Shank1在腎細胞癌組織中的表達及臨床意義

趙萬里　劉勝　劉民　周煦東　孫鵬宇　王憲　楊繼宏　馬曉麗

?

Shank1在腎細胞癌組織中的表達及臨床意義

趙萬里①劉勝①劉民①周煦東①孫鵬宇①王憲①楊繼宏②馬曉麗③

摘要目的：檢測Shank家族成員Shank1在腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）中的表達，探討在RCC癌組織與癌旁組織中Shank1的表達差異，分析其與RCC臨床病理特征的關系。方法：收集2008年5月至2014年12月滄州市中心醫(yī)院與濟南市中心醫(yī)院120例RCC術后患者的癌組織與癌旁組織標本，采用免疫組織化學染色及Western blot檢測Shank1的蛋白表達水平，分析Shank1表達與RCC臨床病理特征的關系。結(jié)果：免疫組織化學結(jié)果顯示，RCC的癌組織中Shank1表達較癌旁組織明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RCC的癌組織中Shank1蛋白表達水平明顯高于癌旁組織。對Shank1表達上調(diào)RCC患者的臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，Shank1在癌組織中的高表達與患者的性別、年齡、腫瘤的大小、TNM分期無顯著性相關（P>0.05），但與RCC的不同病理類型顯著性相關（P<0.05）。結(jié)論：Shank1在RCC的癌組織中異常表達，并與RCC的病理類型相關。

關鍵詞腎細胞癌Shank1蛋白表達免疫組織化學

作者單位：①滄州市中心醫(yī)院泌尿外二科（河北省滄州市061014）；②華北油田總醫(yī)院泌尿外科；③濟南市中心醫(yī)院中心實驗室

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%［1］。WHO（2004年）根據(jù)RCC組織形態(tài)學、遺傳學、免疫表型及預后等臨床特征，對腎細胞癌進行了新的分類，保留了1997年分類中的透明細胞性腎細胞癌、乳頭狀腎細胞癌（Ⅰ型和Ⅱ型）、嫌色細胞性腎細胞癌及未分類腎細胞癌，增加了Bellini集合管癌、腎髓質(zhì)癌、多房囊性腎細胞癌、Xp11.2易位性/TFE3基因融合相關性腎癌、神經(jīng)母細胞瘤相關性腎細胞癌和黏液管狀梭形細胞癌9個類型［2］。透明細胞性腎細胞癌占RCC的70%～80%，近50%患者缺乏早期癥狀，25%患者就診時已屬于晚期，存在病灶的局部侵襲或轉(zhuǎn)移［3］。了解RCC的起源、復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機制對RCC的診斷、治療和預后具有重要的指導意義。

Shank家族是一種“骨架蛋白”，Shank1是該家族的3個成員之一，可將多種細胞膜和胞漿的蛋白連接一起，從分子水平調(diào)節(jié)亞細胞結(jié)構(gòu)、蛋白靶向連接和信號傳遞［4-5］。本研究旨在觀察RCC患者的癌組織中Shank1在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達，并探討Shank1的表達與臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本

組織標本來源于2008年5月至2014年12月滄州市中心醫(yī)院和濟南市中心醫(yī)院120例的術后患者，病理均診斷為RCC，其中男性75例、女性45例。年齡2～79歲，中位年齡49歲，其中年齡>50歲57例、年齡≤50歲63例。術中分別切取癌組織，及距腫瘤邊緣≥2 cm的約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm癌旁組織。

1.2 主要試劑

兔抗人Shank1單克隆抗體與鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色采用兩步法對組織切片行免疫組織化學染色。60℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90℃微波抗原修復8 min，5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h。Shank1鼠抗人一抗稀釋（1:200），室溫孵育1 h后4℃過夜，聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規(guī)DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照組，同時設空白對照組。根據(jù)陽性、陰性和空白對照組的顯色情況，在排除假陽性和假陰性的前提下，計數(shù)每例患者的腫瘤組織中所有腫瘤細胞，當陽性細胞率>10%則判斷為表達陽性，且以細胞膜或胞漿染成棕黃色判定為弱陽性，棕褐色判定為強陽性。

