PEITC對人鼻咽癌CNE- 1/ CNE- 2細胞凋亡作用及機制研究

張功學，王明華，李道坤

（1.湖北文理學院附屬棗陽醫(yī)院病理科，湖北棗陽441200；2.湖北文理學院分子醫(yī)學中心，湖北襄陽441053）

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PEITC對人鼻咽癌CNE- 1/ CNE- 2細胞凋亡作用及機制研究

張功學1，王明華1，李道坤2*

（1.湖北文理學院附屬棗陽醫(yī)院病理科，湖北棗陽441200；
2.湖北文理學院分子醫(yī)學中心，湖北襄陽441053）

摘要：目的：觀察PEITC（異硫氰酸苯乙酯）對人鼻咽癌CNE-1/2細胞生長的影響以及對正常鼻咽部上皮細胞的毒性作用，探討其抗腫瘤作用機制.方法：MTT法測定PEITC對CNE-1/2細胞生長的抑制作用；流式細胞儀檢測PEITC對CNE-1/2細胞凋亡和氧化還原水平的影響；NAC阻斷后其氧化還原水平的變化.結(jié)果：PEITC能抑制CNE-1/2細胞生長，隨時間延長和劑量增加腫瘤細胞數(shù)明顯減少，CNE-2凋亡作用更加明顯，而對NP-69細胞組細胞毒性較低.當10.0 mg·ml-1PEITC在96 h時間點，NP-69細胞組IC50（12.62±0.52）與CNE-1組（3.57±0.34）、CNE-2細胞組IC50（2.64±0.20）差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；用Annexin V/PI染色流式細胞檢測各組細胞經(jīng)PEITC處理24 h后細胞發(fā)生凋亡，隨著PEITC濃度（0、5.0、10.0 mg·ml-1）的增加，細胞凋亡率增加；當PEITC 10.0 mg·ml-1濃度時，CNE-1/CNE-2凋亡率與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；DCFH-DA探針標記后流式檢測活性氧水平結(jié)果顯示：CNE-1/CNE-2活性氧水平分別在6、12h時間點與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Rhodamine-123試劑盒測定線粒體膜電位顯示：10.0 mg·ml-1濃度PEITC時CNE-1/CNE-2線粒體膜電位在24 h時間點與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；用NAC預(yù)處理各組細胞后檢測細胞活性氧及線粒體膜電位均出現(xiàn)反向作用.結(jié)論：PEITC能抑制人鼻咽癌CNE-1/2細胞的生長，同時對NP-69細胞具有低毒性，其抗腫瘤作用可能與其干擾細胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，誘導細胞凋亡有關(guān).

關(guān)鍵詞：異硫氰酸苯乙酯；鼻咽癌；細胞凋亡

異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITC）是天然存在于花椰菜、橄欖等十字花科蔬菜中的一類含有-N=C=S結(jié)構(gòu)的有機化合物，其中異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是研究最廣泛一種.流行病學和實驗研究表明，PEITC與其它的ITC可能是具有應(yīng)用前景的癌癥化學性預(yù)防藥物，有研究報道［1-4］，十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽對嚙齒類動物肝癌、乳腺癌等有明顯的阻斷作用；同時根據(jù)流行病學資料顯示，攝入膳食異硫氰酸鹽的確降低人患癌癥的風險.雖然異硫氰酸鹽的結(jié)構(gòu)并不一致，但其對腫瘤細胞的抑制作用的機理卻大致相同，目前文獻中普遍認同以下兩方面作用［5-7］，即異硫氰酸鹽可通過抑制激活致癌因子的Ⅰ相酶和誘導Ⅱ相解毒酶防止基因損傷；其次通過促進細胞凋亡和對細胞生長周期的阻礙，從而抑制癌細胞的生長［8］，然而其化學性預(yù)防功能的確切機制還沒有得到充分的了解.

本研究將選取鼻咽癌細胞，采用不同濃度的PEITC進行處理，用MTT法檢測PEITC對人鼻咽癌細胞株的生長抑制作用及正常鼻咽部上皮細胞的毒性；Annexin-V/PI試劑盒檢測腫瘤細胞凋亡；用DCFH-DA探針以及Rhodamine 123測試劑盒檢測細胞內(nèi)活性氧水平及線粒體膜電位；同時用NAC預(yù)處理各組腫瘤細胞，檢測其活性氧水平及線粒體膜電位的變化以揭示PEITC抗腫瘤作用機制，從而為抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)提供指導.

