肝細(xì)胞肝癌中AOC4P表達(dá)和臨床意義

何倩倩　王浩聯(lián)　張金平　李東穎　李建生

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肝細(xì)胞肝癌中AOC4P表達(dá)和臨床意義

何倩倩王浩聯(lián)張金平李東穎李建生

摘要目的：探討肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA含銅胺氧化酶4的假基因（amine oxidase copper containing 4 pseudogene，AOC4P）表達(dá)及其臨床意義。方法：選取2009年6月至2010年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的肝癌組織106例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中AOC4P表達(dá)，并分析其表達(dá)水平與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，106例肝癌組織中AOC4P相對(duì)表達(dá)量為0.66±0.34，低于癌旁組織的1.45±0.63，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。單因素分析結(jié)果顯示，AOC4P低表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)（P<0.05）。AOC4P高表達(dá)組的患者生存期明顯長(zhǎng)于AOC4P低表達(dá)組，Cox多因素回歸分析顯示AOC4P表達(dá)水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵襲是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論：AOC4P在肝癌組織中表達(dá)降低，可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用；AOC4P表達(dá)降低提示患者預(yù)后差，且為肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，將來(lái)可能作為肝癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞肝細(xì)胞癌長(zhǎng)鏈非編碼RNA含銅胺氧化酶4的假基因TNM分期預(yù)后

作者單位：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（鄭州市450052）

Okazaki等［1］于2002年首次提出長(zhǎng)非編碼RNA （lncRNA）這一概念，指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。早期研究認(rèn)為lncRNA是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的副產(chǎn)物，不編碼蛋白質(zhì)，無(wú)任何生物學(xué)功能［2］。研究結(jié)果表明，lncRNA參與了表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞分化等重要的調(diào)控過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［3-4］。我國(guó)肝癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，最新的統(tǒng)計(jì)資料表明［5］，2015年我國(guó)癌癥新發(fā)病例約429.2萬(wàn)例，其中新發(fā)肝癌46.6萬(wàn)例，占10.9%，肝癌的患病率在男性惡性腫瘤中居第三位，在女性惡性腫瘤中居第五位。全國(guó)惡性腫瘤死亡病例約281.4萬(wàn)例，其中肝癌患者42.3萬(wàn)例，占15.1%，死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居第三位。目前肝癌的治療手段是以手術(shù)治療為主的綜合治療，手術(shù)治療效果不佳的主要原因在于早期診斷率低和術(shù)后復(fù)發(fā)率高，有文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA中含銅胺氧化酶4的假基因（amine oxidase copper containing 4 pseudogene，AOC4P）可能為潛在的肝癌腫瘤標(biāo)志物［6］。因此，本研究對(duì)AOC4P在肝癌中的表達(dá)水平與臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系進(jìn)一步探究，為尋找新的肝癌預(yù)后標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源選取2009年6月至2010年6月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的肝癌組織106例，術(shù)前患者均未接受化療、放療等輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌。對(duì)照組標(biāo)本來(lái)自于同一患者的癌旁組織（距離手術(shù)切緣至少3 cm），術(shù)后病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有標(biāo)本切除后，立即放入液氮中后轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆??；颊咝g(shù)后均在門(mén)診隨訪，并常規(guī)復(fù)查AFP、腹部B超，必要時(shí)復(fù)查腹部CT，檢查結(jié)果資料完善，隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2015年9月30日，無(wú)失訪病例。腫瘤分期按美國(guó)腫瘤研究聯(lián)合委員會(huì)（Ameri?can Joint Committee on Cancer，AJCC）2010年發(fā)布的第七版分期系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)確定。本研究通過(guò)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitro?gen公司、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 方法

RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：取約100 mg凍存組織標(biāo)本，按照試劑說(shuō)明書(shū)抽提RNA，并使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，RNA樣品OD260/280值為1.8～2.1合格，按說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照SYBR Green說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用lncRNA AOC4P基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH作為內(nèi)參照。AOC4P引物序列如下：AOC4P：（Forward）5'- ACATGGATTGCT CCACGTGT-3'；（Reverse）5'-GACCACCTATTTCTGAGT AG-3'；GAPDH（Forward）5'-CCATGTTCGTCATGGGTG TGAACCA-3'；（Reverse）5'-GCCAGTAGAGGCAGGGAT GATGTTC-3'；數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

釆用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，配對(duì)的癌組織與癌旁組織中AOC4P表達(dá)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，AOC4P表達(dá)與肝癌患者的臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier單因素和Cox多因素進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)AOC4P在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

106例肝癌患者中，癌組織中AOC4P的表達(dá)水平0.66±0.34顯著低于癌旁組織中的的表達(dá)水平1.45± 0.63（t=-17.730，P<0.001）。其中，與正常癌旁組織相比，表達(dá)量低于2倍認(rèn)為AOC4P低表達(dá)，反之為高表達(dá)，結(jié)果顯示70例癌組織中的AOC4P低表達(dá)。

2.2 肝癌組織中AOC4P表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)癌組織中AOC4P相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織2倍為標(biāo)準(zhǔn)，將106例標(biāo)本分為AOC4P高表達(dá)組（n= 36）和AOC4P低表達(dá)組（n=70）。AOC4P在肝癌組織表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有顯著性相關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、性別、AFP、酗酒、HBV感染和血管侵襲無(wú)相關(guān)性（P>0.05，表1）。

表1 肝癌組織中AOC4P的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的相關(guān)性（n=106）Table 1 Relationship between AOC4P expression and clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma (n=106)

2.3 AOC4P表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果表明AOC4P低水平表達(dá)患者平均生存時(shí)間為（33.2±2.6）個(gè)月，中位生存時(shí)間為28.8個(gè)月，5年生存率為30%；AOC4P高水平表達(dá)患者平均生存時(shí)間為（42.7±3.4）個(gè)月，中位生存時(shí)間為34.8個(gè)月，5年生存率為52.8%。Kaplan-Meier單因素分析顯示AOC4P表達(dá)水平與患者總生存相關(guān)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.065，P=0.024，圖1）。

Cox多因素生存分析提示AOC4P和肝癌患者預(yù)后相關(guān)，是反映預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素，AOC4P表達(dá)降低明顯提示患者預(yù)后較差。同時(shí)結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲表達(dá)均為肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。

圖1 AOC4P表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系Figure 1 Relationship between AOC4P expression and survival time of hepatocellular carcinoma patients

表2 肝癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析Table 2 Cox multivariate regression analysis for the correlation between clinicopathological factors and prognosis of patients

3 討論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)［5］。肝癌死亡率高，較大程度上與其早期發(fā)現(xiàn)困難，就診時(shí)能夠接受根治性手術(shù)的患者少相關(guān)，因此尋找肝癌有效的腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。早期研究認(rèn)為lncRNA為基因組轉(zhuǎn)錄的“暗物質(zhì)”，但近年來(lái)研究表明lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有密切的聯(lián)系［7-8］。Yang等［9］發(fā)現(xiàn)lncRNA表達(dá)升高與肝癌復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，是肝癌患者術(shù)后生存的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。此外，與肝癌密切相關(guān)的lncRNA還有HULC、HOTAIR、H19、MEG3等［10］。早期研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)中共有4種AOC基因，認(rèn)為AOC3基因及其編碼蛋白VAP-1在疾病中發(fā)揮重要作用，而AOC4是沒(méi)有功能的擬基因［11］。目前關(guān)于AOC4P與除肝癌外的其他惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，在肝癌患者組織中的AOC4P表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，提示AOC4P的表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生可能存在一定關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道在肝癌中作為抑癌基因的lncRNA（如MEG3、H19、Dreh等）顯著下調(diào)［12］。本研究進(jìn)一步分析了AOC4P與肝癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，肝癌組織中AOC4P表達(dá)與腫瘤直徑相關(guān)，提示AOC4P的低表達(dá)可能參與了肝癌的增殖。有研究指出當(dāng)細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制失控時(shí)，癌變細(xì)胞數(shù)目將大量增加進(jìn)而有可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［13］。肝癌組織中AOC4P表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，提示AOC4P可能與肝癌的侵襲能力與進(jìn)展密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA（如HOTAIR、H19、BANCR等）可通過(guò)誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程［14］。EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的可逆過(guò)程，已被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移播散的早期事件中起著關(guān)鍵性作用［15］。有研究報(bào)道［16］，lncRNA結(jié)合到特定的蛋白伴侶并在調(diào)節(jié)其結(jié)合蛋白的活性和定位中發(fā)揮重要作用，MALAT-1是核lncRNA，通過(guò)與SR蛋白相互作用和影響SR蛋白及其他的剪接因子在核散斑區(qū)域的分布增加轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。Wang等［6］發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的AOC4P表達(dá)可能通過(guò)與Vimentin蛋白結(jié)合、促進(jìn)其降解從而抑制EMT過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)節(jié)EMT的信號(hào)通路主要包括TGF-β通路［17］、Wnt/β-catenin通路［18］、MEK-ERK通路［19］等，AOC4P是否通過(guò)上述信號(hào)通路調(diào)節(jié)EMT仍有待進(jìn)一步的研究。

