的肉質(zhì)食品為散裝，無(wú)法查看配料表，實(shí)驗(yàn)僅能從成分與名稱的對(duì)應(yīng)關(guān)系來(lái)判斷。具體情況分析如下：

1）某菜市場(chǎng)購(gòu)買的散裝調(diào)理肉制品質(zhì)量最差，11 份樣品（91.7%）中檢測(cè)出雞源性成分，9 個(gè)樣品（75%）的檢測(cè)出的成分與名稱不相符。2）某火鍋店提供的調(diào)理肉制品質(zhì)量最好，采集的5 份樣品檢測(cè)出的成分均與名稱相符，僅羊肉丸的成分較復(fù)雜，除了應(yīng)有的羊肉成分外，還有雞、牛源性成分，不排除有摻假的可能。3）某超市的調(diào)理肉制品鑒定后對(duì)照配料表，發(fā)現(xiàn)8 個(gè)樣品（42.1%）檢測(cè)的成分中僅含有雞源性成分，卻無(wú)配料表標(biāo)示的其他成分，2 個(gè)樣品（10.5%）中含有配料表中未標(biāo)出的成分。

從本研究的結(jié)論中可以看出，目前市場(chǎng)上出售的調(diào)理肉制品質(zhì)量參差不齊，尤其是利用價(jià)格低廉的雞肉添加至其他種類的調(diào)理肉制品的現(xiàn)象較為嚴(yán)重。曲勤鳳等[4]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買的15 批次魚糜制品（魚丸）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中4 批次產(chǎn)品含量>

10%，其他11 種魚糜制品含量均<10%，與本研究結(jié)論相似，但其并未檢測(cè)出其他成分。本研究成功地運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)調(diào)理肉制品的成分進(jìn)行了定性檢測(cè)，為檢測(cè)調(diào)理肉制品類食品成分提供了新方法，且該方法靈敏、快速、廉價(jià)和可靠。對(duì)于維護(hù)廣大消費(fèi)者合法權(quán)益，穩(wěn)定市場(chǎng)秩序，保障食品安全具有重要的意義。

DNA條形碼技術(shù)是從分子水平上對(duì)食品進(jìn)行鑒定，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，其準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)單的特點(diǎn)為食品鑒定領(lǐng)域帶來(lái)了新的革命[6]。但是DNA條形碼鑒定技術(shù)只能定性的對(duì)食品成分進(jìn)行檢測(cè)，不能檢測(cè)出每種成分的含量。因此，還需與熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行進(jìn)一步探索。

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