肉類食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌及其控制研究進(jìn)展

賈珊珊++李沛軍++陳從貴

摘 要：產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于自然界，且可以形成芽孢，是導(dǎo)致肉類食物中毒和氣性壞疽等的主要病原菌。本文綜述了肉類食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染情況、生長(zhǎng)影響因素以及控制其生長(zhǎng)的方法；指明了利用食用安全的天然物質(zhì)，研發(fā)高效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的技術(shù)與方法，對(duì)保障肉制品安全和促進(jìn)肉類工業(yè)健康發(fā)展的現(xiàn)實(shí)意義，旨在為人們選擇適合肉類食品中抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)的途徑提供參考。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；肉類食品；污染情況；控制研究

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，

C. perfringens）是一種屬于梭菌屬的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有莢膜，可產(chǎn)生芽孢，不具有運(yùn)動(dòng)性。C. perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，該菌的致病因子是其所產(chǎn)生的外毒素[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)C. perfringens產(chǎn)生的外毒素多達(dá)17 種[2]，并以α型（CPA）、β型（CPB）、ε型（ETX）和ι型（ITX）4 種毒素最為常見；C. perfringens還會(huì)產(chǎn)生其他多種毒素或者潛在的致毒因子，如腸毒素（CPE）[3]。根據(jù)所產(chǎn)毒素的不同，C. perfringens可分為5 種類型，它們與5 種主要毒素的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。5種C. perfringens均會(huì)導(dǎo)致特定的動(dòng)物患病，其中A型和C型C. perfringens可引起人患病，例如，腸毒素引起的食物中毒、水樣腹瀉以及嬰兒的突發(fā)性死亡，α型毒素引起的氣性壞疽及β型毒素引起的人壞死性腸炎[4]。

在美國(guó)和一些發(fā)展中國(guó)家，由A型C. perfringens菌引起的食物中毒是最常見報(bào)道的食物中毒之一，目前在美國(guó)排名第2位，每年可導(dǎo)致食物中毒約100 萬例[5-6]。

C. perfringens引起眾多食物中毒事例的原因主要有：1）它廣泛存在于自然界，包括土壤、人以及動(dòng)物的腸道中[7]；

2）它能在適宜的環(huán)境下快速生長(zhǎng)，代時(shí)甚至小于

10 min[4，8]；3）它可以產(chǎn)生多種毒素，導(dǎo)致人或動(dòng)物患病，尤其是A型C. perfringens[9]。

不僅如此，C. perfringens對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較低，也是容易在食品中爆發(fā)的重要原因。其最適生長(zhǎng)pH值為6～7[10]，但在pH 5～9范圍仍可生長(zhǎng)；它可在15～50 ℃快速生長(zhǎng)[11]，在15 ℃以下亦可緩慢生長(zhǎng)，甚至可在6 ℃條件下生長(zhǎng)[12]；其生長(zhǎng)的最低水分活度值為0.95。

C. perfringens芽孢能夠耐高溫，在煮沸15 min或更長(zhǎng)的時(shí)間仍可存活[13]，并可在10～54 ℃溫度內(nèi)快速萌發(fā)和二次生長(zhǎng)[14]。此外，C. perfringens還對(duì)肉類食品中各種防腐方法具有較高的抵抗能力[13-15]。

1 肉類食品中C. perfringens的污染情況

由C. perfringens導(dǎo)致的食物中毒多與肉和禽肉制品相關(guān)[17-18]。調(diào)查美國(guó)1998—2010年由C. perfringens引起食物中毒的結(jié)果顯示，肉類食品占食物總量的92%，其中牛肉制品占46%，禽肉制品占30%，豬肉制品占16%[19]。不僅肉制品容易被C. perfringens污染，原料肉由于富含蛋白質(zhì)也容易成為C. perfringens滋生的土壤[18，20]。富含蛋白質(zhì)的動(dòng)物在屠宰過程中會(huì)被來自其腸道或糞便中的C. perfringens污染[21]；而原料食品和加工食品中

C. perfringens的污染率也分別高達(dá)30%和80%[22]。表2列出了近年來C. perfringens在部分國(guó)家肉樣品中的檢出率。

由表2可知，生鮮牛肉、豬肉、火雞肉和雞肉及各種肉制品中C. perfringens檢出率均超過10%，部分日本雞肉中檢出率甚至高達(dá)84%。

2 肉類食品中C. perfringens生長(zhǎng)的影響因素

Bennett等[28]對(duì)1998—2008年在美國(guó)由

C. perfringens、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒事件的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，無論是哪種致病菌，最常見引起食物中毒的錯(cuò)誤操作發(fā)生于食物加工和準(zhǔn)備的過程中，占所有因素的93%。比如，肉制品煮制后經(jīng)過不適當(dāng)冷卻工藝（44%）；將肉制品放置于不合適貯藏溫度下（22%）。Li[22]和Mcclure[29]等也指出，肉制品煮制后不適當(dāng)冷卻工藝和不合適的貯藏溫度是C. perfringens暴發(fā)的最常見原因。