本研究通過(guò)Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AOC4P低表達(dá)的患者無(wú)論生存時(shí)間還是生存率都低于高表達(dá)組，提示AOC4P的低表達(dá)可能與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)。另外，Cox多因素生存分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲、AOC4P表達(dá)為肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，在肝癌組織中AOC4P表達(dá)降低，且與肝癌的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后相關(guān)，同時(shí)AOC4P表達(dá)水平為肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示AOC4P可能以抑癌基因的角色參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其有可能作為肝癌患者預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，但其是否能作為肝癌早期診斷的標(biāo)記物及其抑制肝癌發(fā)生發(fā)展中的確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（2016-01-26收稿）

（2016-04-14修回）

Expression and clinical significance of AOC4P in hepatocellular carcinoma

Qianqian HE, Haolian WANG, Jinping ZHANG, Dongying LI, Jiansheng LI
Correspondence to: Jiansheng LI; E-mail: 415271633@qq.com
Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

AbstractObjective: This study investigates the expression of long non-coding RNA termed amine oxidase, copper containing 4, pseudogene (AOC4P) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its relationship with clinicopathological factors and patient prognosis.Methods: The expression of AOC4P in 106 HCC tissues and adjacent non-tumor tissues were detected using qRT-PCR.The relationship between AOC4P expression and clinicopathological factors, as well as patient prognosis, in HCC was analyzed.Results: The relative expression of AOC4P in the cancer tissues was 0.66±0.34, which was significantly lower than the relative expression in adjacent non-tumor tissues, i.e., 1.45±0.63 (P＜0.05).Univariate analysis showed that low AOC4P expression was correlated with tumor size, lymph node metastasis, and TNM stage (P＜0.05).The group with high AOC4P expression levels has longer survival time compared with the group with low AOC4P expression levels.Cox multivariate regression analysis showed that AOC4P expression, lymph node metastasis, and vascular invasion were all independent factors that affect prognosis of patients.Conclusion: AOC4P expression was reduced in HCC tissues, and AOC4P may play crucial roles in the occurrence and development of HCC.For patients with poor prognosis, low AOC4P expression is an independent risk factor for patients with HCC.Thus, AOC4P expression may be used as a molecular marker for HCC.

Keywords:hepatocellular carcinoma, long non-coding RNA, AOC4P, TNM stage, prognosis

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.08.092

通信作者：李建生415271633@qq.com

作者簡(jiǎn)介

何倩倩專(zhuān)業(yè)方向?yàn)橄滥[瘤的診治及其分子機(jī)制研究。

E-mail：1042689905@qq.com

·國(guó)家基金研究進(jìn)展綜述·