1.3.2 Western blot檢測取新鮮冰凍RCC的癌組織和癌旁組織，加入0.5 mL組織裂解液進行裂解，裂解液配方中Tris-Cl為10 mM、pH為8.0、NaCl為150 mM、 EDTA為1 mM、1%NP-40、10%甘油及蛋白酶抑制劑。BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取50 μg組織總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后，抗Shank1（1:1 000）及抗內(nèi)參GAPDH（1:20 000）抗體室溫孵育1 h，TBST漂洗后辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000）室溫孵育1h，TBST漂洗后電化學發(fā)光法檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。將RCC患者癌組織高表達同時癌旁組織低表達的病例定義為Shank1表達上調(diào)病例，表達上調(diào)與表達無變化例數(shù)間的比較行χ2檢驗，Western blot灰度比較行t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RCC的癌組織及癌旁組織中Shank1表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Shank1特異性分布于腎細胞的細胞質(zhì)，呈棕色顆粒狀，彌漫或灶性分布。RCC的癌組織及癌旁組織中均有著色，癌組織中癌細胞染色為深棕色，而癌旁組織中細胞著色呈淺棕色，提示RCC的癌組織中Shank1表達高于癌旁組織（圖1）。120例RCC的癌組織和癌旁組織中，47.5%（57/120）的癌組織存在不同程度的Shank1表達水平的上調(diào)。

為進一步證實免疫組織化學染色的結(jié)果，選取4 例RCC樣本對Shank1的蛋白表達水平行Western blot分析，結(jié)果顯示RCC的癌旁組織中Shank1蛋白低表達，而癌組織中高表達，與免疫組織化學染色的結(jié)果一致（P<0.05，圖2）。

圖1 免疫組織化學法檢測RCC的癌組織和癌旁組織中Shank1的表達Figure 1 Immunohistochemistry result of the expression of Shank1 in RCC cancer tissue and pericancerous tissues

圖2 Western blot檢測RCC的癌組織和癌旁組織中Shank1的表達Figure 2 Western blot results of Shank1 expression in RCC cancer tissue and pericancerous tissues

2.2 RCC臨床病理特征與Shank1蛋白表達水平的關系

分析RCC臨床病理特征與Shank1蛋白表達的關系，對RCC患者的癌組織中Shank1表達上調(diào)與表達無變化例數(shù)的比較行χ2檢驗，結(jié)果顯示120例RCC患者的癌組織中Shank1高表達與性別、年齡、腫瘤的大小、TNM分期無顯著性相關（P>0.05），但與RCC的不同病理類型顯著相關（P<0.05，表1）。

將RCC分型中Shank1上調(diào)表達率>60%定義為高表達型，分析高表達亞型的臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，在透明細胞性腎細胞癌、Ⅰ型及Ⅱ型乳頭狀腎細胞癌和嫌色細胞性腎細胞癌的癌組織中Shank1高表達與腫瘤大小顯著相關（P<0.05），腫瘤越大Shank1表達水平越高（表2，3）。

表1 RCC病理類型與Shank1表達水平的關系Table 1 Relationship between the histological differentiation and expression level of Shank1 in RCC cancer tissue

表2 120例RCC患者的癌組織中Shank1表達水平與臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between the expression level of Shank1 in 120 cases of RCC cancer tissue and clinicopathological characteristics

表3 63例透明細胞性腎細胞癌、Ⅰ型及Ⅱ型乳頭狀腎細胞癌和嫌色細胞性腎細胞癌患者的癌組織中Shank1表達水平與臨床病理特征的關系Table 3 Relationship between the expression level of Shank1 and clinicopathological characteristics in 63 cases of clear cell RCC, papillary RCC, and chromophobe RCC cancer tissues

3 討論

Shank家族，包括Shank1、Shank2和Shank3在多種組織中均有表達［6］。Shank是一種神經(jīng)系統(tǒng)中重要的中心骨架蛋白，可連接多種受體、蛋白和細胞骨架，連接定位于細胞質(zhì)和細胞膜上的多種受體和蛋白，因此在介導各種受體間的信號傳導、維持突觸正常功能方面具有重要作用［7］。

