單管多重RT-PCR檢測腸道病毒核酸及其臨床應用

龍　輝，謝建紅

(1.廣東省清遠市婦幼保健院　511500；2.廣東省珠海市婦幼保健院　519000)

·論著·

單管多重RT-PCR檢測腸道病毒核酸及其臨床應用

龍輝1，謝建紅2

(1.廣東省清遠市婦幼保健院511500；2.廣東省珠海市婦幼保健院519000)

摘要:目的建立一種快速檢測腸道病毒通用型(EV)、科薩奇病毒A16(CA16)和腸道病毒71(EV71)核酸的單管多重反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，并探討其臨床應用價值。方法建立單管多重RT-PCR檢測EV、CA16和EV71的反應體系，并優(yōu)化退火溫度、各引物比例和循環(huán)參數等反應條件；采用自建RT-PCR體系檢測136例手足口病患兒大便標本的腸道病毒核酸。結果單管多重RT-PCR檢測體系的最佳反應條件：退火溫度為54 ℃；EV、CA16和EV71引物比例為2∶1∶1；循環(huán)參數為35。采用自建單管多重RT-PCR從136例標本中檢出EV陽性46例(33.82%)，CA16陽性14例(10.29%)，EV71陽性14例(10.29%)，其中CA16、EV71同時陽性2例。結論成功建立檢測EV、CA16和EV71核酸的單管多重RT-PCR，并應用于手足口病患兒的病原學檢測。

關鍵詞:反轉錄聚合酶鏈反應；手足口病；腸道病毒；核酸

手足口病(HFMD)是由腸道病毒(EV)引起的常見傳染病，致病病原以柯薩奇病毒A組16型(CA16)和腸道病毒71型(EV71)多見[1]。以嬰幼兒發(fā)病為主，近年來呈現暴發(fā)流行的趨勢，嚴重影響嬰幼兒的生活及學習，成為影響社會穩(wěn)定的公共衛(wèi)生問題。尤其是2008年3月在安徽阜陽暴發(fā)的手足口疫情，出現了部分死亡病例，從而引起了全社會的廣泛關注[2]。如何對HFMD的病原進行快速檢測，對HFMD的早期診斷、治療和預后觀察顯得尤為重要。本研究旨在建立一種簡便、快速檢測EV核酸的單管多重反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)，為HFMD的早期診斷及治療提供病原學依據，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2014年6月至2015年3月清遠市婦幼保健院兒科收治的136例疑診HFMD患兒的糞便標本，所有標本置-40 ℃保存待檢。其中男74例，女62例，年齡6個月至11歲，平均3歲零2個月。HFMD參照原衛(wèi)生部頒布的《HFMD診療指南(2010年版)》診斷標準[3]。

1.2試劑與儀器柱式病毒RNA提取試劑購自北京天恩澤基因科技有限公司，one-step RT-PCR試劑盒為Takara寶生物(大連)公司產品，采用珠海黑馬9600型PCR儀進行檢測。

1.3方法

1.3.1RNA提取先用生理鹽水將大便標本進行重懸，取0.2 mL重懸液至1.5 mL潔凈離心管中，嚴格按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA。提取后的RNA可直接用于RT-PCR或-80 ℃保存。

1.3.2EV通用型(以下簡稱EV)、CA16和EV71單重RT-PCR退火溫度選擇分別對EV、CA16和EV71單重RT-PCR采用梯度PCR進行退火溫度摸索，溫度選擇47～63 ℃。采用Primer 5.0軟件設計各引物序列，交由Takara寶生物(大連)公司合成，引物序列見表1。 以實時熒光RT-PCR 檢測EV、CA16和EV71三者均為陽性的RNA作為RT-PCR反應的模板。RT-PCR反應條件為：50 ℃反轉錄反應30 min，94 ℃預變性2 min后，94 ℃ 30 s，梯度PCR退火溫度47～63 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀對結果進行分析。

1.3.3EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR退火溫度確定在確定各單重RT-PCR退火溫度后，選擇EV、CA16和EV71三者均能擴增出產物的溫度范圍作為單管多重RT-PCR退火溫度摸索條件，從而選擇最佳退火溫度。

表1　　EV、CA16和EV71 RT-PCR引物序列

1.3.4單管多重RT-PCR按正交設計方法摸索EV、CA16和EV71各引物比例分別以EV、CA16和EV71引物(濃度為10 μmol/L)體積0.5、1.0 、1.5和2.0 μL作為引物比例摸索條件來選擇單管多重RT-PCR最佳引物比例。

1.3.5單管多重RT-PCR循環(huán)參數以25、30、35和40循環(huán)數進行單管多重RT-PCR來選擇最佳循環(huán)參數。

1.3.6單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸對單管多重RT-PCR各反應參數進行優(yōu)化后，建立最佳反應體系用于臨床標本檢測。將136例診斷為HFMD患兒的大便標本提取RNA后，采用單管多重RT-PCR同時檢測EV、CVA16和EV71，從而分析HFMD患兒EV感染情況。結果判斷標準見表2。

