• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表達(dá)及蛋白純化

    2016-05-30 10:48:04張強(qiáng)李麗紅要笑云蔣璐瑤王瑩撖靜宜曹山李慧陸海
    關(guān)鍵詞:原核表達(dá)

    張強(qiáng) 李麗紅 要笑云 蔣璐瑤 王瑩 撖靜宜 曹山 李慧 陸海

    摘要:【目的】對毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4進(jìn)行原核表達(dá)及重組蛋白純化,為進(jìn)一步研究該基因的酶學(xué)特征和生理功能打下基礎(chǔ)。【方法】從毛果楊中克隆兩個(gè)半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4,構(gòu)建其原核表達(dá)載體pET-30a-PtCP2及pET-30a-PtCP4,并在轉(zhuǎn)入大腸桿菌后在體外誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化。【結(jié)果】PtCP2基因CDS序列全長1107 bp,編碼368個(gè)氨基酸;PtCP4基因CDS序列全長1104 bp,編碼367個(gè)氨基酸。PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白均屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達(dá),其中PtCP2在葉中表達(dá)量最高,PtCP4在根中表達(dá)量最高。通過包涵體洗滌法在體外得到了高表達(dá)量、單一的重組蛋白PtCP2和PtCP4,切除信號(hào)肽后蛋白酶大小分別為38.151和38.069 kD?!窘Y(jié)論】原核表達(dá)獲得的純化重組蛋白PtCP2和PtCP4可用于進(jìn)一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學(xué)特征和生理功能。

    關(guān)鍵詞: 毛果楊;半胱氨酸蛋白酶;原核表達(dá);蛋白純化;定量PCR

    中圖分類號(hào): Q785;Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2016)04-0511-08

    0 引言

    【研究意義】半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease)是植物體內(nèi)一類十分龐大的蛋白酶家族,廣泛參與植物的各生理過程(Ahmad et al.,2014)。大量研究發(fā)現(xiàn),植物各組織器官的衰老與半胱氨酸蛋白酶關(guān)系密切。木本植物的細(xì)胞程序性死亡(PCD)過程主要表現(xiàn)為木質(zhì)部形成、葉衰老等,而毛果楊基因組已全部測序并公布,可作為木本植物研究中的模式生物,因此,深入研究毛果楊半胱胺酸蛋白酶PtCP2和PtCP4,對木材的利用和改良等具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明,在干旱、低溫等非生物脅迫條件下,半胱氨酸蛋白酶基因的表達(dá)會(huì)明顯上升(Battelli et al.,2014);在細(xì)胞衰老和細(xì)胞程序性死亡過程中,半胱氨酸蛋白酶也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Zhang et al.,2014)。Wagstaff等(2002)研究發(fā)現(xiàn),萱草科植物中的半胱氨酸蛋白酶基因SEN11和SEN102均在花的衰老過程中表達(dá),其中,SEN102基因在萱草屬的葉片衰老過程中呈下調(diào)表達(dá),但在花的衰老過程中呈上調(diào)表達(dá);在擬南芥葉片的衰老過程中,有8個(gè)半胱氨酸蛋白酶基因表達(dá),其中最引人注目的是木瓜蛋白酶SAG12,被認(rèn)為是衰老的標(biāo)志性蛋白(Wan et al.,2002;McLellan et al.,2009);與擬南芥RD19蛋白同源率較高的MsCyp15A則被發(fā)現(xiàn)在苜蓿葉片衰老進(jìn)程中發(fā)揮十分重要的作用(Bernoux et al.,2008)。Mackey等(2002)研究發(fā)現(xiàn),RD19類基因主要編碼干旱誘導(dǎo)性半胱氨酸蛋白酶,青枯雷爾氏菌引發(fā)的干旱脅迫可以導(dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升,但這類蛋白在干旱脅迫中的作用機(jī)理目前尚不明確;研究還發(fā)現(xiàn)RD19類蛋白的失活會(huì)導(dǎo)致感染植物中細(xì)菌大量繁殖。目前,已有很多半胱氨酸蛋白酶基因在體外表達(dá)且相應(yīng)蛋白酶已成功進(jìn)行純化。半滑舌鰨中的半胱氨酸蛋白酶基因CsCatB已成功進(jìn)行原核表達(dá)并純化,且在35 ℃和pH 5.5條件下獲得最大酶活性(Chen and Sun,2012);另外,Nandana等(2014)成功將牛角瓜半胱氨酸蛋白酶基因Procerain B進(jìn)行原核表達(dá)及純化,并在pH 4.0條件下成功體外激活。【本研究切入點(diǎn)】目前,半胱胺酸蛋白酶在草本植物中研究比較透徹,但由于木本植物生長周期長于草本植物等原因,半胱氨酸蛋白酶在木本植物中的研究明顯滯后。【擬解決的關(guān)鍵問題】以毛果楊為試驗(yàn)材料,在體外大量表達(dá)毛果楊重組蛋白PtCP2和PtCP4的基礎(chǔ)上,探討重組蛋白的純化方法,建立一套合理有效的包涵體蛋白純化體系,為今后進(jìn)一步研究該基因的生理功能打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    供試材料毛果楊(Populus trichocarpa Torr. & Gray)由北京林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)DH5α和BL21及表達(dá)載體pET-30a由北京林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。Easyspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司;FastQuant RT Kit試劑盒購自Promega公司;質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及SuperReal熒光定量預(yù)混試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司;Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等均購自TaKaRa公司;Taq 10 MasterMix購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司;引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、尿素、胃蛋白酶等購自Sigma公司。