1　材料與方法

1.1細胞

人鼻咽癌細胞株CNE-1（高分化）、CNE-2（低分化）、正常人鼻咽部上皮細胞NP-69.由本實驗室傳代保種.

1.2藥品與儀器

PEITC（購自美國Sigma-aldrich公司，純度≥99%，用DMSO溶解至終濃度為100 mg·ml-1，4℃保存?zhèn)溆茫?，NAC（N-乙酰半胱氨酸，Sigma公司產(chǎn)品），MTT（噻唑藍，Sigma公司產(chǎn)品），DCFH-DA（2′-7′二氯熒光黃雙乙酸鹽，Sigma公司產(chǎn)品），RPMI-1640培養(yǎng)液、新生牛血清（Gibco公司產(chǎn)品）；其余試劑為分析純；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒（KeyGene公司產(chǎn)品，中國南京），Rhodamine 123檢測試劑盒（KeyGene公司產(chǎn)品，中國南京）；流式細胞儀FC 500 MCL（Beckman Coulter公司，美國）.

1.3細胞培養(yǎng)

鼻咽癌CNE-1/2細胞由本實驗室傳代保種，用內(nèi)含10%新生牛血清、200 U/mL青霉素、200μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；正常鼻咽部上皮細胞NP-69采用200 U/mL青霉素、200μg/mL鏈霉素的Keratinocyte-SFM培養(yǎng)液（含EGF、PBE），置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).

2　實驗方法

2.1MTT法檢測PEITC對鼻咽癌細胞生長抑制作用

將處于對數(shù)生長期的CNE-1、CNE-2、NP-69細胞接種于96孔板，5×103個細胞/孔，在37℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別加入不同濃度的PEITC（終濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mg·ml-1）培養(yǎng)液；另設(shè)細胞對照組（只加細胞+DMSO不加藥）.每組劑量設(shè)6個復孔，每孔總體積為200 uL.分別培養(yǎng)24、48、72、96h，每孔加20 μL的MTT溶液（5mg /mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，加入DMSO 150μL/孔，振搖5 min，于570 nm波長處測定吸光度（A）值，計算細胞生長抑制率，Bliss法計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值.實驗重復3次.細胞生長抑制率= 1-A給藥組/A對照組×100%

2.2Annexin-V/PI凋亡試劑盒檢測PEITC對鼻咽癌細胞凋亡率

Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，能夠在Ca2+存在的情況下，與細胞表面外膜的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而磷脂酰絲氨酸暴露在細胞膜外是細胞凋亡的早期事件，PI是一種DNA染料，當細胞凋亡的晚期，細胞的細胞膜通透性增加，PI從而進入細胞核與DNA結(jié)合，通過Annexin-V/PI雙色標記可以檢測細胞凋亡.將對數(shù)生長期的CNE-1、CNE-2細胞以每孔5×105個的密度接種到6孔板中，加不同濃度（5.0，10.0 mg·ml-1）的PEITC，設(shè)立對照，培養(yǎng)24 h后，收集各處理組細胞，以PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，并加入Annexin-V和PI染液各5μL，輕輕混勻，置冰上避光反應(yīng)15 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率.

2.3線粒體活性氧檢測

DCFH-DA探針可穿過細胞膜被酯酶水解生成DCFH.細胞內(nèi)的活性氧可以將無熒光的DCFH轉(zhuǎn)化為有熒光的DCF.因此，DCF的熒光強度可以反映細胞內(nèi)活性氧的水平.取5×105個對數(shù)生長期CNE-1、CNE-2細胞接種于6孔板，設(shè)立對照，加入10.0 mg·ml-1的PEITC分別作用6、12h后收集細胞，1500 r·min-1離心5 min，用PBS洗3次后重懸，加入DCFH-DA熒光探針，室溫下避光染色30 min，離心棄去上清，用PBS洗2遍，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平的變化.