表2　　單管多重RT-PCR檢測結果解釋

注：(+)表示陽性，(-)表示陰性。

2結果

2.1EV、CA16和EV71各單重RT-PCR退火溫度EV在溫度為47～62 ℃時均能擴增出產物，表明其退火溫度范圍較寬。CA16在48～54 ℃能擴增出產物，而在57～63 ℃未見擴增產物，由此說明CA16的退火溫度為48～54 ℃。雖然EV71在47～62 ℃均能擴增出產物，但在47～49 ℃出現非特異性條帶，說明該退火溫度范圍過低，因此EV71適宜的退火溫度為50～62 ℃。綜合三者單重RT-PCR的退火溫度，選擇49～55 ℃作為三者單管多重RT-PCR退火溫度摸索的范圍。EV、CA16和EV71單重梯度RT-PCR結果見圖1。

注：EV和EV71的01～06溫度范圍為47～62 ℃。CA16的01～06溫度范圍為48～63 ℃，07為內對照，M為DNAMaker DL500。

圖1EV、CVA16和EV71單重RT-PCR

各退火溫度范圍

2.2EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR退火溫度三者在49～55 ℃均能擴增出產物(圖2)，根據三者產物條帶灰度的強弱選擇54 ℃作為EV、CA16和EV71單管多重RT-PCR最適退火溫度。

注：01為49.4 ℃，02為50.4℃，03為51.6 ℃，04為52.9 ℃，05為54.2 ℃，06為55.0 ℃，M為DL500。

圖2單管多重RT-PCR 退火溫度

2.3單管多重RT-PCR EV、CA16和EV71各引物劑量見表3。 通過對各引物比例條件的摸索，根據不同引物比例產物灰度的強弱(圖3)，選擇EV∶CA16∶EV71=2∶1∶1為單管多重RT-PCR為最佳引物比例條件。

圖3　單管多重RT-PCR EV、CA16和EV71

表3　　單管多重RT-PCR檢測EV核酸引物劑量(μL)

2.4單管多重RT-PCR循環(huán)參數見圖4。25循環(huán)時無擴增產物，30循環(huán)時產物條帶較暗，說明產物量較少，40循環(huán)時已至PCR擴增的平臺期，因此選擇35循環(huán)作為單管多重RT-PCR的循環(huán)參數。

注：01為25循環(huán)參數，02為30循環(huán)參數，03為35循環(huán)參數，04為40循環(huán)參數。

圖4單管多重RT-PCR不同循環(huán)參數

2.5單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸見圖5。在136例大便標本中檢出EV陽性46例(33.82%)，CA16陽性14例(10.29%)，EV71陽性 14例(10.29%)，其中CA16、EV同時陽性2例。

圖5　　單管多重RT-PCR檢測HFMD患兒EV核酸

3討論

HFMD是由多種人EV引起的一種嬰幼兒常見的傳染病，大多數患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，其中以EV71和CA16感染較常見[4]。特別是EV71可出現無菌性腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎等中樞神經系統(tǒng)病變，嚴重者可致死亡[5-6]。HFMD是一種可預防、可治愈的疾病，主要應于早期診斷、早期隔離、早期治療。因而對HFMD病原學進行快速檢測，為HFMD提供早期診斷依據顯得尤為重要。目前HFMD診斷以臨床表現為主要手段，傳統(tǒng)的實驗室診斷方法有病毒分離、中和試驗和ELISA等[7]。病毒分離時間長，操作繁瑣。血清中和試驗和ELISA用于疾病早期診斷靈敏度不高。通過檢測EV核酸則能更快速、更特異地對HFMD進行診斷[8]。常用于EV核酸檢測的方法有RT-PCR和實時熒光RT-PCR等，雖然實時熒光RT-PCR檢測時間短，操作簡便，但由于其要使用熒光探針，且不能用單管多重的方法同時檢測EV、CA16和EV71，因而檢測成本較高，增加了患者的經濟負擔[9]。為了提高檢測EV核酸的靈敏度，有研究者采用互補鎖定引物技術RT-PCR和反轉錄環(huán)介導等溫擴增法等方法來提高檢測的靈敏度，但是這些方法技術難度大，應用成本更高[10-11]。為了建立一種更簡便快速、經濟的方法，本研究將EV、CA16和EV71 3種引物加入同一管中，對各反應條件進行優(yōu)化，采用單管多重RT-PCR同時對EV、CA16和EV71進行檢測。