    1. 2 試驗(yàn)方法

    1. 2. 1 PtCP2和PtCP4基因的克隆與分析 按照艾德萊公司的植物全RNA提取試劑盒操作流程提取毛果楊葉片RNA,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。將提取的RNA按照Promega公司的RT-PCR試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過在毛果楊數(shù)據(jù)庫JGI上檢索獲得半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4,根據(jù)基因序列,運(yùn)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物PtCP2(上游引物:5'-ATGTCTCTCAACCTCTCTCTCTTTC-3',下游引物:5'-CTAGAGGGAGTTGGTCTGCACG-3')和PtCP4(上游引物:5'-GTCCAAACCATGGAACGCTTAC-3',下游引物:5'-CACAGCAATCTACTGGGCAG-3'),以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行特定目的片段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(25.0 μL):0.5 μL Ex Taq酶,2.5 μL 10×Ex Taq Buffer,2.5 μL dNTP,上下游引物各1.0 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 15.5 μL。擴(kuò)增程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

    將PCR產(chǎn)物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進(jìn)行回收,將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,培養(yǎng)挑菌后進(jìn)行PCR初步鑒定,將陽性克隆送至北京六合華大基因公司測序。對克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析:使用SignalP 3.0軟件對PtCP2和PtCP4基因的信號(hào)肽序列進(jìn)行預(yù)測;使用ExPASy軟件對PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白酶PtCP2和PtCP4的等電點(diǎn)、分子量等要素進(jìn)行分析預(yù)測;使用MEGA 5.1軟件對蛋白酶PtCP2和PtCP4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建;使用BioEdit軟件將蛋白酶PtCP2和PtCP4與已知RD19A類蛋白酶進(jìn)行氨基酸序列比對。

    1. 2. 2 PtCP2和PtCP4基因的組織表達(dá)分析 以毛果楊的根、莖、葉為試驗(yàn)材料分別提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物PtCP2(上游引物:5'-CTTTAGCGTGGTGTCCCT-3',下游引物:5'-CTCCTCCAATGTATGTTTGC-3')和PtCP4(上游引物:5'-GGAACGCTTACCTCTGCT-3',下游引物:5'-TGACACGACTTGCCTGAT-3'),以各部位cDNA為模板,按SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒操作流程分別對PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)體系(20.0 μL):10.0 μL 2×SuperReal PreMix Plus,上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板0.7 μL,ddH2O 8.3 μL。熒光定量PCR程序: 95 ℃預(yù)變性15 min; 95 ℃ 30 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,然后以0.5 ℃/s的速度升至95 ℃,進(jìn)行61個(gè)循環(huán)。每個(gè)根、莖、葉試驗(yàn)組均設(shè)1個(gè)對照組,對照組采用與試驗(yàn)組相同部位的cDNA為模板,以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增,每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上。

    1. 2. 3 PtCP2和PtCP4基因原核表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá) 用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I對毛果楊PtCP2、PtCP4基因和原核表達(dá)載體pET-30a同時(shí)進(jìn)行雙酶切,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收目的產(chǎn)物,使用T4 DNA連接酶進(jìn)行體外連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,培養(yǎng)挑菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定,獲得pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4表達(dá)載體。PCR鑒定體系(25.0 μL):12.5 μL 2×Taq 10 MasterMix,上、下游引物各1.0 μL,質(zhì)粒1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。雙酶切鑒定體系(20.0 μL):2.0 μL 10×M Buffer,Kpn I 1.0 μL,Xho I 1.0 μL,質(zhì)粒16.0 μL。

    將上述構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,于37 ℃、200 r/min條件下在含有卡那霉素(50 mg/L)的LB中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6,加入經(jīng)抽濾的IPTG溶液(終濃度為0.3 mmol/L),于28 ℃、140 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。取1 mL菌液用SDS-PAGE檢測蛋白條帶,以相同培養(yǎng)條件下未加IPTG菌液為對照,檢測重組蛋白是否在體外表達(dá)。