2.4線粒體膜電位的檢測

采用Rhodamine-123試劑盒測定線粒體膜電位，Rhodamine-123是一種可以通透細胞膜的選擇性染色活細胞線粒體的熒光染料，可以快速通過細胞膜，僅需幾分鐘就可以被具有活性的線粒體所俘獲，并且對細胞沒有任何毒性.其熒光強度與膜電位相關(guān)，測定熒光強度即可得到膜電位.取5×105個對數(shù)生長期CNE-1、CNE-2細胞接種于6孔板，設(shè)立對照，加入10.0 mg·ml-1的PEITC分別作用24 h后收集細胞，1500 r·min-1離心5 min，用PBS洗3次后重懸，加入20μl Rhodamine-123避光染色（終濃度5mg/ml），37℃避光孵育30分鐘，棄去上清液，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位的變化.

2.5NAC對PEITC對CNE-1、CNE-2細胞凋亡的阻斷作用

NAC是一種強大的抗氧化劑，能夠阻斷氧化還原反應(yīng).將對數(shù)生長期的CNE-1、CNE-2細胞以每孔5×105個的密度接種到6孔板中，分別用10.0 mg·ml-1的PEITC以及10.0 mg·ml-1PEITC+NAC與CNE-1、CNE-2培養(yǎng)24 h，并設(shè)立對照，收集各處理組細胞，以PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，并加入Annexin-V和PI染液各5μL，輕輕混勻，置冰上避光反應(yīng)15 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率.

2.6統(tǒng)計處理

數(shù)據(jù)用x±s表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 10. 0進行數(shù)據(jù)處理，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗或秩和檢驗.

3　實驗結(jié)果

3.1MTT檢測PEITC對CNE-1、CNE-2細胞生長抑制

由細胞生長抑制率可見，CNE-1、CNE-2、NP-69細胞經(jīng)不同濃度的PEITC處理后，呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性，隨時間延長和劑量增加細胞數(shù)明顯減少（圖1A-1C），并且各組中相對CNE-1而言，CNE-2隨PEITC濃度增加和時間延長更敏感，而對NP-69細胞組細胞毒性較低（圖1C）.當加入10.0 mg·ml-1

PEITC（圖1D）在96 h時間點NP-69細胞組IC50（12.62±0.52）與CNE-1組（3.57±0.34）、CNE-2細胞組IC50（2.64±0.20）差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.

圖1 MTT檢測PEITC對CNE-1、CNE-2細胞生長抑制

3.2Annexin V/PI染色后流式檢測PEITC誘導細胞凋亡

Annexin V/PI染色后流式可檢測出不同細胞群即：正常細胞群、凋亡細胞群和壞死細胞群. PEITC作用24 h后，誘導細胞發(fā)生凋亡（圖2），CNE-1（圖2A-2C）、CNE-2（圖2E-2G）隨著PEITC濃度（0、5.0，10.0 mg·ml-1）的增加，細胞凋亡率也增加；當PEITC 10.0 mg·ml-1濃度時，CNE-1（圖2D）、CNE-2（圖2H）其凋亡率與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.

圖2 Annexin V/PI染色后流式檢測PEITC誘導細胞凋亡

3.3PEITC對細胞活性氧的影響

DCFH-DA探針標記后流式檢測結(jié)果如下圖3，當加入10.0 mg·ml-1的PEITC分別作用0、6、12h后流式檢測CNE-1（圖3A-3C）、CNE-2（圖3E-3G）顯示：CNE-1（圖3D）、CNE-2（圖3H）活性氧水平分別在6、12h時間點與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.

圖3 PEITC對細胞活性氧的影響

3.4 PEITC降低細胞線粒體膜電位檢測

Rhodamine-123試劑盒測定線粒體膜電位如圖4：當加入不同濃度（0、10.0 mg·ml-1）的PEITC作用24 h后流式檢測CNE-1（圖4A-4B）、CNE-2（圖4D-4E）顯示：加入10.0 mg·ml-1濃度PEITC時CNE-1（圖4C）、CNE-2（圖4F）線粒體膜電位在24 h時間點與對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）.