2.1 不適當(dāng)冷卻工藝

科學(xué)合理的冷卻工藝，應(yīng)能最大程度地抑制致病菌芽孢的萌發(fā)及二次生長(zhǎng)。熱加工可能無法完全致死

C. perfringens的芽孢，還可能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，使其在較高溫度下快速萌發(fā)并生長(zhǎng)。C. perfringens是肉制品降溫過程是否安全的指示菌。有研究表明，向煮熟牛肉糜中接種3 種可形成芽孢的致病菌（枯草芽孢桿菌、C. perfringens和肉毒梭狀芽孢桿菌）時(shí)，經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)18 h的降溫過程后，C. perfringens數(shù)量增加了4～5（lg（CFU/g）），而其他2 種致病菌均無顯著生長(zhǎng)[30]。美國(guó)對(duì)煮制肉制品的冷卻工藝進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。對(duì)于非熏制的煮制肉及禽肉制品的冷卻過程，美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全及檢驗(yàn)局明確規(guī)定：從54.4 ℃降至26.7 ℃不得超過1.5 h，從26.7 ℃降至4.4 ℃不超過5 h[31]。

肉和禽肉制品的不合適降溫是導(dǎo)致C. perfringens生長(zhǎng)進(jìn)而引起食物中毒事件的重要因素。Valenzuela-Martinez等[32]將數(shù)量約為2～2.5 （lg（CFU/g））的C. perfringens芽孢接種到真空包裝豬肉樣品中，75 ℃水浴加熱20 min誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，隨后將樣品分別于12、15、18、21 h內(nèi)從54.4 ℃降至7.2 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C. perfringens的數(shù)量分別增至6.08、7.25、8.21、8.45 （lg（CFU/g））。Xiao等[33]的研究中也得到了相似的結(jié)果，在9、12、15、18、21 h內(nèi)使樣品從54.4 ℃降至4 ℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中

C. perfringens芽孢的量從初始接種的2.0～2.5（lg（CFU/g））分別增加了4.50、5.78、7.05、7.88、8.19（lg（CFU/g））。

2.2 不合適的貯藏溫度

除了不適當(dāng)?shù)睦鋮s工藝，肉制品在貯藏過程中發(fā)生溫度波動(dòng)或貯藏溫度不合適亦會(huì)引起C. perfringens生長(zhǎng)繁殖，對(duì)食品安全造成威脅。Juneja等[34]將15 株C. perfringens接種到真空包裝牛肉中，放置于12 ℃溫度下貯藏，分別測(cè)定0、1、4、7 d樣品中C. perfringens的數(shù)量。結(jié)果顯示，無論哪一種C. perfringens，樣品中C. perfringens的數(shù)量均隨貯藏天數(shù)的增加而急劇增長(zhǎng)。Nieto-Lozano等[35]發(fā)現(xiàn)，真空包裝的煮制火雞樣品在貯藏過程中，從4 ℃移至28 ℃的環(huán)境溫度中，貯藏12 h后，樣品中C. perfringens的量從2.0～2.5（lg（CFU/g））增至6.0（lg（CFU/g））。Mikelsaar等[36]發(fā)現(xiàn)將接種

C. perfringens的法蘭克福香腸分別貯藏于10 ℃溫度下60 d和15 ℃溫度下30 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C. perfringens的量從約為4.0 （lg（CFU/g））分別增加至5.7 （lg（CFU/g））和6.3（lg（CFU/g））左右。

3 肉類食品中C. perfringens的控制

3.1 原料肉源頭控制C. perfringens的方法

3.1.1 益生菌

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物的總稱，通過口服等方式定植于宿主腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能夠抑制對(duì)人體有害微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)宿主發(fā)揮有益作用[36]。乳桿菌、雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌均可作為益生菌，用于增強(qiáng)人體胃腸道中有益微生物的生長(zhǎng)[37-38]。但到目前為止，人們對(duì)益生菌作用機(jī)制的研究還不充分，主要認(rèn)為：益生菌通過與有害微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、降低胃腸道pH值以及產(chǎn)生某些特定的抑菌物質(zhì)等方式，來抑制有害微生物的生長(zhǎng)[39]。