在大鼠組織中Shank1大量表達于大腦皮質(zhì)、海馬和杏仁核［8］。Shank1在神經(jīng)組織中具有完整的Shank蛋白結(jié)構(gòu)，自N端至C端共有5個結(jié)構(gòu)域，這些完整的結(jié)構(gòu)域使Shank1本身或通過其他骨架蛋白和連接蛋白與多種蛋白分子構(gòu)成連接，其中有眾多分子與腫瘤的發(fā)生、遷移、侵襲等相關［9］。本研究旨在檢測RCC的癌組織和癌旁組織中Shank1是否表達，以及在RCC發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮作用。本研究通過免疫組織化學染色及Western blot檢測到RCC的癌旁組織中Shank1陽性表達，并且癌組織中蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，表達上調(diào)率達到47.5%。

對Shank1表達上調(diào)RCC患者的臨床病理特征分析顯示，癌組織中Shank1高表達與患者的年齡、性別、TNM分期無顯著性相關（P>0.05），而與病理類型顯著性相關（P<0.05）。在透明細胞性腎細胞癌、Ⅰ型及Ⅱ型乳頭狀腎細胞癌和嫌色細胞性腎細胞癌中Shank1高表達與腫瘤的大小呈正相關，即Shank1表達水平越高腫瘤越大。以上結(jié)果提示在RCC中Shank1可能發(fā)揮促進腫瘤生長的作用。

Shank1的PDZ結(jié)構(gòu)域可通過骨架蛋白PSD-95與谷氨酸受體NMDA、KAR、mGluRs以及細胞黏附分子Semaphorin結(jié)合，在不同器官的腫瘤中均有異常表達［10］；同時Shank1富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域可通過Homer連接蛋白與mGluRs連接。mGluRs在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，并且極有可能參與RCC的發(fā)生、發(fā)展［11］。研究顯示，所有類型的RCC均存在不同程度的代謝紊亂，也有研究提出RCC可能是一種代謝性疾?。?2］。Shank1通過發(fā)揮細胞骨架作用介導多種信號傳導途徑，其中谷氨酸信號通路則在細胞代謝中發(fā)揮重要作用。除此之外，Shank1可通過骨架蛋白與RACl/CDC42、AMPA型谷氨酸受體等發(fā)生相互作用，并在眾多腫瘤中均有異常表達。其中RACl/CDC42也是腫瘤研究中的熱點，在肝癌、肺癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤中均有促進腫瘤生長的作用［13-14］。有研究表明RACl/CDC42途徑也參與了RCC的細胞遷移［15］。

綜上所述，RCC癌組織中Shank1基因的高表達具有促進RCC癌細胞生長作用，在RCC診斷及基因治療中具有一定的臨床應用前景。Shank1基因可能通過介導谷氨酸受體等相關的信號傳導促進RCC的發(fā)生發(fā)展，但具體的作用機制還有待進一步研究。

參考文獻

[1] Lane BR, Kattan MW.Predicting outcomes in renal cell carcinoma[J].Curr Opin Urol, 2005, 15(5):289-297.

[2] Ma JH, Guan YY, Zheng S, et al.Progress in pathological classification of renal cell carcinoma[J].J Oncol, 2008, 14(5):334-336.[馬建輝,關有彥,鄭閃,等.腎細胞癌病理分類的新進展[J].腫瘤學雜志,2008,14 (5):334-336.]

[3] Ljungberg B, Bensalah K, Canfield S, et al.EAU guidelines on renal cell carcinoma: 2014 update[J].Eur Urol, 2015, 67(5):913-924.

[4] Naisbitt S , Kim E , Tu JC, et al.Shank, a novel family of postsynaptic density proteins that binds to the NMDA receptor/PSD-95/GKAP complex and cortactin[J].Neuron, 1999, 23(3):569-582.

[5] Jee C, Lee J, Lee JI, et al.SHN-1, a Shank homologue in C.elegans, affects defecation rhythm via the inositol-1, 4, 5-trisphosphate receptor[J].FEBS Lett, 2004, 561(1-3):29-36.

[6] Sheng M, Kim E.The Shank family of scaffold proteins[J].J Cell Sci, 2000, 113( Pt 11):1851-1856.