圖4 PEITC降低細胞線粒體膜電位檢測

3.5NAC對CNE-1、CNE-2細胞凋亡的阻斷作用檢測

分別加入10.0 mg·ml-1PEITC以及10.0 mg·ml-1PEITC+NAC與CNE-1、CNE-2培養(yǎng)24 h后，Annexin V/PI染色流式檢測結(jié)果如圖5：CNE-1（圖5A-5D）、CNE-2（圖5F-5I）分別代表對照組、10.0 mg·ml-1PEITC組、NAC組、10.0 mg·ml-1PEITC+NAC組流式檢測結(jié)果，由圖5E、圖5J顯示，10.0 mg·ml-1PEITC+ NAC組與10.0 mg·ml-1PEITC組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而10.0 mg·ml-1PEITC+NAC組與對照組、NAC組差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）.

圖5 NAC對CNE-1、CNE-2細胞凋亡的阻斷作用檢測

4　討論

近幾十年來，腫瘤作為一種涉及到多基因，多步驟的疾病，在國內(nèi)外引起了廣泛的重視.盡管近年來在腫瘤的預(yù)防與治療上取得了較大的成就，但是惡性腫瘤所引起的死亡率依然居高不下，因此提高腫瘤的治愈率及減少惡性腫瘤所引起的死亡率仍然任重道遠，其預(yù)防和治療一直是醫(yī)療科研界一個未能攻克的難題，微創(chuàng)治療和靶向藥物治療是腫瘤治療的發(fā)展趨勢，開發(fā)高效低毒的靶向抗腫瘤藥物將具有廣泛的市場前景.而近年來隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在日?？墒秤玫闹参镏屑春卸喾N抗腫瘤活性成分，比如葡萄中含有的漆樹黃酮，綠茶當中含有的茶多酚，蜂蜜當中含有的酶，十字花科植物如花椰菜中含有的異硫氫酸鹽等等.由于這些抗腫瘤活性成分的提取物大多來自于日常所食用的蔬菜，所以目前的基礎(chǔ)研究顯示這些成分相對于腫瘤細胞而言，對正常細胞表現(xiàn)出較低的毒性，從而使得這一領(lǐng)域成為目前研究的熱點.盡管目前有越來越多的來自于光化學植物的抗腫瘤活性成分被報道，但是受原料來源，合成技術(shù)要求以及抗腫瘤效果的限制，目前僅有少量抗腫瘤活性成分在進行深入的研究，來自于花椰菜的異硫氫酸鹽就是其中的典型的代表.多年累積的研究表明，異硫氫酸鹽在體內(nèi)外對人多種腫瘤具有抗腫瘤活性，而對正常細胞卻無明顯毒性，機制研究表明異硫氰酸鹽主要通過降低腫瘤細胞內(nèi)的谷胱甘肽來誘導氧化還原失衡從而發(fā)揮抗腫瘤作用.而考慮到相對于人正常細胞而言腫瘤細胞中所普遍存在的氧化還原失衡現(xiàn)象，這也不難解釋異硫氰酸鹽所具有的廣譜抗腫瘤作用.正是由于其獨特的作用機理以及高效低毒等特點，對異硫氫酸鹽抗腫瘤的研究在美國目前已進入一期臨床試驗，初步試驗結(jié)果令人鼓舞，同時目前國內(nèi)外也有研究人員開始對異硫氫酸鹽化合物進行結(jié)構(gòu)改造與化學合成，從而獲得抗腫瘤活性更強的異硫氫酸鹽化合物，這些研究都表明以來自于十字花科植物的抗腫瘤活性成分如異硫氫酸鹽為先導化合物在抗腫瘤藥物研發(fā)當中所具有的優(yōu)勢與潛力.美國抗癌協(xié)會報道：研究人員從大白菜和花椰菜等十字花科類蔬菜中提取的芳香異硫氰酸和乙硫酚酮成分，具有明顯的抗癌作用.據(jù)統(tǒng)計常吃花椰菜能夠減少前列腺癌的發(fā)生率，其具有明顯預(yù)防前列腺癌的作用，每天吃花椰菜一次的男性被調(diào)查者相比每周吃不到花椰菜者，可能被診斷患有侵潤性前列腺癌的風險減少52%，日本癌癥研究所通過對40多種蔬菜成分分析及抑制癌細胞生長試驗，花椰菜對癌癥抑制率達92.8%.