    1. 2. 4 重組蛋白PtCP2和PtCP4的純化 將獲得的誘導(dǎo)菌液在4 ℃、4000 r/min條件下離心10 min,收集菌體后用Tris緩沖液(300 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris、pH 8.0)重懸,超聲波破碎200次直至菌液澄清,于4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min獲得含有目的蛋白的包涵體。對包涵體蛋白采用包涵體洗滌法進(jìn)行純化,使用包涵體洗滌液(1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100、2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mol/L 尿素、pH 8.0)將包涵體蛋白重懸,置于冰上后于水平搖床上搖動(dòng)20 min,然后4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min,棄去上清液,重復(fù)5次。用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將最終獲得的包涵體蛋白重懸,超聲波破碎50次,4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min,獲得含有重組蛋白的上清液,用SDS-PAGE檢測蛋白純度,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。

    1. 2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的復(fù)性及酶原激活

    測定上一步純化的重組蛋白濃度后,用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將蛋白濃度稀釋至100 ng/μL以下復(fù)性。將稀釋后的重組蛋白依次放入含6、4、2 mol/L尿素的復(fù)性液(含1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽)中,每個(gè)梯度低溫?cái)嚢柰肝? h,經(jīng)2 mol/L尿素復(fù)性后將重組蛋白放入不含尿素的復(fù)性液中繼續(xù)低溫?cái)嚢柰肝? d,期間更換1次復(fù)性液,最后收集蛋白溶液。

    用HAc-NaAc緩沖液(pH 4.0)對復(fù)性蛋白進(jìn)行酸化,酸化環(huán)境為pH 4.5,反應(yīng)時(shí)間分別為30 s、1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、6 h、12 h、1 d和3 d,待酸化完成后加入1 mol/L NaOH中和反應(yīng)體系,終止酸化反應(yīng)。使用SDS-PAGE檢測酸化條帶,對照組為未酸化蛋白。另外,本研究采用組織蛋白酶B催化的方法進(jìn)行酶原激活(Gogiel et al.,2012),在上述酸化體系中加入終濃度為10 μg/mL的組織蛋白酶B,以幫助酶原激活,按照上述時(shí)間梯度進(jìn)行酸化,待酸化完成后,使用1 mol/L NaOH中和反應(yīng)體系,終止酸化反應(yīng);使用SDS-PAGE檢測酸化條帶,對照組分別為未酸化蛋白和組織蛋白酶B。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 PtCP2和PtCP4基因克隆及蛋白序列分析

    以毛果楊cDNA為模板,分別使用PtCP2和PtCP4特異性引物進(jìn)行PCR克隆并測序。結(jié)果(圖1)顯示,PtCP2基因(JGI基因編號(hào)grail3.0001039901)全長1107 bp,編碼368個(gè)氨基酸,通過SignalP 3.0軟件預(yù)測該蛋白信號(hào)肽為21個(gè)氨基酸,去除信號(hào)肽后分子量為38.151 kD,理論等電點(diǎn)為6.11;PtCP4基因(JGI基因編號(hào)grail3.0002061802)全長1104 bp,編碼367個(gè)氨基酸,通過SignalP 3.0軟件預(yù)測該蛋白信號(hào)肽為20個(gè)氨基酸,去除信號(hào)肽后分子量為38.069 kD,理論等電點(diǎn)為6.44。選取木本棉體內(nèi)的已知RD19A類蛋白酶KHG24064和KHG15062與PtCP2、PtCP4進(jìn)行序列比對,結(jié)果(圖2)表明,PtCP2中的C160、H303、N330及PtCP4中的C159、H302、N329組成催化三聯(lián)體,其為木瓜蛋白酶的核心催化殘基。由于PtCP2和PtCP4蛋白結(jié)構(gòu)域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件組成花環(huán)狀結(jié)構(gòu),且蛋白酶結(jié)構(gòu)域中VxNFS或VxNFT元件中有保守的PGS序列(NxS/T),因此可以推論P(yáng)tCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。

    2. 2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

    分別選擇來自木本棉(Gossypium arboreum)、大豆(Glycine soja)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)及菜豆(Phaseolus vulgaris)的RD19A類蛋白酶的物種和基因及分別來自木本棉、大豆、擬南芥、小球藻(Auxenoc-hlorella protothecoides)、桑樹(Morus notabilis)、玉米(Zea mays)及節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)的RD21A類蛋白酶的物種和基因,對毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP2和PtCP4進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析,結(jié)果(圖3)顯示,PtCP2與木本棉RD19A類蛋白KHG15253和KHG24064同源率較高,PtCP4則與木本棉RD19A類蛋白KHG15062同源率較高,此外,其所在的亞組還包括其他所有選取的RD19A類蛋白,由此可以看出PtCP2和PtCP4與其他物種的RD19A類蛋白親緣關(guān)系較近;而在與8類RD21A類蛋白的同源性比較中發(fā)現(xiàn),PtCP2和PtCP4與其親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

