高危型人乳頭瘤病毒感染與microRNA-155在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織和血清中的表達(dá)及意義

陳瑞萍 麥振聲 徐建平

微小RNAs(MicroRNA，miRNA)是一種廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼RNA，它參與了機(jī)體的多種病理生理過程，比如細(xì)胞的分化、增殖及凋亡，甚至參與腫瘤的形成及發(fā)展[1]。其中miRNA-155被發(fā)現(xiàn)在多種實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)升高[2]，因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為miRNA-155是一種致癌的miRNA。目前，已經(jīng)明確高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)的持續(xù)感染是宮頸鱗狀細(xì)胞癌的直接原因，但HR-HPV是如何誘導(dǎo)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生仍不是十分清楚。本研究通過檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者HR-HPV的感染狀態(tài)及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織和血清中miRNA-155的表達(dá)，從而分析HR-HPV感染對(duì)miRNA-155在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及血清中表達(dá)的影響，并探討其臨床意義。

資料和方法

一、標(biāo)本收集

收集在暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科經(jīng)病理診斷明確的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本37例為研究組，標(biāo)本獲取前均未進(jìn)行放療、化療以及其它治療。依據(jù)2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)宮頸癌的分期，研究組包括IA1期3例， IA2期5例， IB1期12例，ⅡA1期17例。研究組年齡39～61歲，平均年齡(50.3±7.4)歲。另選擇同期因子宮肌瘤行全子宮切除的患者20例作為對(duì)照組，對(duì)照組年齡43～50歲，平均年齡(45.4±3.6)歲。對(duì)照組患者術(shù)前均行子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查排除子宮頸病變。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，臨床及病理資料完整。

二、主要方法

1.子宮頸脫落細(xì)胞收集及HPV檢測(cè)

應(yīng)用HPV采樣刷于子宮頸口處采集子宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，將采樣刷置入裝有專用細(xì)胞保存液的取樣管中，-20℃保存。采用導(dǎo)流雜交法檢測(cè)HPV感染的基因型，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作(人乳頭瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱普公司)。

2.子宮頸組織及血清標(biāo)本收集

研究組通過宮頸錐切、廣泛性全子宮切除后獲取子宮頸組織標(biāo)本，對(duì)照組通過子宮全切后獲取子宮頸組織標(biāo)本。全部的子宮頸組織標(biāo)本用0.9%滅菌生理鹽水沖洗3次后，將其置于2mL凍存管中，-80℃保存。全部研究對(duì)象在術(shù)前1天采集外周血3mL，分離血清后標(biāo)本存于1.5mLEP管中，-80℃保存。

3.子宮頸組織和血清中RNA的提取

子宮頸組織及血清中RNA的提取采用RNA提取試劑盒(中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，所有步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。全部RNA提取后在分光光度儀下確定總RNA的濃度及純度，根據(jù)RNA濃度調(diào)整逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的用量。

4.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

MiRNA-155莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物5’-GTCGCATTCGATGTTGTCCACTGTCTCTGATCCCTAGCGTCATCGAATGCGACACCCCT-3’，U6莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，均由中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為26 ℃ 30min，42 ℃ 3min， 85 ℃ 5 min。內(nèi)參U6反應(yīng)條件同上。逆轉(zhuǎn)錄后將cDNA產(chǎn)物立即取出快速置冰上冷卻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中miRNA-155逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用無RNA酶水稀釋2倍。

5.實(shí)時(shí)熒光定量

PCR引物由中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，miRNA-155上游引物為：5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，下游引物為：5’-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTCTG-3’，U6上游引物為:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物為:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3’。應(yīng)用中國(guó)上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司SYBER Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。反應(yīng)采用20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為，95 ℃ 3 min；95 ℃ 12 s ；62 ℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參U6反應(yīng)條件同上。以生理鹽水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為陰性對(duì)照。設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴(kuò)增和引物二聚體的出現(xiàn)。反應(yīng)設(shè)兩個(gè)復(fù)孔。

三、結(jié)果判斷

以U6 snRNA為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，利用2-△△Ct法計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)量。研究組中miRNA-155相對(duì)表達(dá)比值=2-△△Ct，

△△Ct=(CtmiRNA-155-CtU6)研究組-(CtmiRNA-155-CtU6)對(duì)照組。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件，故以中位數(shù)( P25，P75) 表示。兩組間HR-HPV陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組間miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組HR-HPV檢測(cè)

研究組HR-HPV感染率明顯高于對(duì)照組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2= 19.64，P<0.01),見表1。

