三氧化二砷對人大細胞肺癌NCI—H460細胞凋亡影響的研究

王崇　張程　張湘燕　姚紅方　張小潤

摘要：目的 研究在臨床上，三氧化二砷（As2O3）對人大細胞肺癌（NCI-H460細胞）細胞增殖、凋亡的影響，以探討新的肺癌治療方法。方法 配制NCI-H460細胞的細胞懸液（濃度為5×104個/mL），給予不同濃度的As2O3干預(yù)，并將其分為4組濃度分別為：10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L ，各組干預(yù)時間分別為24、48、72 h。細胞增殖抑制率通過MTT法檢測，各組細胞形態(tài)學(xué)的改變通過鏡下觀察；細胞凋亡的形態(tài)學(xué)的變化通過原位末端標記法（TUNEL）檢測，并與陰性對照組進行比較；按上述干預(yù)濃度及干預(yù)時間，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 As2O3對NCI-H460細胞增殖的抑制率隨時間延長和濃度增加而增加（P<0.05）， 凋亡指數(shù)隨時間延長和濃度增加而增加 （P<0.05）。結(jié)論 As2O3可抑制NCI-H460細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈時間、劑量依賴性。

關(guān)鍵詞：三氧化二砷；大細胞肺癌；NCI-H460細胞；細胞增殖；細胞凋亡

三氧化二砷，分子式為As2O3，別名：砒霜，是具有代表性的砷化合物，主要用于治療胃癌，胰腺癌、梅毒、結(jié)核等[1]，并在治療急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）過程中有著顯著的療效[2]。因其緩解率高， 和其他抗癌藥物無交叉反應(yīng)性，無骨髓抑制和嚴重毒副作用而獲得了廣泛重視，并被美國FDA批準用于APL的治療。臨床研究表明，As2O3對實體腫瘤如肺癌（A549細胞）、胰腺癌、胃癌等具有良好的抗癌作用。國內(nèi)外報道多見應(yīng)用As2O3作用于多種肺癌細胞方面，如Anip973細胞、NCI-H69細胞、A549細胞的凋亡，但是很少見到有關(guān)As2O3誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡的報道，繼而本實驗選擇NCI-H460細胞，觀察As2O3對該細胞增殖及凋亡方面的影響，為臨床上尋找對該類腫瘤新的治療方法，提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細胞 NCI-H460細胞 （由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室提供）。

1.2試劑 As2O3（哈爾濱伊都藥業(yè)）細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche 公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液、 胎牛血清（美國HyClone公司）。

1.3儀器 Bio-Rad 550 酶標儀（美國 Bio-Rad公司）；TS100倒置微鏡 （日本Nikon公司）； JNOECXS-212-202生物顯微鏡 （南京江南光電集團股份有限公司）；流式細胞儀（BDFACSAria）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 參見張小潤、王曉宇等研究類似[3]。