    2. 3 PtCP2和PtCP4基因的組織表達(dá)特性分析

    為研究PtCP2和PtCP4基因在不同組織器官的表達(dá)量,分別取毛果楊的根、莖、葉3個(gè)部位的材料提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測,結(jié)果表明,PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,PtCP2基因在葉中的表達(dá)量最高,是內(nèi)參基因β-actin表達(dá)量的3.180倍,根次之,莖中表達(dá)量最低(圖4-A);PtCP4基因則在根中的表達(dá)量最高,為內(nèi)參基因β-actin表達(dá)量的0.285倍,葉次之,莖中表達(dá)量最低(圖4-B);PtCP2基因整體表達(dá)量明顯高于PtCP4基因。

    2. 4 PtCP2和PtCP4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

    由于PtCP2和PtCP4基因中包含信號(hào)肽序列,該序列不能在原核生物中表達(dá),因此需要在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)去除該部分序列。以已克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因?yàn)槟0?,用特異性引物通過PCR擴(kuò)增得到目的片段,大小約1044 bp,與預(yù)期結(jié)果一致(圖5)。將該片段回收,與pMD-18T連接,獲得陽性克隆并測序正確。

    使用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I分別對克隆載體pMD18-T-PtCP2和pMD18-T-PtCP4進(jìn)行酶切獲得目的片段,與表達(dá)載體pET-30a連接,獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒雙酶切電泳檢測結(jié)果(圖6)顯示,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后獲得長度約5400 bp的大片段和1000 bp的小片段,分別與表達(dá)載體pET-30a和目的片段大小相符。

    2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的表達(dá)和純化

    將重組質(zhì)粒pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后體外誘導(dǎo)表達(dá),所得蛋白為包涵體形式。采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化,所得重組蛋白PtCP2和PtCP4去除信號(hào)肽后理論分子量大小分別為38.151和38.069 kD,與His-tag(5.3 kD)結(jié)合后,大小分別約為43.5和43.4 kD(圖7)。

    2. 6 重組蛋白PtCP2和PtCP4的體外酶原激活結(jié)果

    對酶原進(jìn)行體外激活,結(jié)果顯示,在酸性條件下,酶原出現(xiàn)降解,且隨著酸化時(shí)間的延長酶原降解程度增加,在酸化達(dá)24 h后,酶原完全降解,但沒有新的成熟酶條帶產(chǎn)生;在組織蛋白酶B催化條件下,單位時(shí)間內(nèi)酶原降解程度較酸性條件下有所增加,在16 h左右即可完全降解,但同樣沒有成熟酶條帶產(chǎn)生。表明這兩個(gè)蛋白酶不能在本研究酸性條件下完成酶原激活,也不能在組織蛋白酶B催化條件下完成酶原激活,可能需要其他蛋白酶參與其酶原激活過程。

    3 討論

    半胱氨酸蛋白酶主要分為木瓜蛋白酶(Papain)、豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶(Legumain)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和鈣依賴半胱氨酸蛋白酶(Calpain)(Barrett and Rawlings,2001),其中木瓜蛋白酶是種類最多,研究最深入、最透徹的一類(Bar-Ziv et al.,2015)。木瓜蛋白酶家族成員均含有1個(gè)由保守氨基酸殘基組成的催化三聯(lián)體Cys25-His159-Asn175,這一結(jié)構(gòu)也是木瓜蛋白酶家族的分類標(biāo)志之一(閆龍鳳等,2005)。木瓜蛋白酶家族成員主要分為9類:RD21A-like、RD19A-like、CEP 1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THIl-like、SAG12-like、AALP-like和CTB3-like(Ri-chau et al.,2012)。其中,RD19A-like在蛋白結(jié)構(gòu)域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件,蛋白酶結(jié)構(gòu)域存在VxNFS或VxNFT元件且元件中存在保守的PGS序列(NxS/T)。RD19類蛋白酶家族與動(dòng)物組織蛋白酶F相似,可以劃分為RD19A、RD19B和RD19C 3個(gè)亞家族(Babula-Skowrońska et al.,2015)。本研究成功克隆獲得毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4,通過氨基酸序列分析表明PtCP2蛋白中的C160、H303、N330及PtCP4蛋白中的C159、H302、N329與木瓜蛋白酶保持一致,是證明其屬于木瓜蛋白酶家族的重要證據(jù);另外,PtCP2和PtCP4蛋白結(jié)構(gòu)中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件,蛋白酶結(jié)構(gòu)域中存在VxNFS或VxNFT元件且元件中有保守的PGS序列(NxS/T),這些都是PtCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶的重要證據(jù)。