二、兩組宮頸組織與血清中miRNA-155的表達(dá)

研究組宮頸組織中miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是對(duì)照組的2.64倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.20，P<0.05)(圖1)。研究組血清中miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是對(duì)照組的12.73倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.75，P<0.05)(圖2)。對(duì)照組中1例HR-HPV陽性病例的miRNA-155相對(duì)表達(dá)量為0.27，對(duì)照組miRNA-155相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)0.15(0.07～0.21)。

表1 研究組與對(duì)照組HR-HPV感染率比較

圖1 研究組和對(duì)照組宮頸組織中miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量

圖3 研究組中HR-HPV陽性組與HR-HPV陰性組miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量

三、研究組中HR-HPV陽性組和HR-HPV陰性組miRNA-155的表達(dá)

依據(jù)是否感染HR-HPV將研究組分為HR-HPV陽性組和HR-HPV陰性組進(jìn)行組內(nèi)比較。HR-HPV陽性組宮頸組織miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是HR-HPV陰性組的3.75倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.26，P<0.05)(圖3)。

四、研究組HR-HPV陰性組和對(duì)照組中HR-HPV陰性組miRNA-155的表達(dá)

將研究組(11例)與對(duì)照組中HR-HPV陰性組(19例)進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)研究組HR-HPV陰性組宮頸組織miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是對(duì)照組HR-HPV陰性組的2.72倍(圖4)。

圖4 研究組HR-HPV陰性組與對(duì)照組中HR-HPV陰性組miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量

討 論

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，死亡率位居?jì)D科惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅女性健康。研究表明，HR-HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組中HR-HPV感染率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，這與已有研究一致。然而，宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素多環(huán)節(jié)的過程。miRNA是一種廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源非編碼RNA。成熟miRNA由19-25個(gè)核苷酸組成。它通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與目標(biāo)miRNA相結(jié)合，從而起到轉(zhuǎn)錄后抑制的作用[1]。miRNA參與了機(jī)體多種病理生理過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，細(xì)胞凋亡甚至腫瘤的形成及發(fā)展。Ovcharenko等[4]研究顯示，miRNA-155是一種凋亡抑制基因，其作用機(jī)制可能是通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性從而發(fā)揮抗凋亡的作用。在肺癌，乳腺癌，胃癌等多種實(shí)體腫瘤組織中都能發(fā)現(xiàn)miRNA-155表達(dá)升高[2]。因此，miRNA-155被認(rèn)為是一種致癌的miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中HPV陰性組miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是正常宮頸組織(對(duì)照組HR-HPV陰性)的2.72倍，兩組相比有顯著性差異(P<0.05)。根據(jù)Ovcharenko的研究，miRNA-155表達(dá)上調(diào)可能抑制caspase-3的活性，使得凋亡減少，從而在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗狀細(xì)胞癌HR-HPV陽性組宮頸組織中miRNA-155的相對(duì)表達(dá)比值是宮頸鱗狀細(xì)胞癌HR-HPV陰性組的3.75倍，提示宮頸組織感染HR-HPV與miRNA-155的表達(dá)相關(guān)。研究表明[5]，HPV感染機(jī)體后，可整合到機(jī)體細(xì)胞基因組中，其脆性位點(diǎn)往往是HPV整合到細(xì)胞基因組的理想位置，HPV基因整合到脆性位點(diǎn)后，可能影響其附近的miRNA的表達(dá)。據(jù)此我們認(rèn)為，當(dāng)HR-HPV持續(xù)感染宮頸上皮細(xì)胞，其中一部分HR-HPV可能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，可導(dǎo)致miRNA-155的表達(dá)發(fā)生變化，而miRNA-155作為一種致癌的miRNA，可使宮頸上皮細(xì)胞的增殖周期失調(diào)，出現(xiàn)凋亡減少，從而參與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。

目前，鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)被認(rèn)為是宮頸鱗狀細(xì)胞癌最常用的標(biāo)志物，但在食道癌，肺癌等鱗狀細(xì)胞腫瘤、甚至在皮膚病，呼吸系統(tǒng)疾病等非腫瘤疾病中，同樣能發(fā)現(xiàn)其表達(dá)升高[6]。故SCCA在臨床中應(yīng)用的價(jià)值有限。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)miRNA在血清中具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性[7]，而本研究中宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清中miRNA-155表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(p<0.05)，它能夠穩(wěn)定地被檢測(cè)并且能提示腫瘤的狀態(tài)，因此，血清中miRNA-155的檢測(cè)為下一步尋找宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物打下了基礎(chǔ)。

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