1.2.2 MTT法測定As2O3對NCI-H460細胞的生長抑制率 顯微鏡下觀察細胞，呈現(xiàn)對數(shù)生長期，0.25%胰酶消化成細胞懸液，離心1000 rpm/min、10 min，用含10%胎牛血清及青鏈霉素混合液的RPMI-1640全培養(yǎng)液稀釋細胞濃度約5×104個/ml。將100 μl/孔的細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，共設(shè)4個平行組，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)1組陰性對照組（100 μl無藥物干預(yù)的上述細胞懸液），5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，然后每孔加入以生理鹽水溶解的不同濃度的As2O3（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）50 μl，并向?qū)φ战M加入細胞培養(yǎng)液50μl，設(shè)定24 h、48 h、72 h為上述5組的反應(yīng)時間，帶反應(yīng)時間到達后，吸去原培養(yǎng)液并用生理鹽水沖洗各孔，然后向各孔加入20 μl MTT，并于4 h后加二甲亞砜（DMSO）200 ul于每孔中，使用酶標儀測量吸光度OD（490 nm波長），對應(yīng)3個復(fù)孔，反復(fù)3次實驗每組濃度。細胞抑制率%=（1-給藥組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3細胞凋亡的形態(tài)通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（TUNEL）法檢測 同2.2操作得到細胞懸浮液5×104個/ml，將細胞懸液轉(zhuǎn)到24孔板中培養(yǎng)，400 μl/孔，共設(shè)4個平行組，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置1正常對照組孔（不加藥），37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁，然后加入200 μl不同濃度的As2O3（生理鹽水溶解），藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分別作用24 h、48 h、72 h，到實驗時間后，進行凋亡檢測，具體步驟參見張小潤、王曉宇等研究[3]。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞的凋亡指數(shù) 使用上述同樣的方法將細胞濃度稀釋至5×105/ml，將細胞懸液轉(zhuǎn)到6孔板中培養(yǎng)，2 ml/孔，共設(shè)4個平行組，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)置1正常對照組孔（不加藥），37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h使之貼壁，然后加入1000 μl不同濃度的As2O3（生理鹽水溶解），藥物終濃度分別為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，分別作用24 h、48 h、72 h，到實驗時間后，進行凋亡檢測，具體步驟見試劑說明書，凋亡指數(shù)=（Q1+Q2）×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析、處理，數(shù)據(jù)以（x±s）差表示，組間多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCI-H460細胞形態(tài)變化 在不同濃度As2O3作用后，NCI-H460細胞隨著藥物濃度的增加、干預(yù)時間延長， 部分NCI-H460細胞胞漿內(nèi)開始有空泡形成，細胞輪廓明顯，少部分細胞脫落，漂浮于培養(yǎng)液中；亦有少數(shù)細胞體積增大，胞體腫脹、破裂，呈壞死狀。

2.2 As2O3對NCI-H460細胞增殖抑制率的影響As2O3能抑制NCI-H460細胞增殖，并呈時間、劑量依賴性。不同濃度As2O3作用不同時間后NCI-H460細胞增殖的抑制率比較，濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L作用24 h后NCI-H460細胞形態(tài)，見圖1，表1。

圖1 濃度10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L As2O3

作用24 h后NCI-H460細胞形態(tài)（×200）

2.3 As2O3對NCI-H460細胞凋亡的形態(tài)學(xué)的影響 TUNEL染色，陰性組見藍色的凋亡陰性染色；陽性組凋亡細胞核呈棕黃色，細胞呈小片或散在分布，細胞核碎裂、溶解，形狀不一，易于觀察，伴隨不斷增大的藥物濃度，可見棕黃色的凋亡細胞的分布不斷擴大，見圖2。

圖2 TUNEL法檢測不同濃度As2O3作用于

NCI-H460細胞24 h后的凋亡圖形

注：A：0 μmol/L；B：10 μmol/L；C：80 μmol/L。

2.4 NCI-H460細胞的凋亡指數(shù)通過流式細胞儀檢測 在不同時間、不同濃度下As2O3對NCI-H460細胞凋亡作用的影響可通過流式細胞儀觀察；隨著劑量的增加，時間的延長，細胞的的凋亡指數(shù)在不同時間下呈進行性升高。數(shù)據(jù)表明，NCI-H460細胞的凋亡與As2O3的誘導(dǎo)有明顯關(guān)系，并與劑量和時間呈現(xiàn)依賴相關(guān)性。（通過圖3能夠發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，Q1+Q2的比例不斷擴大），見表2，圖3。

圖3 流式細胞儀檢測10 μmol/L As2O3作用于

NCI-H460細胞不同時間的凋亡指數(shù)的比較

注：A：24 h，B：48 h，C：72 h。

3 討論

肺癌，為最常見的肺部惡性腫瘤，分為小細胞肺癌及非小細胞肺癌，后者中又以大細胞肺癌惡性程度最高，雖傳統(tǒng)治療以手術(shù)為主，但是因其轉(zhuǎn)移快，手術(shù)后預(yù)后亦欠佳，故化療在其治療過程中起著極其重要的的作用。目前，很多研究顯示，絕大多數(shù)藥物是通過抑制細胞的生長、增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用的。