[7] Guilmatre A, Huguet G, Delorme R, et al.The emerging role of Shank genes in neuropsychiatric disorders[J].Dev Neurobiol, 2014, 74(2):113-122.

[8] Kreienkamp HJ, Zitzer H, Gundelfinger ED, et al.The calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin from human and rodent brains interacts with members of the ProSAP/SSTRIP/Shank family of multidomainproteins[J].J Biol Chem, 2000, 275(42):32387-32390.

[9] Mao W, Watanabe T, Cho S, et al.Shank1 regulates excitatory synaptic transmission in mouse hippocampal parvalbumin-expressing inhibitory interneurons[J].Eur J Neurosci, 2015, 41(8):1025-1035.

[10] Worzfeld T, Offermanns S.Semaphorins and plexins as therapeutic targets[J].Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(8):603-621.

[11] Lai P, Xu YF.Research progress of mGluR1 in renal cell carcinoma[J].Int J Urol Nephrol, 2015, 35(4):602-604.[賴鵬,許云飛.親代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)在腎癌中的研究進展[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志,2015, 35(4):602-604.]

[12] Linehan WM, Srinivasan R, Schmidt LS.The genetic basis of kidney cancer: a metabolic disease[J].Nat Rev Urol, 2010, 7(5):277-285.

[13] Ma J, Xue Y, Liu W, et al.Role of activated Rac1/Cdc42 in mediating endothelial cell proliferation and tumor angiogenesis in breast cancer [J].Plos One, 2013, 8(6):e66275.

[14] Reyes SB, Narayanan AS, Lee HS, et al.αvβ8 integrin interacts with RhoGDI1 to regulate Rac1 and Cdc42 activation and drive glioblastoma cell invasion[J].Mol Biol Cell, 2013, 24(4):474-482.

[15] Ni S, Hu J, Duan Y, et al.Down expression of LRP1B promotes cell migration via RhoA/Cdc42 pathway and actin cytoskeleton remodeling in renal cell cancer[J].Cancer Sci, 2013, 104(7):817-825.

（2016-01-18收稿）

（2016-03-29修回）

Expression of Shank1 and its clinical significance in renal cancer tissue

Wanli ZHAO1, Sheng LIU1, Min LIU1, Xudong ZHOU1, Pengyu SUN1, Xian WANG1, Jihong YANG2, Xiaoli MA3
Correspondence to: Xiaoli MA; E-mail: mxl7125@126.com
1The Second Department of Urological Surgery, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061014, China;2The General Hospital of North China Oil Field, Renqiu 062552, China;3Central Laboratory, Ji'nan Central Hospital, Ji'nan 250013, China

AbstractObjective: To detect the expression of Shank1 protein in renal cell carcinoma (RCC), to investigate its difference between the tumor and carcinoma adjacent tissue, and to analyze its correlation with RCC clinicopathological characteristics and prognosis.Methods: The renal carcinoma and carcinoma adjacent tissues of 120 patients were selected from Cangzhou Central Hospital and Ji'nan Central Hospital from May 2008 to December 2014.The expression level of Shank1 was determined by immunohistochemistry and Western blot.Statistical analysis was performed to determine the relationship between the expression of Shank1 and the clinicopathological features of RCC patients.Results: Results of immunohistochemistry showed that the expression level of Shank1 in renal cancer tissue was significantly higher than that in carcinoma adjacent tissue, and the difference was statistically significant (P＜0.05).Western blot results showed that the expression level of Shank1 protein in renal cancer tissue was also significantly higher than in carcinoma adjacent tissue.Correlation analysis found that the high expression level of Shank1 in renal cancer tissue was not significantly related to gender, age, tumor size, and TNM stage, but was significantly associated with the histological differentiation of RCC (P＜0.05).Conclusion: Shank1 is abnormally expressed in RCC renal cancer tissues and is correlated with the histological differentiation of RCC.

Keywords:renal cell carcinoma, Shank1, protein expression, immunohistochemistry

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.08.064

通信作者：馬曉麗mxl7125@126.com

作者簡介

趙萬里專業(yè)方向為泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤研究。

E-mail：tianxiajiankang148@163.com

·臨床研究與應用·