茶氨酸對全腦缺血再灌注大鼠JNK信號(hào)通路與DNA修復(fù)的影響

王　寧， 呂建瑞， 張珍妮， 薛榮亮

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科,西安　710004；*通訊作者，E-mail：xuerl@china.com)

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茶氨酸對全腦缺血再灌注大鼠JNK信號(hào)通路與DNA修復(fù)的影響

王寧， 呂建瑞， 張珍妮， 薛榮亮*

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科,西安710004；*通訊作者，E-mail：xuerl@china.com)

摘要：目的探討茶氨酸在大鼠全腦缺血再灌注過程中對c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)信號(hào)通路與DNA修復(fù)的作用。方法15周齡雄性SD大鼠108只，隨機(jī)均分為假手術(shù)組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和茶氨酸組(TH組)。每組根據(jù)再灌注時(shí)間分為2，6，12，24，48，72 h 6個(gè)亞組，每亞組6只。采用4-VO法建立SD大鼠全腦缺血模型，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)行灌注固定取腦、石蠟包埋切片，光鏡下計(jì)數(shù)CA1區(qū)存活細(xì)胞，TUNEL法檢測CA1區(qū)凋亡細(xì)胞，免疫組化檢測p-JNK和DNA修復(fù)蛋白X線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1(X-ray repair cross complementing protein l,XRCC1)的表達(dá)變化。結(jié)果腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)目TH組明顯高于IR組(P<0.01)，凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著低于IR組(P<0.01)。海馬CA1區(qū)p-JNK在IR組有明顯表達(dá)，24 h達(dá)到高峰；TH組p-JNK的表達(dá)明顯低于IR組(P<0.05)。SH組XRCC1表達(dá)量較強(qiáng)，IR組XRCC1的表達(dá)量下降(P<0.01)。TH組XRCC1表達(dá)量高于IR組(P<0.05)。 結(jié)論在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中，JNK信號(hào)通路與DNA修復(fù)蛋白XRCC1有一定關(guān)聯(lián)。JNK通路的激活在直接導(dǎo)致細(xì)胞損傷凋亡的同時(shí)，很可能也是DNA修復(fù)功能受傷的原因之一。茶氨酸則通過抑制JNK信號(hào)通路上調(diào)DNA修復(fù)蛋白XRCC1的表達(dá)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：腦缺血再灌注損傷；茶氨酸；細(xì)胞凋亡；c-Jun氨基末端激酶；DNA修復(fù)蛋白

腦缺血卒中、心臟驟停等疾病嚴(yán)重危害著人類健康，腦缺血再灌注損傷是此類疾病的主要病理生理過程，探尋對腦缺血再灌注損傷有效的預(yù)防和治療的方法及藥物一直是臨床研究方向。近年來茶氨酸對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用受到了越來越多的關(guān)注[1]，但其對腦缺血再灌注損傷過程中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)功能的保護(hù)作用及機(jī)制目前尚不清楚。DNA修復(fù)蛋白X線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1(X-ray repair cross complementing protein l,XRCC1)是參與哺乳動(dòng)物DNA的修復(fù)，在堿基切除修復(fù)中起整體作用，與DNA連接酶Ⅲ、DNA多聚酶β及PARA形成復(fù)合物修復(fù)一系列內(nèi)外氧化劑導(dǎo)致的DNA單鏈斷裂和堿基損傷。腦缺血再灌注時(shí)，腦細(xì)胞氧供和能量代謝受到干擾，DNA的修復(fù)功能亦受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。在生物體內(nèi)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)超家族廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，是細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)是MAPK家族成員之一，被激活后迅速轉(zhuǎn)位入核，激活活化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、 AP-1、JunB、JunD、ATF-2、ELK-1等的轉(zhuǎn)錄活性，活化的轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件相結(jié)合，引起大量與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，與細(xì)胞延遲性死亡關(guān)系密切[3]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠全腦缺血再灌注模型，應(yīng)用組織病理學(xué)、TUNEL法凋亡細(xì)胞檢測、免疫組織化學(xué)等方法探討茶氨酸對JNK信號(hào)通路與DNA修復(fù)蛋白XRCC1表達(dá)的影響及相互關(guān)系。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑

p-JNK抗體(購自美國Cell Signal公司)，XRCC1抗體(購自美國Santa Cruz公司)，原位末端細(xì)胞凋亡POD檢測試劑盒(購自中國華美公司)，DAB(購自北京中山試劑公司)，戊巴比妥鈉(購自西安)。DMSO(購自美國Santa Cruz公司)。