三氧化二砷，俗稱砒霜，近年來許多報道發(fā)現(xiàn)，As2O3在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中發(fā)揮著明顯的抗癌作用，受到全世界的矚目如急性早幼粒細胞白血病[4]。大量實驗證實，As2O3可以抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，且As2O3在抑制腫瘤細胞增殖方面與其他藥物相比具有多途徑的優(yōu)勢；其次，As2O3在毒副作用和抗癌廣譜性方面與其他抗癌藥物相比也具有明顯的優(yōu)勢[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，As2O3治療各種實體瘤如胃癌、胰腺癌和肺癌的主要機制是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。

劉琳[9]等國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)對于人的大腸癌細胞，給予As2O3 3 d的劑量，并作用24 h、48 h、72 h，能誘導(dǎo)癌細胞凋亡，并可見凋亡形態(tài)學(xué)變化。借鑒該項研究經(jīng)驗，制定本次試驗的藥物As2O3濃度分別10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，干預(yù)時間為24 h、48 h、72 h?，F(xiàn)代的檢測凋亡的方法有流式細胞儀檢測法、MTT法、TUNEL法，其中流式細胞儀檢測法具有準確性好、精度高、速度快等優(yōu)點。在本次試驗中，分別使用這三種檢測方法以探討As2O3對NCI-H460細胞凋亡及細胞增殖指數(shù)的影響。其中MTT法，采用不同時間及濃度的As2O3作用于NCI-H460細胞，并通過顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，陰性對照組細胞折光性好，貼壁良好，無脫落，呈梭行或者不規(guī)則形。對于藥物干預(yù)組，細胞逐漸變圓，細胞輪廓更加明顯，部分NCI-H460細胞胞漿內(nèi)有空泡形成，且折光性差，甚至在細胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)脫落漂浮現(xiàn)象，隨著藥物濃度和作用時間的的增加，細胞的具有更明顯的形態(tài)變化。

本次實驗中，在不同時間及不同濃度下，As2O3作用于NCI-H460細胞，排除部分因檢測誤差和標本例數(shù)少等原因造成濃度抑制率、作用時間和凋亡指數(shù)無明顯差異性變化。從總趨勢上來說，As2O3不同時間及不同濃度下對NCI-H460細胞的增殖具有抑制作用，并且和時間以及劑量呈現(xiàn)相關(guān)依賴關(guān)系，這與韋國楨，曹琦[10]和Chow等[11]的研究結(jié)果類似，從而可作出推斷，As2O3可抑制NCI-H460的增殖，并與時間和劑量呈現(xiàn)可能的相關(guān)依賴關(guān)系；另外，姚和瑞[12]等的研究表明，As2O3可以誘導(dǎo)肺癌細胞（NCI-H69）凋亡，并且凋亡指數(shù)與濃度的增大呈進行性上升關(guān)系，同樣揭示了As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡，并具有與時間及劑量的相關(guān)依賴性。本次研究中檢測NCI-H460細胞的凋亡指數(shù)采用的是流式細胞儀，也發(fā)現(xiàn)As2O3能誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡，并且凋亡指數(shù)與劑量及時間相關(guān)依賴關(guān)系，同樣可推斷出，As2O3能夠誘導(dǎo)NCI-H460細胞凋亡，并具有與時間及劑量的相關(guān)依賴性。與其他相關(guān)報道結(jié)合，可以看出化療抗腫瘤的機制可能與多種化療藥物干涉多種癌基因的表達有關(guān)，如基因bcl-2，P53等，還有報道更詳細的指出，三氧化二砷可以通過下調(diào)表達bcl-2基因與上調(diào)表達P53基因有關(guān)[13]，更進一步明確三氧化二砷抗腫瘤的機制，有待于更深層次的完善相關(guān)實驗。

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編輯/翟辰萬