龍脷葉總游離氨基酸含量測(cè)定

譚建寧 杜成智 梁臣艷 何翠薇

摘要：【目的】建立龍脷葉總游離氨基酸含量的測(cè)定方法，為龍脷葉藥材質(zhì)量控制及其開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳怨劝彼釣閷?duì)照品，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化龍脷葉總游離氨基酸的提取條件，并利用紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其含量?！窘Y(jié)果】龍脷葉總游離氨基酸最佳提取條件為：龍脷葉粉碎過(guò)20目篩、液料比25.0∶1、提取時(shí)間1.5 h，其中粉碎度和提取時(shí)間對(duì)龍脷葉總游離氨基酸提取效果的影響顯著（P<0.05）。568 nm是龍脷葉供試品溶液和谷氨酸對(duì)照品溶液的檢測(cè)波長(zhǎng)；谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系（R2=0.9991）。在最佳提取條件下，測(cè)得6批龍脷葉總游離氨基酸含量（以谷氨酸計(jì)）在2.82%～6.77%，平均含量為4.50%?！窘Y(jié)論】采用紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定龍脷葉總游離氨基酸含量，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為龍脷葉總游離氨基酸的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞： 龍脷葉；總游離氨基酸；紫外—可見(jiàn)分光光度法；正交試驗(yàn)；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）04-0645-05

0 引言

【研究意義】龍脷葉為大戟科植物龍脷葉（Sauropus spatulifolius Beille）的干燥葉（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015），主要分布于廣西、廣東、福建等地，作為廣西常用中草藥已被《廣西本草選編》（廣西壯族自治區(qū)革命委員會(huì)衛(wèi)生局，1974）和《廣西藥用植物名錄》（廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，1986）收載。龍脷葉為廣西特色中藥，具有通氣道、潤(rùn)肺止咳、滑腸通便等功效，是臨床上常用壯藥（廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，2008）。龍脷葉既可藥用，又可食用，華南地區(qū)民間常用其煲涼茶以祛痰化濕，也可與瘦豬肉或豬肺同煮，對(duì)肺熱咳嗽、失音、喉痛、急性支氣管炎、上呼吸道炎等癥具有一定的保健作用。廣西龍脷葉資源豐富，深入研究其藥用成分，對(duì)龍脷葉的藥用開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義，也有利于促進(jìn)廣西中藥民族醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】龍脷葉含有皂苷、甾體類和氨基酸等成分（廣東省食品藥品監(jiān)督管理局，2004），但目前有關(guān)龍脷葉化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且主要集中在龍脷葉水提物的作用研究。汪小根和邱蔚芬（2007）采用氣—質(zhì)聯(lián)用分析法從龍脷葉揮發(fā)油中鑒定出16種成分，主成分為棕櫚酸（28.43%）、金合歡基丙酮（8.82%）等。劉蓉（2009）的研究結(jié)果表明，龍脷葉的水提物為低毒性，對(duì)急、慢性炎癥均有明顯的拮抗作用，并有較強(qiáng)的抑菌作用。黃燕等（2014）采用連續(xù)二倍梯度瓊脂稀釋法研究龍脷葉水提液和50%、70%、95%乙醇提取物的抑菌活性，結(jié)果顯示，龍脷葉水提液和50%乙醇提取物的正丁醇部位對(duì)6種試驗(yàn)菌株有明顯的抑制作用。陳珍（2014）采用薄層鑒別法考察龍脷葉水提液的正丁醇萃物，并對(duì)皂苷和氨基酸部分進(jìn)行定性鑒別，顯色后，可見(jiàn)明顯的斑點(diǎn)出現(xiàn)。何鵬等（2014）采用高效液相色譜法對(duì)15批龍脷葉中具有抗炎、止咳、解痙、抗?jié)兊裙πУ狞S酮苷成分山柰酚-

3-O-龍膽二糖苷的含量進(jìn)行測(cè)定，得知其平均含量為0.0446%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】游離氨基酸是一種重要生物活性物質(zhì)，參與植物中氮和蛋白質(zhì)的代謝（Egydio et al.，2013）。龍脷葉水提液中含有氨基酸，但至今未見(jiàn)有關(guān)龍脷葉中總游離氨基酸含量測(cè)定的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以谷氨酸為對(duì)照品，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)龍脷葉總游離氨基酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其含量，建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定龍脷葉總游離氨基酸含量的方法，為龍脷葉藥材質(zhì)量控制及其開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