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部最常見惡性腫瘤，目前認為本病發(fā)生與遺傳易感性、環(huán)境因素和EB病毒（EBV）感染作用有關(guān).鼻咽癌是腫瘤研究的一個很好的模型，因為它是一種典型的、發(fā)病因素比較明確的、“遺傳－環(huán)境－病毒”三大類因素交互作用而形成的惡性腫瘤.因此本研究選取鼻咽癌細胞作為研究對象，力求進一步揭開PEITC抗腫瘤機制的神秘面紗.本研究結(jié)果顯示，PEITC對NPC細胞高、低分化均具有誘導凋亡作用，而且具有時間-劑量依賴關(guān)系，隨時間、劑量增加，凋亡作用增強，并且對低分化腫瘤細胞凋亡作用更加強烈，而對正常的鼻咽部上皮細胞毒性較低，變化較小，顯示了其抗腫瘤作用及低毒副作用；同時通過PEITC對NPC高、低分化細胞活性氧及線粒體膜電位檢測及NAC阻斷作用后相關(guān)指標的檢測，結(jié)果顯示PEITC抗腫瘤作用機制可能與降低了氧化還原水平，干擾了線粒體功能有關(guān)，本研究將進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達及其關(guān)系，從而進一步揭示其誘導鼻咽癌細胞凋亡的機制，為腫瘤的預(yù)防和治療提供實驗基礎(chǔ).

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（責任編輯：徐杰）

Role and Mechanism of Phenethyl Isothiocyanate on Apoptosis of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE- 1/2

ZHANG Gongxue1，WANG Minghua1，LI Daokun2
（1.The First People's Hospital of Zaoyang City Affiliated to Hubei University of Arts and Science，Zaoyang 441200，China；2. Molecular Medicine Center，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

Abstract:Objective∶to investigate the effect and mechanism of phenethyl isothiocyanate（PEITC）on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma CNE-1/2 cell，and the influence of the toxic effects of normal nasopharyngeal epithelial cells，to discuss its antitumor mechanism. Methods∶determination of PEITC CNE-1/2 cell growth inhibition by MTT method；detection of PEITC on CNE-1/2 cell apoptosis and the influence of oxidation reduction level by flow cytometry instrument；the change of oxidation reduction level after NAC is blocked. Results∶PEITC can inhibit the growth of CNE- 1/2 cell∶with the time extension and the dose increase，tumor cells significantly reduced，CNE-2 apoptosis effect become more apparent，with low cytotoxicity to NP - 69 cell group. After treated 96 h with 10.0 mg. ml -1 PEITC，the IC50（12.62±0.52）of NP - 69 cell group，the IC50（3.57±0.34）of CNE-1 group，the IC50（2.64±0.20）of CNE-2 cell groups are statistically significant different（P＜0.01）；Annexin V/PI staining flow detection PEITC effect after 24 h after cells apoptosis，as PEITC concentration（0，5.0，10.0 mg. ml-1）increased，cell apoptosis rate increased；When PEITC 10.0 mg. ml-1concentration，CNE-1/2 apoptosis rate and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；DCFH - DA probe results showed that current detecting reactive oxygen levels，respectively at 6 and 12 h time points and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；Rhodamine-123 kit determination of mitochondrial membrane potential shows that∶when the concentration of 10.0 mg. ml-1，CNE - 1/2 of mitochondrial membrane potential in 24 h time point and the control group differences statistically significant（P＜0.01）；With NAC pretreatment groups of cells after testing reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential in reverse. Conclusion∶PEITC can inhibit the growth of nasopharyngeal carcinoma CNE-1/2 cells，has low toxicity to the cells of NP - 69 at the same time，its antitumor effect may be related to interference intracellular REDOX reaction，induction of apoptosis.

Key words:Phenethyl isothiocyanate；Nasopharyngeal carcinoma；Apoptosis

中圖分類號：R361.3

文獻標志碼：A

文章編號：2095-4476（2016）05-0078-07

收稿日期：2016-03-14；

修訂日期：2016-05-09

基金項目：襄陽市科技局項目（襄科業(yè)［2013］66號）

作者簡介：張功學（1970—），男，湖北襄陽人，湖北文理學院附屬棗陽醫(yī)院病理科主任醫(yī)師.

*通訊作者