1.2動(dòng)物分組

15周齡雄性SD大鼠，體重290-310 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。術(shù)前在20-25 ℃環(huán)境中飼養(yǎng)1周，術(shù)前夜禁食，隨意進(jìn)水。隨機(jī)分為：假手術(shù)組(SH組)、缺血再灌注組(IR組)和茶氨酸組(TH組)。每組根據(jù)再灌注時(shí)間不同再分為2，6，12，24，48，72 h 6個(gè)亞組，每亞組6只動(dòng)物。

1.3模型制作

采用4-VO法[4]建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg對大鼠腹腔注射施行麻醉(所有動(dòng)物麻醉均與此相同)，仰臥位固定，頸前正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線留置備用，縫合頸部切口。改俯臥位固定，頸后正中切口，逐層分離肌肉，暴露第一頸椎翼小孔，用燒紅的探針插入翼小孔，燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈，使之永久閉塞。放回鼠籠。術(shù)后第2日，麻醉后仰臥位固定，剪開切口縫線，沿昨日留置線再次游離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，予以微動(dòng)脈夾夾閉6 min，松開微動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流。頸總動(dòng)脈夾閉2 min內(nèi)瞳孔不散大者棄之。SH組僅游離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不予微動(dòng)脈夾夾閉。三組動(dòng)物在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈前4 h分別尾靜脈注射0.9%NaCl,0.9%NaCl和25%茶氨酸(茶氨酸溶于0.9%NaCl)，4 ml/kg，藥物在5 min內(nèi)注完。

1.4組織學(xué)觀察神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目

在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，1%戊巴比妥鈉40 mg/kg對大鼠腹腔注射施行麻醉，開胸，經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌注0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)100 ml和4%多聚甲醛300 ml固定，取腦。取視交叉后1-4 mm腦塊進(jìn)行石蠟包埋，冠狀面切片，切片厚5 μm。切片行HE染色，在400倍光鏡下計(jì)數(shù)CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)存活神經(jīng)元數(shù)目。

1.5TUNEL染色檢測凋亡細(xì)胞

取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。蛋白酶K(20 mg/L)室溫消化，用甲醇配制的3%過氧化氫消除內(nèi)源性辣根過氧化酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)與地高辛標(biāo)記的dUTP混合反應(yīng)進(jìn)行孵育，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體進(jìn)行孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細(xì)胞，最后復(fù)染、脫水、透明、封片。在400倍光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.6免疫組織化學(xué)檢測p-JNK和XRCC1表達(dá)水平

取海馬冠狀石蠟切片，采用SABC法行免疫組化法。p-JNK多抗及XRCC1多抗稀釋度分別為1∶100，1∶100。切片依次脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10 min，三蒸水沖洗5 min。PBS(pH 7.4)浸泡5 min，電爐水浴抗原修復(fù)，加熱至95 ℃ 15-20 min后，自然冷卻至室溫。滴加正常山羊封閉血清，室溫孵育1 h，侵去勿洗。滴加1∶100的p-JNK多抗及1∶100的XRCC1多抗，放入4 ℃冰箱過夜。PBS沖洗5 min 3次，擦干切片周圍水分后，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃溫箱孵育1 h，PBS沖洗5 min 3次，擦干切片周圍水分后，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，放入37 ℃溫箱孵育20 min。三蒸水洗5 min 3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。采用Leica Qwin圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每張切片取CA1區(qū)中1/3段測量平均灰度值代表p-JNK、XRCC1的表達(dá)水平，p-JNK、XRCC1的表達(dá)強(qiáng)弱與灰度值成反比。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目變化

SH組HE染色，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞3-4層，排列緊密、整齊，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，高倍鏡下細(xì)胞核大而圓，有1-2個(gè)核仁；IR組HE染色，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)，排列紊亂，細(xì)胞核皺縮或染色質(zhì)邊聚，可見凋亡小體，細(xì)胞數(shù)量較SH組減少(P<0.01)；TH組海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較IR組明顯增加(P<0.01，見表1)。再灌注2，6，12，24，48，72 h細(xì)胞計(jì)數(shù)IR組分別為SH組的97%，92%，89%，70%，52%，42%，而TH組再灌注24，48，72 h細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為IR組的130%，167%和199%。

