Zn2+配位雙模板印跡聚合物的制備表征及同時萃取升麻中的阿魏酸和咖啡酸

王素素，張月，李輝，（吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 46000；植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首46000）

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Zn2+配位雙模板印跡聚合物的制備表征及同時萃取升麻中的阿魏酸和咖啡酸

王素素1，張月1，李輝1，2
（1吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000；2植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南 吉首416000）

摘要：以Zn2+-阿魏酸-咖啡酸配合物為模板制備了雙分子印跡聚合物，優(yōu)化了制備條件，用傅里葉紅外光譜和掃描電鏡對分子印跡聚合物進行結(jié)構(gòu)表征，測試了分子印跡聚合物的吸附特性，探討了分子印跡聚合物固相萃取應(yīng)用效能并對萃取條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當預(yù)反應(yīng)混合液中金屬離子、模板總量（阿魏酸-咖啡酸摩爾比為2∶3）、功能單體及交聯(lián)劑用量比為1∶1∶3∶30（摩爾比）時，所得印跡聚合物對兩種模板（阿魏酸和咖啡酸）均具有最好的吸附性能，吸附量分別達51.12mg/g和70.26mg/g。吸附動力學(xué)測試表明吸附3h，分子印跡聚合物可達到吸附平衡。用分子印跡聚合物進行固相萃取時，優(yōu)化的淋洗過程為1.00mL H2O、1.00mL甲醇-H2O (3/7，體積比)及1.00mL甲醇-H2O-ACN (4/4/2，體積比)，洗脫溶劑為2.00mL甲醇。在優(yōu)化條件下，分子印跡聚合物可同時選擇富集升麻初提液中的阿魏酸和咖啡酸，二者回收率分別為92.67％和95.42％，而且產(chǎn)品中雜質(zhì)少于用硅膠萃取所得產(chǎn)品。

關(guān)鍵詞：阿魏酸；咖啡酸；復(fù)合模板；分子印跡聚合物；固相萃取

第一作者：王素素（1988—），女，研究生，研究方向為生命科學(xué)中的分離分析新方法。E-mail 545197163@qq.com。聯(lián)系人：李輝，教授，研究方向為生命科學(xué)中的分離分析新方法。E-mail lihuijsdx@163.com。

分子印跡技術(shù)旨在構(gòu)造對目標化合物具有高選擇性甚至專一結(jié)合能力的超分子化合物[1]，由于其中的結(jié)合位點與目標分子在形狀、大小及化學(xué)功能基方面的匹配性，分子印跡聚合物可用于對復(fù)雜體系中目標化合物的選擇富集甚至專一識別[2]。迄今，分子印跡技術(shù)已廣泛應(yīng)用在固相萃取、色譜分離、傳感技術(shù)、免疫分析及模擬酶催化等領(lǐng)域[3-7]。在過去關(guān)于分子印跡的大多數(shù)研究中，主要集中在對單一模板的印跡制備與分子識別，這些研究顯示了單一模板印跡聚合物較高的分子識別選擇性[8-11]。然而由于印跡識別的交叉選擇作用，印跡位點除對模板分子顯示高選擇識別能力外，還對其結(jié)構(gòu)類似物具有一定的選擇結(jié)合能力，甚至在某些情況下使用虛擬模板印跡聚合物對目標化合物進行選擇富集[12-13]，從而大大擴展了分子印跡聚合物的應(yīng)用范圍。利用幾種結(jié)構(gòu)相似化合物為模板制備的多模板分子印跡聚合物保留了各化合物的功能基團、大小及分子形狀信息，因而對多種模板分子具有預(yù)定的選擇識別作用。張路等[14]用三聚氰胺和雙氰胺混合物為模板制備的雙分子印跡聚合物，對兩種模板分子的印跡效應(yīng)遠高于各自為模板的分子印跡聚合物。王麗敏等[15]制備的雙模板分子印跡聚合物對模板的吸附率是單模板分子印跡聚合物的3.6倍，且對模板分子具有更高的選擇性。TAO等[16]以氧四環(huán)素和金霉素為模板制備的雙分子印跡聚合物對四環(huán)素類化合物具有選擇識別及固相萃取能力。基于此，可選擇某一類化合物（如多酚類、生物堿類、黃酮類等）中幾種代表性化合物的混合物作模板制備多模板分子印跡聚合物，并利用其對多種模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物的交叉選擇識別性實現(xiàn)對這類化合物的同時富集和選擇分離。這對藥用植物活性部位的選擇富集和分離及新藥開發(fā)均具有重要應(yīng)用價值。