龍脷葉藥材于2014年6～10月分3次購(gòu)自玉林藥材批發(fā)市場(chǎng)，其中批號(hào)141001和141002（產(chǎn)地：廣西靖西縣）購(gòu)于6月，批號(hào)141003、141005（產(chǎn)地：廣西梧州市）和批號(hào)141004（產(chǎn)地：廣西玉林市）購(gòu)于8月，批號(hào)141006（產(chǎn)地：廣西梧州市）購(gòu)于10月。

谷氨酸對(duì)照品（批號(hào)140690-201203）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；95%乙醇、冰乙酸、茚三酮、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水為去離子水。主要儀器設(shè)備：8453型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）、BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）、CD-UPT超純水機(jī)、KQ5200B型超聲提取儀、DK-98-∏A恒溫水浴鍋、FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、PHS-25 pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、BT600電子天平（南通市啟東友銘衡器有限公司）。

1. 2 溶液配制

1. 2. 1 谷氨酸對(duì)照品溶液制備 精密稱取25.06 mg谷氨酸置于25 mL容量瓶中，以去離子水溶解，定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度，制得100.2 μg/mL谷氨酸對(duì)照品溶液。

1. 2. 2 供試品溶液制備 精密稱量龍脷葉藥材（批號(hào)141005）粉末（過(guò)20目篩）4.0 g置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100.0 mL去離子水，稱定重量，提取1.5 h；補(bǔ)足重量，搖勻，靜置后以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品儲(chǔ)備液。精密吸取上述供試品儲(chǔ)備液0.5 mL置于25 mL容量瓶中，以去離子水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

1. 2. 3 pH 6.0緩沖溶液配制 取醋酸鈉54.6 g，加20.0 mL 1 mol/L醋酸溶液溶解后，加水稀釋至500.0 mL，即得pH 6.0緩沖溶液。

1. 3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密吸取供試品溶液和谷氨酸對(duì)照品溶液各1.0 mL，分別置于10 mL試管中，再加入pH 6.0緩沖溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，置于沸水中加熱15 min，顯色。采用紫外—可見(jiàn)分光光度法，用1 cm比色皿，以試劑空白作參比，在400～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1. 4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

準(zhǔn)確吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL谷氨酸對(duì)照品溶液分別置于10 mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度，搖勻，作為谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列液；依次吸取1.0 mL置于10 mL試管中，分別加入pH 6.0緩沖溶液2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，沸水中加熱15 min，顯色。以試劑空白作參比，于568 nm處測(cè)定吸光值。以谷氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖1），其回歸方程為：y=0.0128x+0.0424（R2=0.9991）。谷氨酸在20.0～60.1 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值的線性關(guān)系良好。

1. 5 龍脷葉總游離氨基酸提取正交試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇以去離子水超聲波提取龍脷葉總游離氨基酸。選取對(duì)龍脷葉總游離氨基酸提取影響較大的藥材粉碎度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）作為考察因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。稱取龍脷葉藥材（批號(hào)141005）9份，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按照1.4的方法顯色，于568 nm處測(cè)定吸光值。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1. 6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取龍脷葉藥材（批號(hào)141005）粉末（過(guò)20目篩）5份，在最佳提取工藝下進(jìn)行總游離氨基酸提取，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按照1.4的方法顯色后，于568 nm處測(cè)定吸光值，驗(yàn)證最佳提取工藝的可靠性。

1. 7 龍脷葉總游離氨基酸含量測(cè)定

精密稱量6批龍脷葉藥材，按照1.2.2的方法制備供試品溶液，分別精密吸取1.0 mL置于10 mL試管中，搖勻；按照1.4的方法顯色后，以試劑空白作參比，于568 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算龍脷葉總游離氨基酸含量（以谷氨酸計(jì)）。計(jì)算公式如下：

總游離氨基酸含量（%）=C×5000×V×100/（M×106）

式中，C為供試品溶液測(cè)得的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后計(jì)算的谷氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL），V為供試品溶液體積（mL），M為龍脷葉藥材質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

在400～800 nm范圍內(nèi)掃描龍脷葉供試品溶液與谷氨酸對(duì)照品溶液的吸收曲線，結(jié)果（圖2）顯示，供試品溶液與谷氨酸對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為 568 nm，因此，確定568 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2. 2 龍脷葉總游離氨基酸提取條件的確定

由表2可知，影響龍脷葉總游離氨基酸提取效果的因素主次排序?yàn)椋篈>B>C，即粉碎度是主要影響因素，其次為提取時(shí)間，而液料比的影響相對(duì)較??；其中，粉碎度和提取時(shí)間對(duì)龍脷葉總游離氨基酸提取效果有顯著影響（P<0.05）（表3）。最佳提取工藝組合為A3B3C2，即龍脷葉總游離氨基酸最佳提取工藝條件為：粉碎過(guò)20目篩、提取時(shí)間1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在工藝組合A3B3C2的提取條件下，龍脷葉總游離氨基酸平均含量為6.77%，高于正交試驗(yàn)各組合的含量，說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果可靠。龍脷葉總游離氨基酸最佳提取條件確定為：過(guò)20目篩粉碎、提取時(shí)間1.5 h、液料比25.0∶1。