有研究證實(shí)，乳桿菌和雙歧桿菌能夠減少

C. perfringens的數(shù)量。Kim等[40]從健康豬胃腸道中分離出5 株乳桿菌和2 株雙歧桿菌，它們均可在體外模擬胃腸道環(huán)境下生長(zhǎng)，其中，噬淀粉乳桿菌S6對(duì)C. perfringens的抑制作用要比金霉素和土霉素等抗生素更有效。Rinkinen等[41]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳桿菌可通過降低黏附能力來抑制C. perfringens的生長(zhǎng)。

陽(yáng)艷林等[42]從健康雞的胃腸道中分離得到的一株枯草芽孢桿菌，可體外抑制C. perfringens ATCC 13124，并通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，抑菌物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為960～980，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。有公司以枯草芽孢桿菌PB6作為主要成分，生產(chǎn)出微生物制劑克洛生，并通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明了它對(duì)抑制C. perfringens生長(zhǎng)的有效性[43-44]。

表3列出了可以抑制動(dòng)物體內(nèi)C. perfringens的益生菌。

3.1.2 益生元

益生元（prebiotics）作為一類不易被人體消化吸收的食品成分，可選擇性地刺激一種或幾種腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性，而對(duì)寄主產(chǎn)生有益的影響[48]。許多體外實(shí)驗(yàn)以及哺乳動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，益生元對(duì)C. perfringens具有抑制作用。例如，與未添加的對(duì)照組相比，添加于動(dòng)物飲食中的果寡糖，可以顯著降低腸道中C. perfringens的數(shù)量[49]；喂食添加有天然益生元糖類物質(zhì)的動(dòng)物，其體內(nèi)C. perfringens的數(shù)量顯著少于對(duì)照組[50-53]。也有研究證實(shí)，乳糖可用來抑制非哺乳動(dòng)物雞腸道內(nèi)C. perfringens的數(shù)量，顯示乳糖可能是一種適用于禽類的益生元物質(zhì)[54]。

3.2 肉類食品中抑制C. perfringens生長(zhǎng)的方法

3.2.1 有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽

在新型的食品抑菌劑中，有機(jī)酸以及有機(jī)酸鹽被認(rèn)為是較好的選擇，因其具有較寬的抑菌譜，無毒、穩(wěn)定，并具有對(duì)食品的顏色和風(fēng)味無副作用等優(yōu)點(diǎn)[55]。乳酸鈉、乳酸鉀、二乙酸鈉等有機(jī)酸鹽，已被廣泛用于肉制品和禽肉制品，以抑制單核李斯特菌和其他腐敗菌，增強(qiáng)食品的微生物安全[56-57]。有機(jī)酸的抑菌機(jī)理可能是：有機(jī)酸能夠穿過細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的pH值降低，導(dǎo)致帶電離子的釋放，并使質(zhì)子不能穿過細(xì)胞膜，阻礙了代謝活動(dòng)從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[58]。目前被研究用來抑制

C. perfringens的有機(jī)酸鹽主要有：乳酸鈣、乳酸鉀、乳酸鈉、檸檬酸鈉、山梨酸和苯甲酸、磷酸酸鹽等[9， 31， 59-60]。

Saeed等[59]利用檸檬酸鈉緩沖溶液及其與二乙酸鈉的混合液，分別添加于烤牛肉中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接種了

2.5（lg（CFU/g））C. perfringens的樣品，在18 h內(nèi)從54.4℃降至7.2 ℃時(shí)，烤牛肉對(duì)照組中C. perfringens的數(shù)量增加了3.70（lg（CFU/g））；而添加了檸檬酸鈉緩沖液及其混合液的樣品中，C. perfringens的數(shù)量卻減少了2.47（lg（CFU/g））?？梢姡瑱幟仕徕c緩沖液及其與二乙酸鈉的混合物能夠顯著降低C. perfringens萌發(fā)和二次生長(zhǎng)的潛在危險(xiǎn)。

Valenzuela-Martinez等[32]觀察了乳酸鈣、乳酸鉀和乳酸鈉對(duì)豬肉降溫過程中C. perfringens芽孢萌發(fā)和二次生長(zhǎng)的影響情況，結(jié)果顯示，豬肉制品中添加2.0%的乳酸鈣或者3.0%的乳酸鉀或乳酸鈉，在54.4 ℃至7.2 ℃、長(zhǎng)達(dá)21 h的降溫過程中，可使產(chǎn)品中C. perfringens的增長(zhǎng)量保持在可接受范圍內(nèi)；而對(duì)照組中C. perfringens卻增長(zhǎng)了6.30（lg（CFU/g））。