2.2海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞變化

TUNEL法檢測，SH組凋亡細(xì)胞極少；IR組凋亡細(xì)胞于再灌注6 h開始增多， 24 h凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，48 h達(dá)到高峰；TH組凋亡細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)較IR組明顯減少(P<0.01, 見表2)。

2.3海馬CA1區(qū)p-JNK和XRCC1免疫組化表達(dá)情況

SH組p-JNK表達(dá)量很低，IR組p-JNK的表達(dá)2 h時(shí)即明顯升高，6 h時(shí)略有降低，后逐漸上升，24 h到高峰，之后表達(dá)量減降，與SH組比較有顯著性差異(P<0.01)。TH組p-JNK的表達(dá)受到抑制，各時(shí)點(diǎn)與IR組比較均有顯著性差異(P<0.05, 見表3)。

組別n2h6h12h24h48h72hSH組634.18±8.2737.00±9.9633.07±7.9234.42±6.9535.70±6.7832.33±4.12IR組632.05±5.9734.18±6.76★29.06±3.54★24.10±7.65★18.22±4.78★13.28±8.28★TH組633.78±8.1635.67±4.9731.59±5.41▲31.22±7.46▲30.54±8.31▲26.53±6.48▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

組別n2h6h12h24h48h72hSH組61.22±0.531.61±0.631.63±0.541.58±0.722.01±0.511.74±0.47IR組62.65±0.4916.41±3.18★25.77±5.91★56.54±4.84★48.42±7.16★31.59±4.92★TH組61.89±0.549.18±2.35▲14.00±1.89▲20.36±4.63▲16.69±2.76▲11.44±3.40▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

組別n2h6h12h24h48h72hSH組6192.47±3.26193.39±3.62196.76±3.85194.59±5.03196.33±3.79189.71±6.35IR組6163.54±3.76★187.58±4.80★150.49±4.67★132.28±4.83★145.61±4.48★159.79±5.59★TH組6183.46±2.57▲182.59±5.39▲178.82±5.39▲170.18±3.26▲166.81±4.37▲165.89±4.95▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.05

SH組XRCC1表達(dá)量較強(qiáng)，IR組XRCC1的表達(dá)與SH組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，2 h即已開始下降。TH組XRCC1表達(dá)量的降低則不明顯，各時(shí)點(diǎn)與IR組比較均有顯著性差異(P<0.05，見表4)。

3討論

XRCC1是編碼堿基損傷修復(fù)聯(lián)合序列的一種重要蛋白[5]，在堿基切除修復(fù)中起整體作用，腦缺血再灌注中大量DNA單鏈斷裂和細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)，一過性局灶腦缺血10 min，XRCC1開始衰減，持續(xù)至再灌注后24 h[6]，免疫組化和TUNEL雙標(biāo)顯示XRCC1免疫活性喪失的神經(jīng)元變?yōu)門UNEL染色陽性，表明XRCC1早期降低先于DNA斷裂的發(fā)生[7]，XRCC1早期降低是DNA單鏈斷裂無法修復(fù)的機(jī)制之一[8]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠全腦缺血再灌注模型，IR組XRCC1的表達(dá)隨再灌注時(shí)間亦呈衰減趨勢。JNK信號(hào)通路在細(xì)胞受到脅迫性刺激而發(fā)生凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用。對其促調(diào)亡可能與上調(diào)促調(diào)亡蛋白的表達(dá)(p53、c-Myc、bax等)、作用于Bcl-2家族進(jìn)而調(diào)控線粒體促進(jìn)細(xì)胞色素酶的釋放[9,10]等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中IR組JNK的表達(dá)增加，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，再次證實(shí)了JNK的促凋亡作用。本課題組先前實(shí)驗(yàn)中通過JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125明顯抑制大鼠6 min全腦缺血后再灌注各時(shí)點(diǎn)JNK的表達(dá)，進(jìn)而減輕了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，抑制了凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生，與此同時(shí)，也明顯抑制了XRCC1在再灌注各時(shí)點(diǎn)的衰減，提示JNK可使全腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元DNA修復(fù)功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)DNA修復(fù)蛋白XRCCl的表達(dá)有關(guān)[11]。