    有研究表明擬南芥的RD系列基因與干旱脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫有密切聯(lián)系(Yang et al.,2011),但對高溫和低溫等脅迫無響應(yīng)。本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和蛋白質(zhì)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)PtCP2、PtCP4和擬南芥AT4G39090基因編碼的RD19A蛋白同屬于RD19A亞家族且具有很高的同源性,由于同一亞家族的基因功能通常相似,因此推測毛果楊PtCP2和PtCP4基因與非生物脅迫相關(guān)。通過組織表達(dá)定量結(jié)果分析,本研究發(fā)現(xiàn)PtCP2和PtCP4基因表達(dá)存在明顯差異,推測這兩個(gè)基因具有不同的生物學(xué)功能。進(jìn)一步檢索楊樹EST數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均在干旱脅迫條件下大量表達(dá),但表達(dá)時(shí)期和表達(dá)量存在顯著差異,表明這兩個(gè)基因可能在參與干旱脅迫應(yīng)答的不同時(shí)期起作用,將是今后基因功能研究的重點(diǎn)方向。

    木瓜蛋白酶的氨基酸序列從N端到C端按其功能可以劃分為3個(gè)區(qū)域:信號(hào)肽序列、前體肽序列和成熟酶序列(Wiederanders,2003)。信號(hào)肽作為引導(dǎo)新生蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的短肽鏈,在木瓜蛋白酶進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后即被切除,蛋白質(zhì)則以一種前體酶的形式存在,不具備活性,前體肽序列則在酶發(fā)揮活性時(shí)被自動(dòng)切除,形成具有活性的成熟酶(Riese and Chapman,2000;Martinez and Diaz,2008)。氨基酸序列分析結(jié)果表明,RD19類蛋白酶家族與動(dòng)物組織蛋白酶F相似,但也有報(bào)道把組織蛋白酶F歸入組織蛋白酶L類(Wex et al.,2000)。有報(bào)道顯示與RD19A類蛋白相似度很高的組織蛋白酶L在弱酸性環(huán)境中易被活化(Fonseca et al.,2012),但新產(chǎn)生的成熟酶在堿性和中性環(huán)境中無法穩(wěn)定存在。因此,本研究選用pH 4.0~5.5作為酸化環(huán)境,同時(shí)在組織蛋白酶B催化條件下對酶原進(jìn)行激活,但經(jīng)酸化后始終無法獲得穩(wěn)定的成熟酶序列。分析原因,可能是RD19A類蛋白酶在進(jìn)行前體肽切除后成熟酶無法在酸性環(huán)境下穩(wěn)定存在,需要自身體內(nèi)異體蛋白酶的催化,有助于穩(wěn)定成熟酶的結(jié)構(gòu),這一部分工作將成為今后的研究重點(diǎn)。

    本研究將PtCP2和PtCP4基因與原核表達(dá)載體pET-30a連接,在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功誘導(dǎo)表達(dá),采用包涵體洗滌法對目的蛋白進(jìn)行純化即可獲得單一的目的蛋白。此外,本研究通過熒光定量PCR對PtCP2和PtCP4基因進(jìn)行組織表達(dá)分析,初步分析了該基因可能的功能。為了更加透徹地研究PtCP2和PtCP4的生物學(xué)功能,下一步將構(gòu)建這兩個(gè)基因的正義表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,并對轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行性狀分析,初步鑒定該基因在PCD過程中的作用,為進(jìn)一步揭示PtCP2和PtCP4在毛果楊體內(nèi)的功能提供參考。

    4 結(jié)論

    本研究克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4,在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá),并經(jīng)包涵體洗滌法純化后獲得重組蛋白PtCP2和PtCP4,為進(jìn)一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學(xué)特征和生理功能打下基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    閆龍鳳,楊青川,韓建國,劉志鵬. 2005. 植物半胱氨酸蛋白酶研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 14(5):11-18.

    Yan L F, Yang Q C, Han J G, Liu Z P. 2005. Summary of cysteine protease in plants[J]. Acta Prataculturae Sinica, 14(5):11-18.

    Ahmad R, Zuily-Fodil Y, Passaquet C, Bethenod O, Roche R, Repellin A. 2014. Identification and characterization of MOR-CP, a cysteine protease induced by ozone and developmental senescence in maize(Zea mays L.) leaves[J]. Chemosphere, 108:245-250.

    Babula-Skowrońska D, Ludwików A, Ciela A, Olejnik A, Cegielska-Taras T, Bartkowiak-Broda I, Sadowski J. 2015. Involvement of genes encoding ABI1 protein phosphatases in the response of Brassica napus L. to drought stress[J]. Plant Molecular Biology, 88(4-5): 445-457.

    Barrett A J, Rawlings N D. 2001. Evolutionary lines of cysteine peptidases[J]. Biological Chemistry, 382(5): 727-733.

    Bar-Ziv A, Levy Y, Citovsky V, Gafni Y. 2015. The Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV) V2 protein inhibits enzymatic activity of the host papain-like cysteineprotease CYP1[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 460(3): 525-529.

    Battelli R, Lombardi L, Picciarelli P, Lorenzi R, Frigerio L, Rogers H J. 2014. Expression and localisation of a senescence-associated KDEL-cysteine protease from Lilium longiflorum tepals[J]. Plant Science, 214:38-46.

