葉底珠各部位中一葉萩堿和別一葉萩堿的含量測定

呂?；?， 李雪晴， 王冉冉， 徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

?

葉底珠各部位中一葉萩堿和別一葉萩堿的含量測定

呂?；ǎ?李雪晴， 王冉冉， 徐凌川*

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

摘要：采用高效液相色譜法測定葉底珠中一葉萩堿和別一葉萩堿在各部位中的含量。結(jié)果表明，一葉萩堿在各部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w根皮>w細根>w枝干皮>w木部>w嫩葉芽(濟南)>w枝葉>w根>w嫩葉芽(臨沂)。別一葉萩堿在各部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w根皮>w細根>w木部>w枝干皮>w根>w嫩葉芽(臨沂)>w嫩葉芽(濟南)>w枝葉。本實驗為葉底珠生藥成分中一葉萩堿和別一葉萩堿的定性和定量測定提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葉底珠；一葉萩堿；別一葉萩堿；高效液相色譜法

葉底珠Securinegasuffruticosa(Pall.)Rehd.為大戟科Euphorbiaceae葉底珠屬Securinega植物，別名葉下珠、狗杏條、黃恨子或一葉萩。作為傳統(tǒng)中藥材，葉底珠根部入藥，有活血舒筋、健脾益腎等功能,用于治療風(fēng)濕腰痛、四肢麻木和小兒疳積等疾病。葉底珠生長在山坡灌叢中及向陽處，在我國東北、華北、江西、浙江、江蘇、河南以及陜西等省區(qū)均有分布[1]。葉底珠植株主要含有以一葉萩堿(securinine)為代表的一葉萩型生物堿(securinega-type alkaloids)類化合物[2-5]。一葉萩堿不僅對脊髓和腦干中樞神經(jīng)具有不同程度的興奮作用，還有一定的抗腫瘤以及肝保護作用[6-8]。目前，對于葉底珠的研究多集中于葉、根以及枝葉部位[8-10]，而對各個部位的成分，尤其是主要成分生物堿的定性與定量方面的研究較少。本研究在前期純化精制一葉萩堿和別一葉萩堿的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法對葉底珠植株各部位中所含一葉萩堿和別一葉萩堿進行含量測定，分析其在各部位的分布規(guī)律，建立葉底珠各部位的質(zhì)量控制方法，為新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料、儀器與試劑

1.1材料

葉底珠植株各部位樣品除臨沂產(chǎn)的嫩葉芽由臨沂某商務(wù)會所提供外，其余樣品均于2014年4月采于山東濟南佛慧山，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為大戟科植物葉底珠Securinegasuffruticosa(Pall.) Rehd.。

1.2儀器

高效液相色譜儀Waters 2695 Separation Module、光電二極管陣列檢測器2998 (美國 Waters 公司)；上皿FA1004電子天平(上海精科天平廠)；CP225D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius 公司)。

1.3藥品與試劑

一葉萩堿、別一葉萩堿對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號130517、130623)；氯仿、無水乙醇(天津四友精細化學(xué)品有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2實驗方法

2.1供試品溶液的制備

精密稱定過40目篩的葉底珠各部位干燥樣品粉末2.5 g，置于60 mL分液漏斗中，加適量的25% NH4OH浸潤1 h，加氯仿50 mL，充分振蕩30 min后置于鐵架臺上靜置過夜分層。取出氯仿層，減壓蒸餾揮去氯仿，殘渣加無水乙醇溶解定容至50 mL容量瓶，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

2.2對照品溶液的制備

分別取一葉萩堿和別一葉萩堿對照品約0.14、0.20 mg，精密稱定，用無水乙醇溶解定容至10 mL，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，即得。

2.3色譜條件的選擇

色譜柱：Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃； 流動相：甲醇:0.1% 三乙胺水溶液(50:50，V/V)；進樣量：10 μL。

2.4線性關(guān)系考察

取2.2項下的一葉萩堿和別一葉萩堿對照品溶液，分別依次進樣1、5、10、15、20 μL，按照2.3項下的色譜條件測定，以進樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸后得回歸方程。一葉萩堿含量與峰面積關(guān)系回歸方程：y=7×106x-973 023 (R2=0.999 7，n=5)；別一葉萩堿含量與峰面積關(guān)系回歸方程：y=6×106x-882 273 (R2=0.999 9，n=5) 。實驗表明，在一葉萩堿和另一葉萩堿進樣量分別為0.140 μg～2.110 μg，0.170 μg～3.700 μg范圍內(nèi)，含量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5加樣回收率實驗

取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的一葉萩堿和別一葉萩堿對照品，按照2.1供試品溶液的制備方法進行制備，測得一葉萩堿和別一葉萩堿的平均回收率分別為99.8%、99.6%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%、0.3%。

2.6精密度實驗

分別取一葉萩堿和別一葉萩堿對照品溶液，重復(fù)測定6次，結(jié)果一葉萩堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，別一葉萩堿的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實驗

取同一濃度的一葉萩堿和別一葉萩堿對照品溶液各一份，分別于0、2、4、8、16、24 h精密吸取10 μL進樣，測得一葉萩堿和別一葉萩堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.3%、0.4%。表明在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3實驗結(jié)果