3.2.2 細(xì)菌素

細(xì)菌素通常被認(rèn)為是由細(xì)菌生成的多肽類物質(zhì)，能夠抑制或殺死近源性和其他微生物[61]。有研究證實(shí)，羅伊氏菌素[62]、乳酸鏈球菌素[62-64]、乳酸片球菌素[35]、戊糖片球菌素[65]、乳酸乳球菌素[66]、糞腸球菌素[67]和芽孢桿菌素[68-69]等細(xì)菌素，均可體外抑制C. perfringens。片球菌素也能有效抑制單核李斯特菌、金黃色葡萄球菌、

C. perfringens等腐敗菌和致病菌[70-71]。

但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌素對(duì)C. perfringens的抑制作用非常有限[72]。細(xì)菌素可能被食品中內(nèi)源性蛋白酶降解，或者被肉和脂肪顆粒吸收[73]，由此影響了細(xì)菌素對(duì)體內(nèi)C. perfringens的抑制效果。細(xì)菌素對(duì)體內(nèi)

C. perfringens的抑制作用值得進(jìn)一步研究。

3.2.3 殼聚糖

殼聚糖是由自然界幾丁質(zhì)脫乙酰作用得到的聚合物，食用安全，已廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。殼聚糖類似于米糠、麥麩等膳食纖維，不能被人體吸收，可增加腸道中有益微生物的數(shù)量，并減少C. perfringens等致病菌的數(shù)量。Juneja等[74]將殼聚糖添加到培養(yǎng)基以及倉(cāng)鼠的食物中，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，觀察殼聚糖對(duì)C. perfringens生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以顯著抑制C. perfringens的體外生長(zhǎng)，但對(duì)其體內(nèi)生長(zhǎng)量卻無顯著影響。

Aziz等[75]研究發(fā)現(xiàn)，即使牛肉和雞肉經(jīng)歷了不合適的降溫過程，殼聚糖也能有效抑制產(chǎn)品中C. perfringens芽孢的萌發(fā)和二次生長(zhǎng)。Santos等[76]在體外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能有效抑制C. perfringens、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌等革蘭氏陽(yáng)性致病菌。

3.2.4 植物提取物和香精油

有體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物提取物和植物香精油可以抑制C. perfringens的生長(zhǎng)[77-78]，其中包括綠茶提取物[79]。植物提取物和香精油的抑菌效果與很多因素有關(guān)，除了與植物類型、生長(zhǎng)地理位置以及生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)外[21]，還與提取方式、培養(yǎng)基種類、pH值以及培養(yǎng)溫度有關(guān)[80]。

綠茶提取物具有抑制C. perfringens芽孢萌發(fā)及二次生長(zhǎng)的作用。有學(xué)者將不同濃度的綠茶提取物，添加于C. perfringens芽孢接種量約3（lg（CFU/g））的牛肉、雞肉和豬肉中，在煮制樣品經(jīng)歷12、15、18、21 h從54.4℃降至7.2 ℃后，實(shí)驗(yàn)觀察樣品中C. perfringens的變化情況，結(jié)果顯示：添加2%的綠茶提取物，3 種肉制品中

C. perfringens的數(shù)量均顯著低于對(duì)照組；且提取物濃度不同，抑菌效果也不同[81]。

Demirci等[81]利用土耳其唇形科糙蘇屬植物中提取的香精油，通過體外抑制食源性致病菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所提精油可以有效抑制C. perfringens、單核李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌O157：H7等致病菌的生長(zhǎng)。Sebranek等[82]將冬季香薄荷精油添加到接種了C. perfringens A型菌株的意大利香腸中，在25 ℃貯藏30 d，觀察香腸中

C. perfringens在貯藏過程的數(shù)量變化，結(jié)果表明，該精油可以顯著抑制C. perfringens的生長(zhǎng)，且在貯藏結(jié)束后，樣品中C. perfringens的數(shù)量?jī)H為2.80 （lg（CFU/g））。

4 結(jié) 語(yǔ)

C. perfringens在環(huán)境中分布廣泛，很容易污染富含蛋白的肉類食品，對(duì)肉食品安全造成較大潛在威脅。現(xiàn)已研究證實(shí)，有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽、細(xì)菌素、殼聚糖和植物提取物等天然物質(zhì)，可以有效抑制C. perfringens的生長(zhǎng)，但其實(shí)際應(yīng)用還很有限。隨著人們對(duì)綠色食品和食品安全的日益重視，利用食用安全的天然成分，開展其對(duì)

C. perfringens的抑制作用研究，將會(huì)成為熱點(diǎn)。而對(duì)于易受C. perfringens污染的肉及肉制品，研究與開發(fā)高效的抑制方法，并應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，對(duì)保障肉制品安全和促進(jìn)肉類工業(yè)健康發(fā)展，更具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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