    Bernoux M, Timmers T, Jauneau A, Brière C, de Wit P J, Marco Y, Deslandes L. 2008. RD19, an arabidopsis cysteine protease required for RRS1-R-mediated resistance, is relocalized to the nucleus by the Ralstonia solanacearum PopP2 effector[J]. Plant Cell, 20(8): 2252-2264.

    Chen L, Sun L. 2012. Cathepsin B of Cynoglossus semilaevis: identification, expression, and activity analysis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, 161(1):54-9.

    Fonseca F P, Soares-Costa A, Ribeiro A F, Rosa J C, Terra W R, Henrique-Silva F. 2012. Recombinant expression, localization and in vitro inhibition of midgut cysteine peptidase(Sl-CathL) from sugarcane weevil, Sphenophorus levis[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 42(1):58-69.

    Gogiel T, Galewska Z, Romanowicz L. 2012. Differential distribution of cathepsin B in human umbilical cord tissues[J]. Acta Biochimica Polonica, 59(4):679-684.

    Mackey D, Holt B F, Wiig A, Dangl J L. 2002. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis[J]. Cell, 108(6):743-754.

    Martinez M, Diaz I. 2008. The origin and evolution of plant cystatins and their target cysteine proteinases indicate a complex functional relationship[J]. BMC Evolutionary Bio-logy, 8:198.

    McLellan H, Gilroy E M, Yun B W, Birch P R, Loake G J. 2009. Functional redundancy in the Arabidopsis Cathepsin B gene family contributes to basal defence, the hypersensitive response and senescence[J]. New Phytologist, 183(2):408-418.

    Nandana V, Singh S, Singh A N, Dubey V K. 2014. Procerain B, a cysteine protease from Calotropis procera, requires N-terminus pro-region for activity: cDNA cloning and expression with pro-sequence[J]. Protein Expression and Purification, 103:16-22.

    Richau K H, Kaschani F, Verdoes M, Pansuriya T C, Niessen S, Stüber K, Colby T, Overkleeft H S, Bogyo M, Van der Hoorn R A. 2012. Subclassification and biochemical analysis of plant papain-like cysteine proteases displays subfamily-specific characteristics[J]. Plant Physiology, 158(4):1583-1599.

    Riese R J,Chapman H A. 2000. Cathepsins and compartmenta-lization in antigen presentation[J]. Current Opinion in Immunology, 12(1):107-113.

    Wagstaff C, Leverentz M K, Griffiths G, Thomas B, Chanasut U, Stead A D, Rogers H J. 2002. Cysteine protease gene expression and proteolytic activity during senescence of Alstroemeria petals[J]. Journal of Experimental Botany, 53(367):233-240.

    Wan L, Xia Q, Qiu X, Selvaraj G. 2002. Early stages of seed development in Brassica napus: a seed coat-specific cysteine proteinase associated with programmed cell death of the inner integument[J]. Plant Journal, 30(1):1-10.

    Wex T, Levy B, Wex H, Brmme D. 2000. Human cathepsins W and F form a new subgroup of cathepsins that is evolutionary separated from the cathepsin B-and L-like cysteine proteases[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 477:271-280.

    Wiederanders B. 2003. Structure-function relationship in class CA1 cysteine peptidase propeptides[J]. Acta Biochemica Polonica, 50(3):691-713.

    Yang S D, Seo P J, Yoon H K, Park C M. 2011. The Arabidopsis NAC transcription factor VNI2 integrates abscisic acid signals into leaf senescence via the COR/RD genes[J]. Plant Cell, 23(6):2155-2168.

    Zhang D, Liu D, Lv X, Wang Y, Xun Z, Liu Z, Li F, Lu H. 2014. The cysteine protease CEP1, a key executor involved in tapetal programmed cell death, regulates pollen development in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 26(7): 2939-2961.

    (責(zé)任編輯 麻小燕)