分別對單管多重RT-PCR的退火溫度、各引物的比例及循環(huán)參數等條件進行優(yōu)化，其退火溫度為54 ℃，EV、CA16和EV71的引物比例為2∶1∶1，循環(huán)參數為35，成功建立用于EV核酸檢測的單管多重RT-PCR。并對136例HFMD患兒臨床標本進行檢測，EV陽性率為33.82%，CA16陽性率為10.29%，EV71陽性率為10.29%，由此表明在HFMD患兒中CA16和EV71均有感染，為HFMD的診斷、治療及預后觀察提供了指導作用。為使單管多重RT-PCR能更好地應用于臨床，需要對單管多重RT-PCR進行方法學評價，包括特異性、靈敏度及與其他方法進行比較，這是本研究下一步將要解決的問題。

HFMD已在世界范圍內流行，常成暴發(fā)趨勢，可致嚴重的并發(fā)癥甚至死亡，在我國已列為丙類傳染病，因而實驗室檢查對HFMD的早期診斷有重要意義。本研究所建立的單管多重RT-PCR更能簡便快速、經濟有效地在各基層單位應用于HFMD的病原體檢測[12]。

參考文獻

[1]王學東，孫愛霞，孟衛(wèi)東，等．人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型的現況研究[J]．醫(yī)學檢驗與臨床，2015，26(1)：54-57．

[2]萬俊峰，朱理業(yè)，劉紅，等．阜陽市手足口病(EV71感染)疫情流行病學分析[J]．安徽醫(yī)學，2008，6(4)：268-269．

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部．手足口病診療指南(2010版)[J]．中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志，2012，19(19)：9-11．

[4]孫寶昌，朱傳新，陳俐麗，等．健康人群EV71、CA16及其他腸道病毒攜帶率調查[J]．浙江預防醫(yī)學，2015，27(6)：585-587．

[5]Chen SC,Chang HL,Yan TR,et al.An eight-year study of epidemiologic features of enterovirus 71 infection in Taiwan[J].Am J Trop Med Hyg,2007,77(1):188-191.

[6]郭靖．重癥腸道病毒71型感染手足口病研究進展[J]．中國藥業(yè)，2015，24(5)：4-6．

[7] Hong J,Kang B,Kim A,et al.Enhanced detection of enteroviruses in clinical samples by reverse transcription-PCR using complementary locked primer technology[J].J Clin Microbiol,2010,48(2):615-616.

[8]王曉．手足口病常見病原體的核酸檢測技術研究進展[J]．華夏醫(yī)學，2014，27(6)：162-165．

[9]呂厚明，房本蘭，姜亞楠．手足口病不同核酸檢測方法敏感性比較[J]．醫(yī)藥與保健，2015，23(2)：91-92．

[10]Arita M,Ling H,Yan DM,et al.Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system for a highly sensitive detection of enterovirus in the stool samples of acute flaccid paralysis cases[J].BMC Infect Dis,2009,9(1):1-10.

[11]戴光躍．腸道病毒核酸檢測在兒童手足口病診斷應用價值[J]．世界最新醫(yī)學信息文摘，2015，15(27)：172-173．

[12]樊旭成，張凱倫，楊璐鷺．IQTM5多重實時熒光定量PCR儀快速檢測腸道病毒RNA及其臨床意義[J]．醫(yī)學信息(上旬刊)，2011，24(12)：216-217．

Development and application of single-tube multiplex RT-PCR for detecting enterovirus RNA

LONGHui1,XIEJianhong2

(1.MaternalandChildHealthHospitalofQingyuan,Qingyuan,Guangdong511500,China;2.MaternalandChildHealthHospitalofZhuhai,Zhuhai,Guangdong519000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a rapid single-tube multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for rapid detection of enterovirus RNA including universal enterovirus (EV),coxsachievirus A-16 (CA16) and enterovirus 71 (EV71) and to evaluate the clinical value of this method.MethodsThe reaction conditions of single-tube multiplex RT-PCR were optimized systematically including annealing temperature,the proportion of three groups of primers and the cycle parameter.After the optimal conditions were determined,single-tube multiplex RT-PCR was used to test enterovirus RNA extracted from stool samples of 136 children diagnosed as hand-foot and mouth disease (HFMD).ResultsThe optimal reaction conditions were as follow:annealing temperature was 54 ℃,the proportion of EV,CA16 and EV71 primers corresponded to 2∶1∶1 and the cycle parameter was 35.Out of 136 samples analyzed by single-tube multiplex RT-PCR,46 samples were identified as positive for EV (33.82%),14 samples were identified as positive for CA16 (10.29%) and 14 samples were identified as positive for EV71 (10.29%),among which two samples were identified as positive for both CA16 and EV 71.ConclusionThe single-tube multiplex RT-PCR assay for detecting enterovirus RNA is successfully established and can be applied to provide etiological evidence for HFMD.

Key words:reverse transcription polymerase chain reaction;hand-foot and mouth disease;enterovirus;nucleotide

作者簡介：龍輝，男，副主任技師，主要從事醫(yī)學檢驗研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.019

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1497-04

(收稿日期：2016-01-18修回日期：2016-02-25)