2. 4 龍脷葉總游離氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果

從表4可以看出，6批龍脷葉總游離氨基酸含量存在較大差異，以購(gòu)于8月批號(hào)141005（產(chǎn)地：廣西梧州市）的含量最高，為6.77%；其次是同樣購(gòu)于8月的批號(hào)141003（產(chǎn)地：廣西梧州市），其總游離氨基酸含量為6.50%；總游離氨基酸含量最低的是批號(hào)141001（產(chǎn)地：廣西靖西縣），為2.82%；6批龍脷葉總游離氨基酸的平均含量為4.50%。

3 討論

氨基酸成分的測(cè)定常采用紫外—可見(jiàn)分光光度法、氨基酸自動(dòng)分析儀法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。其中，氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定的氨基酸為鹽酸水解蛋白質(zhì)和植物本身含有的游離氨基酸，但過(guò)層析柱后需與水合茚三酮衍生劑衍生，造成峰形變寬，分辨率降低；高效液相色譜分析法測(cè)定的是在分離蛋白或限制蛋白水解條件下各游離氨基酸含量，分析時(shí)需在過(guò)層析柱前衍生，易污染色譜柱，造成柱效降低；氣相色譜法需把氨基酸衍生為易氣化的物質(zhì)，且適用于氨基酸衍生的衍生試劑不多，衍生操作復(fù)雜（劉榮森等，2007；吳琴燕等，2014）。紫外—可見(jiàn)分光光度法常用于測(cè)定總游離氨基酸，顯色劑主要有茚三酮、吲哚醌等（曾俊和蘇俊黎，2003；黃松等，2010），可直觀反映植物中本身含有的游離氨基酸含量，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，且儀器價(jià)格低廉。

本研究采用紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定龍脷葉總游離氨基酸含量，結(jié)果顯示，不同批次間的龍脷葉總游離氨基酸含量差異較明顯，含量最高和最低相差近2.5倍。廣西靖西縣的兩批龍脷葉總游離氨基酸含量在6批藥材中最低，僅為2.82%和2.74%；購(gòu)于8月的3批龍脷葉藥材中有廣西梧州和玉林市兩個(gè)產(chǎn)地，其中廣西梧州市的兩批藥材含量高，分別達(dá)6.50%和6.77%，廣西玉林市的龍脷葉總游離氨基酸含量?jī)H3.66%，相差近1.8倍；分別購(gòu)于8月和10月的龍脷葉，產(chǎn)地同為廣西梧州市，購(gòu)于10月的龍脷葉總游離氨基酸含量相較于8月的含量有所下降，為4.51%。因此推測(cè)龍脷葉總游離氨基酸含量受產(chǎn)地、采收時(shí)間等因素影響較大，但具體原因有待進(jìn)一步探究。氨基酸含量高低決定植物的品質(zhì)，6批龍脷葉總游離氨基酸的平均含量為4.50%（以谷氨酸計(jì)），高于鐵皮石斛總氨基酸含量0.327%（以天冬氨酸計(jì)）（王培培等，2013），提示龍脷葉品質(zhì)高，可作為保健食品進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

氨基酸的存在形式一般有兩種，一種是游離態(tài)，一種是結(jié)合到蛋白質(zhì)中。游離氨基酸的抗感染能力顯著，有研究表明，游離氨基酸中的組氨酸、蘇氨酸缺乏可促使小鼠對(duì)傷寒沙門氏菌的易感性增高，賴氨酸缺乏導(dǎo)致小鼠對(duì)炭疽芽孢桿菌的抵抗力下降，而皮下注射半胱氨酸可增強(qiáng)動(dòng)物一些非特異性免疫功能及對(duì)葡萄糖球菌毒素的抵抗力（徐琪壽，1996）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，龍脷葉中含有谷氨酸、組氨酸、蘇氨酸、賴氨酸等多種游離氨基酸；本研究測(cè)定龍脷葉總游離氨基酸含量，可為深入研究龍脷葉抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等活性成分提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步將對(duì)多種游離氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，為龍脷葉藥材資源的綜合利用提供更多理論依據(jù)。

4 結(jié)論

采用紫外—可見(jiàn)分光光度法測(cè)定龍脷葉總游離氨基酸含量，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為龍脷葉總游離氨基酸的質(zhì)量控制方法。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）