    猜你喜歡
    原核表達(dá)
    丹參蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表達(dá)分析
    H7亞型禽流感病毒HA基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性分析
    結(jié)核分枝桿菌Erp蛋白PGLTS的4基序突變體的構(gòu)建
    棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表達(dá)及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
    人FOXA1蛋白的原核表達(dá)、純化及蛋白互作分析
    柑橘CitSERK—LIKE基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
    信號(hào)分子與葉銹菌誘導(dǎo)下小麥病程相關(guān)蛋白1基因的表達(dá)分析
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達(dá)
    ShSAP1的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
    水稻抗白葉枯病基因xa5的原核表達(dá)及蛋白純化
    中文字幕人妻丝袜一区二区| 一级毛片女人18水好多| 国产精品精品国产色婷婷| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av熟女| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一级毛片女人18水好多| 99香蕉大伊视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美日韩一级在线毛片| 色综合站精品国产| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 女同久久另类99精品国产91| 中文字幕av电影在线播放| 操出白浆在线播放| 国产精品九九99| 国产成人系列免费观看| 超碰成人久久| 91老司机精品| av片东京热男人的天堂| 色播亚洲综合网| 国产主播在线观看一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一夜夜www| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品国产亚洲在线| 免费在线观看日本一区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲视频免费观看视频| 欧美日韩精品网址| 国产成人av激情在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av成人一区二区三| 性欧美人与动物交配| 一区二区三区精品91| 91精品三级在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲熟女毛片儿| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 老司机福利观看| 91国产中文字幕| 成人免费观看视频高清| 精品国产一区二区三区四区第35| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久久免费视频了| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产高清有码在线观看视频 | 欧美性长视频在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 一级,二级,三级黄色视频| 97碰自拍视频| 精品久久久精品久久久| www.精华液| 夜夜爽天天搞| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲激情在线av| 国产精品影院久久| 9热在线视频观看99| 波多野结衣巨乳人妻| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久国内视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 美国免费a级毛片| 欧美大码av| 国内精品久久久久久久电影| 免费高清在线观看日韩| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一区二区三区高清视频在线| 搞女人的毛片| 国产精品野战在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av在线播放免费不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 无限看片的www在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产av精品麻豆| 午夜福利一区二区在线看| 日韩免费av在线播放| 757午夜福利合集在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 中文字幕人妻熟女乱码| 桃红色精品国产亚洲av| 大陆偷拍与自拍| 精品国产美女av久久久久小说| 免费看a级黄色片| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日韩大尺度精品在线看网址 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 露出奶头的视频| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 精品一区二区三区av网在线观看| 在线观看午夜福利视频| 又大又爽又粗| 日日干狠狠操夜夜爽| 宅男免费午夜| 两性夫妻黄色片| 国产成人精品无人区| 亚洲精华国产精华精| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 久久伊人香网站| 亚洲色图综合在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 曰老女人黄片| 久久婷婷成人综合色麻豆| 免费看a级黄色片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产一区二区三区综合在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 又大又爽又粗| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲男人的天堂狠狠| xxx96com| 在线国产一区二区在线| 99国产精品一区二区三区| 欧美日韩精品网址| ponron亚洲| 成人三级黄色视频| 18禁国产床啪视频网站| 露出奶头的视频| 亚洲精华国产精华精| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 免费不卡黄色视频| 成人国语在线视频| 伦理电影免费视频| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产精品999在线| 午夜福利,免费看| 日韩视频一区二区在线观看| 久久亚洲真实| 可以在线观看的亚洲视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 91九色精品人成在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久人人精品亚洲av| 黄片小视频在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 禁无遮挡网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产片内射在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产一区二区激情短视频| 满18在线观看网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区三区视频了| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一个人免费在线观看的高清视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 免费在线观看黄色视频的| 操美女的视频在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 性少妇av在线| 9色porny在线观看| 国产免费男女视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av欧美777| 黄色视频,在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 一进一出抽搐动态| √禁漫天堂资源中文www| 久久精品国产综合久久久| 久久香蕉精品热| 美女大奶头视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日本a在线网址| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久伊人香网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 激情视频va一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲专区国产一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美大码av| 搞女人的毛片| 97碰自拍视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| а√天堂www在线а√下载| 69精品国产乱码久久久| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 淫秽高清视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 他把我摸到了高潮在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 在线观看日韩欧美| 伦理电影免费视频| 精品福利观看| 精品人妻1区二区| www.999成人在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲中文字幕日韩| 美女大奶头视频| 男女床上黄色一级片免费看| 色播亚洲综合网| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 咕卡用的链子| 日韩免费av在线播放| 亚洲av成人av| 久久久久久久精品吃奶| e午夜精品久久久久久久| 一级毛片女人18水好多| 久久国产精品影院| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| or卡值多少钱| 久久久国产成人免费| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 真人一进一出gif抽搐免费| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲自拍偷在线| 亚洲无线在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人精品在线电影| 丝袜人妻中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产成人av激情在线播放| av免费在线观看网站| 亚洲自拍偷在线| 露出奶头的视频| 热99re8久久精品国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 国产高清有码在线观看视频 | 精品久久久精品久久久| 91字幕亚洲| 国产精品日韩av在线免费观看 | 丝袜美足系列| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 99国产精品免费福利视频| 十八禁人妻一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品av久久久久免费| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲三区欧美一区| 午夜福利欧美成人| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 香蕉国产在线看| 黄色丝袜av网址大全| 少妇 在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲国产精品成人综合色| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲最大成人中文| 