樣品各部位與標(biāo)準(zhǔn)品一葉萩堿和別一葉萩堿的HPLC圖見圖1～10。各部位一葉萩堿和別一葉萩堿在各部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)詳見表1。由表1可以看出，一葉萩堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w根皮>w細根>w枝干皮>w木部>w嫩葉芽(濟南)>w枝葉>w根>w嫩葉芽(臨沂)。別一葉萩堿在各部位的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w根皮>w細根>w木部>w枝干皮>w根>w嫩葉芽(臨沂)>w嫩葉芽(濟南)>w枝葉。

表1　葉底珠植株各部位一葉萩堿和別一葉萩堿的含量測定

圖1　一葉萩堿對照品HPLC圖Fig.1　HPLC analysis of securinine standard

圖2　別一葉萩堿對照品HPLC圖Fig.2　HPLC analysis of allosecurinine standard

圖3　樣品1(根)的HPLC圖Fig.3　HPLC analysis of sample 1 (root)

圖4　樣品2(細根)的HPLC圖Fig.4　HPLC analysis of sample 2 (fine root)

圖5　樣品3(根皮)的HPLC圖Fig.5　 HPLC analysis of sample 3 (root bark)

圖6　樣品4(木部)的HPLC圖Fig.6　HPLC analysis of sample 4 (xylem)

圖7　樣品5(枝葉)的HPLC圖Fig.7　HPLC analysis of sample 5 (branches and leaves)

圖8　樣品6(枝干皮)的HPLC圖Fig.8　HPLC analysis of sample 6 (limb skin)

圖9　樣品7(嫩葉芽臨沂)的HPLC圖Fig.9　HPLC analysis of sample 7 (bud from Linyi)

圖10　樣品8(嫩葉芽濟南)的HPLC圖Fig.10　HPLC analysis of sample 8 (bud from Jinan)

4討論

本實驗以一葉萩堿和別一葉萩堿為研究對象，采用高效液相色譜法對葉底珠各部位樣品進行含量測定，得到不同部位的一葉萩堿和別一葉萩堿的含量(表1)，該方法為葉底珠各部位的生物堿含量測定提供了依據(jù)。

由測定結(jié)果可見，根皮中一葉萩堿和別一葉萩堿的含量最高，其次是細根，這一結(jié)果也驗證了中藥以根部入藥的原因。同時，可依據(jù)該數(shù)據(jù)確定適宜的藥用部位，從而達到較好的治療效果。嫩葉芽中一葉萩堿和別一葉萩堿的含量較低，藥用價值相對較小，可以選擇優(yōu)先利用葉底珠根部入藥。在濟南和臨沂分別采收的嫩葉芽一葉萩堿含量差異較大，別一葉萩堿含量差別不大，由此也為道地藥材生產(chǎn)地的選擇提供了依據(jù)。該實驗為葉底珠生藥成分中一葉萩堿和別一葉萩堿的含量測定和質(zhì)量控制提供了有效依據(jù)，并為其資源開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻:

[1]國家中醫(yī)藥管理局. 中華本草[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 3669-3676.

[2]王英, 李茜, 葉文才, 等. 一葉萩的化學(xué)成分[J]. 中國天然藥物, 2006, 4 (4): 260-263.

[3]屈志偉, 張均田. 一葉萩堿對5種神經(jīng)遞質(zhì)受體和蛙脊髓膜電位的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1987, 22(4): 305-307.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn): 化學(xué)藥品及制劑第一冊[S]. 北京: 北京科技出版社, 1989: 142-143.

[5]吳海燕, 周金云. 一葉萩的化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29 (8): 535-536.

[6]劉毅, 岳志華, 張娜, 等. 一葉萩堿的研究進展[J]. 中國藥事, 2009, 23 (8): 817-818.

[7]陸小娟. 葉底珠葉化學(xué)成分的研究[D]. 吉林: 吉林大學(xué), 2010.

[8]賁亮, 郭偉康, 袁紅艷, 等. 葉底珠枝葉水提物對小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 四川中醫(yī), 2010, 28 (2): 25-26.

[9]LI M D, HAN S W, ZHANG G，et al. Antiproliferative activity and apoptosis-inducing mechanism of L-securinine on human breast cancer MCF-7 cells[J]. Die Pharmazie,2014, 69 (3): 217-223.

[10]ZHANG G, LI M D, HAN S W，et al. Induction of human chronic myeloid leukemia K562 cell apoptosis by virosecurinine and its molecular mechanism[J]. Molecular Medicine Reporis, 2014, 10 (5): 2365-2371.

Content determination of securinine and allosecurinine from every section ofSecurinegasuffruticosa(Pall.)Rehd.

Lü Hai-hua,LI Xue-qing,WANG Ran-ran,XU Ling-chuan*

(School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Abstract∶We employed HPLC to determine the content of securinine and allosecurinine from every section of Securinega suffruticosa.Results show that securinine content is wroot bark>wfine root>wlimb skin>wxylem>wbud (jinan)>wbranches and leaves>wroot>wbud (linyi).Allosecurinine content is wroot bark>wfine root>wxylem>wlimb skin>wroot>wbud (linyi)>wbud (jinan)>wbranches and leaves.The experiments provide scientific reference for qualitative and quantitative determination of securinine and allosecurinine from Securinega suffruticosa.

Key words∶Securinega suffruticosa(Pall.) Rehd.; securinine; allosecurinine; HPLC

中圖分類號：R284.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)02-0009-05

作者簡介：呂海花(1988-)，女，碩士，研究方向為生藥學(xué)。Email：15589907463@163.com*通訊作者,徐凌川，教授。Email：xulingchuan518@sina.com

收稿日期：2015-08-24

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.02.003

【中藥與天然活性產(chǎn)物】