組別n2h6h12h24h48h72hSH組697.76±4.6599.76±6.36108.19±5.32116.76±6.78113.35±5.63109.85±4.79IR組6126.77±5.57★142.07±5.65★153.60±6.53★166.38±6.81★182.66±4.95★174.45±6.29★TH組6117.45±6.09▲122.37±3.76▲126.39±4.48▲140.63±4.92▲157.64±5.96▲151.75±7.17▲

與SH組相比，★P<0.01；與IR組相比，▲P<0.01

茶氨酸是茶葉中的一種獨(dú)特成分，其作為食品添加劑已廣泛使用，具有良好的安全性、穩(wěn)定性，且攝入量不受限制。目前越來越多的研究表明茶氨酸對神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[12]，其可減小缺血再灌注之后的腦梗死面積[13]，其可同時(shí)作用于陽離子門控通道的離子型谷氨酸受體和G-蛋白偶聯(lián)的谷氨酸代謝型受體，直接拮抗谷氨酸對培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的興奮性毒性[14]，可抑制谷氨酰胺在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的傳遞[15]，維持谷氨酸、谷氨酸鹽焦谷氨酸及γ-氨基丁酸的代謝平衡[16]，還有實(shí)驗(yàn)證明其可提高幼鼠在神經(jīng)發(fā)育成熟過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì)的合成[17]，但具體機(jī)制尚未完全明確。在本實(shí)驗(yàn)中，茶氨酸減輕了全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，抑制了凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生。與此同時(shí)，茶氨酸明顯抑制了p-JNK在再灌注各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)，并上調(diào)了XRCC1的表達(dá)，JNK與XRCC1的表達(dá)趨勢與我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由此推論，在大鼠全腦缺血再灌注損傷過程中，茶氨酸可能作用于JNK信號(hào)通路抑制JNK信號(hào)通路的激活，減少XRCC1的下調(diào)，維持并促進(jìn)DNA修復(fù)功能，進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡和損傷來發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用的。

綜上所述，茶氨酸對全腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及凋亡具有保護(hù)作用，抑制JNK凋亡通路并維持DNA修復(fù)功能可能是其機(jī)制之一，為茶氨酸作為神經(jīng)保護(hù)劑的潛在研發(fā)工作提供了一定的理論依據(jù)。

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Effect of theanine on JNK signaling pathway and DNA repair in global brain ischemia/reperfusion rats

WANG Ning, Lü Jianrui, ZHANG Zhenni, XUE Rongliang*

(DepartmentofAnesthesiology,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:xuerl@china.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of theanine on c-Jun N-terminal kinase(JNK) signaling pathway and DNA repair in global brain ischemia/reperfusion rats.MethodsOne hundred and eight 15-week-old SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia-reperfusion(IR) group and theanine group. Each group was divided into 6 subgroups according to reperfusion time: 2, 6, 12, 24, 48, 72 h groups.Transient global brain ischemia was induced by four-vessel occlusion, and the rats were perfusion-fixed at specified time points after reperfusion. The brains were removed, embedded and sliced up. The numbers of survival cells and apoptotic cells in hippocampal CA1 region were counted respectively by histochemistry and TUNEL,and the activities of p-JNK and X-ray repair cross complementing protein l(XRCC1) were detected by immunohistochemistry.ResultsIn theanine group, the number of survival cells in hippocampal CA1 region was significantly higher than that in IR group(P<0.01), and the number of apoptotic cells was lower than that in IR group(P<0.01). The p-JNK in IR group was markedly expressed in CA1 region, and the expression reached the peak at 24 h after reperfusion. The level of p-JNK in theanine group was significantly lower than that in IR group(P<0.05). The XRCC1 was markedly expressed in sham group, whereas the expression decreased in IR group(P<0.01), and the level of XRCC1 in theanine group was higher than that in IR group(P<0.05).ConclusionThere is a certain relationship between JNK signaling pathway and DNA repair protein XRCC1 during global brain ischemia-reperfusion injury. The activation of the JNK signaling pathway may be one of the reasons of the damages of DNA repair protein function during the induction of cell apoptosis. Theanine may play its neuroprotection by inhibiting JNK signaling pathway and up-regulating the expression of DNA repair protein XRCC1.

Key words:brain ischemia/reperfusion injury;theanine；apoptosis;JNK;DNA repair protein

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071070)

作者簡介：王寧，女，1983-04生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：wangningcare@163.com

收稿日期：2016-02-25

中圖分類號(hào)：R363

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)05-0415-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.004