国产在线观看jvid| 黑丝袜美女国产一区| 美女 人体艺术 gogo| 免费在线观看日本一区| 亚洲熟女毛片儿| 午夜福利,免费看| 黄片大片在线免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费av毛片视频| 视频在线观看一区二区三区| 级片在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 久热这里只有精品99| 日韩av在线大香蕉| 成年女人毛片免费观看观看9| 美国免费a级毛片| 久久久国产欧美日韩av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产又爽黄色视频| 亚洲七黄色美女视频| 成人亚洲精品av一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 91成人精品电影| 欧美日韩乱码在线| 大码成人一级视频| 久热爱精品视频在线9| 国产私拍福利视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 9191精品国产免费久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久久国产a免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲av五月六月丁香网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一区福利在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲中文日韩欧美视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美激情久久久久久爽电影 | 精品久久蜜臀av无| 最新美女视频免费是黄的| 国产乱人伦免费视频| 国产私拍福利视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 黄色视频不卡| tocl精华| 黑人操中国人逼视频| 美女大奶头视频| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜久久久久精精品| 一区二区三区激情视频| 久久久久久大精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 无限看片的www在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 1024视频免费在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲无线在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 91精品三级在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日韩黄片免| 午夜福利免费观看在线| 久久草成人影院| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 91国产中文字幕| 色综合婷婷激情| 99re在线观看精品视频| 一区二区三区精品91| 黑人操中国人逼视频| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| www国产在线视频色| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产区一区二久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 长腿黑丝高跟| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲一区高清亚洲精品| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲男人天堂网一区| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲av成人av| 性少妇av在线| 久久国产精品影院| 国产一区二区激情短视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日日夜夜操网爽| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 99国产精品免费福利视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品国产高清国产av| 99在线人妻在线中文字幕| 成熟少妇高潮喷水视频| 999精品在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩有码中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费高清视频大片| 两人在一起打扑克的视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产一区二区激情短视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 91字幕亚洲| 日本 欧美在线| 无限看片的www在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲一区中文字幕在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲avbb在线观看| 亚洲成人久久性| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产欧美网| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 女性生殖器流出的白浆| bbb黄色大片| 亚洲五月色婷婷综合| 成人亚洲精品一区在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美在线一区亚洲| 午夜免费鲁丝| 免费少妇av软件| 成年人黄色毛片网站| 美女国产高潮福利片在线看| 国产一区二区激情短视频| 在线播放国产精品三级| 91字幕亚洲| 18美女黄网站色大片免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 一区二区三区高清视频在线| av超薄肉色丝袜交足视频| av电影中文网址| 亚洲熟妇熟女久久| 99久久综合精品五月天人人| 国产成人欧美| 日本 欧美在线| 一本综合久久免费| 在线永久观看黄色视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇粗大呻吟视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 午夜精品久久久久久毛片777| 97人妻天天添夜夜摸| 精品久久久久久久毛片微露脸| av天堂久久9| 美女午夜性视频免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久久人人人人人| 午夜福利在线观看吧| 亚洲专区字幕在线| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 精品电影一区二区在线| 黄片大片在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费少妇av软件| aaaaa片日本免费| 老司机靠b影院| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产乱人伦免费视频| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久久中文| 国产精品二区激情视频| 级片在线观看| 国产av一区二区精品久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲成人久久性| 青草久久国产| 成人国产综合亚洲| 黄色视频,在线免费观看| 热re99久久国产66热| 欧美日本中文国产一区发布| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 最新在线观看一区二区三区| 18禁观看日本| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲中文字幕日韩| 日本 欧美在线| 成人国产综合亚洲| 精品国产乱码久久久久久男人| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲第一青青草原| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日本欧美视频一区| 美女 人体艺术 gogo| 18禁观看日本| www.www免费av| 国产乱人伦免费视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产免费男女视频| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久久久久中文| 成人免费观看视频高清| 午夜免费鲁丝| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产欧美日韩一区二区三| 久久伊人香网站| 国产高清激情床上av| 成人三级做爰电影| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲成人久久性| tocl精华| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产色视频综合| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜免费激情av| 女同久久另类99精品国产91| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色播亚洲综合网| 国产精品国产高清国产av| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲午夜理论影院| 91成年电影在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 正在播放国产对白刺激| 美女大奶头视频| 操美女的视频在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲全国av大片| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| videosex国产| 成人18禁在线播放| 亚洲成人久久性| 天天添夜夜摸| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲一区中文字幕在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品国产国语对白av| 淫秽高清视频在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩三级视频一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲avbb在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 在线播放国产精品三级| 他把我摸到了高潮在线观看| 9色porny在线观看| 国产精品,欧美在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丁香欧美五月| svipshipincom国产片| 午夜免费观看网址| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄片小视频在线播放| 99精品在免费线老司机午夜| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产99久久九九免费精品| 亚洲无线在线观看| 无限看片的www在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 757午夜福利合集在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 一区在线观看完整版| 自线自在国产av| 十分钟在线观看高清视频www| 免费少妇av软件| 国产精品久久电影中文字幕| 18禁国产床啪视频网站| 久久青草综合色| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产熟女xx| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品国产高清国产av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 多毛熟女@视频| 午夜福利,免费看|