升麻為一種辛涼解表中藥，性甘味辛，具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽氣之功效。臨床上常用于治療風(fēng)熱頭痛、咽喉腫痛及久瀉脫肛等病癥[17]。升麻中的苯丙酸類成分主要有咖啡酸和阿魏酸（其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示）等，前者具有抗菌、抗病毒、解毒及抗凝血的作用；阿魏酸可抑制血小板聚集、抗血栓形成及調(diào)節(jié)人體免疫等功效[18-20]。利用升麻中的咖啡酸及阿魏酸等苯丙素類成分可開發(fā)新型抗炎藥物，但同時高效選擇提取升麻中的這些苯丙素類化合物仍是分離和純化領(lǐng)域的難題。常規(guī)的溶劑提取及樹脂分離選擇性不高，難以控制條件實現(xiàn)對植物活性部位的同時選擇萃取[21]。采用多種同類化合物為模板分子，通過構(gòu)造與之相匹配的印跡識別位點，可以實現(xiàn)分子印跡聚合物選擇富集多種同類化合物[22-23]。目前，還未見阿魏酸-咖啡酸復(fù)合模板分子印跡制備及應(yīng)用的報道。本研究擬以阿魏酸和咖啡酸作為模板分子制備雙模板分子印跡聚合物，并考察所得印跡材料對升麻中阿魏酸和咖啡酸同時選擇萃取能力，以期開發(fā)新的固相萃取方法實現(xiàn)對升麻中幾種苯丙素類化合物的同時富集和分離分析，為苯丙素類新型抗炎藥物開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

圖1　阿魏酸和咖啡酸的分子結(jié)構(gòu)

1　實驗部分

1.1試劑與材料

阿魏酸（FA，99％）、咖啡酸（CA，98％）、4-乙烯基吡啶（4-VP）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）購自阿拉丁化學(xué)有限公司；分析純的偶氮二異丁腈（AIBN）、乙腈（ACN）、甲醇、乙酸和二甲基亞砜（DMSO）購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司；分析純的乙酸鋅和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；硅膠（200目）購自青島海洋化學(xué)試劑廠。水為二次蒸餾水，使用前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

升麻藥材為市售品，經(jīng)鑒定為正品。

升麻樣品溶液的制備：稱取20.00g升麻樣品于60℃干燥后，粉碎成細粉并過100目篩。精密稱取生藥粉末1.00g，置錐形瓶中，然后加入 0.50mol/L NaOH 溶液 10.00mL，超聲提取 20min，冷卻后過濾，濾液用稀 HCl 調(diào) pH值為2.0，然后用5.0mL乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，減壓蒸餾脫除溶劑后，用甲醇溶解并定容至 25.00mL，即得升麻樣品溶液。

1.2設(shè)備和儀器

LC2010-AHT型高效液相色譜，日本島津公司；S-3400掃描電鏡，日本島津公司；IR-Affinity-1 傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；3H-2000BET-A氮吸附比表面測定儀，貝士德儀器科技(北京)有限公司；電子天平（精確到0.01mg），上海民橋精密科技有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DF-101S集熱式加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；KQ-250E 超聲振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3分子印跡聚合物的制備

準確稱取15.52mg 阿魏酸、21.60mg 咖啡酸和36.69mg乙酸鋅溶于6.00mL乙腈-二甲基亞砜（5/1，體積比，下同）混合溶液中，室溫震蕩10min，加入63.08mg功能單體4-VP，震蕩30min，再加入1.189g交聯(lián)劑EDMA和30.00mg的引發(fā)劑AIBN，充分混合后，轉(zhuǎn)入20mL圓底燒瓶中，超聲脫氣15min，通入氬氣15min，密封。將圓底燒瓶放入60℃恒溫水浴鍋中聚合反應(yīng)24h。將所得的塊狀聚合物粉碎，過200目篩后，用20mL丙酮沉降4次，去除上層懸浮小顆粒，過濾，將得到的聚合物用20.0mL 0.10mmol/L的EDTA溶液浸泡2次（每次2h）和20.0mL去離子水浸泡2次（每次2h），以除去金屬離子及溶劑分子，過濾后，再將聚合物放入索氏提取器中，用甲醇-乙酸（9/1）混合溶液回流提取24h，以除去模板分子，然后用甲醇浸泡2次（每次2h），除去殘余溶劑，過濾后的固體放入真空干燥箱于60 ℃中干燥24 h，即得分子印跡聚合物，放于干燥器中備用。

非印跡聚合物（NIP）的制備過程與印跡聚合物的制備過程一樣，但不加模板分子。按表1改變兩種模板的比例及功能單體的用量，制得一系列分子印跡聚合物MIP1～MIP8和非印跡聚合物NIP1～NIP2。

表1　雙模板分子印跡聚合物的制備

1.4吸附動力學(xué)

準確稱取分子印跡聚合物10.00mg于磨口錐形瓶中，加入10.00mL濃度為0.10mg/mL阿魏酸或咖啡酸乙腈溶液，每間隔0.50h，用2.0mL注射器取樣0.20mL并用針頭過濾器過濾，濾液用高效液相色譜分析，按方程(1)計算模板分子的吸附量qe（mg/g）。

其中，C0為底物的初始濃度，mg/mL；C'為任意時刻的底物濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；W為吸附劑的質(zhì)量，g。

1.5分子印跡固相萃取

1.5.1分子印跡固相萃取柱的制備

稱取150.00mg 聚合物MIP3均勻裝填到體積為3.00mL帶有濾板的聚丙烯固相萃取空柱中，依次用5.00mL甲醇-乙酸（9/1）溶液，5.00mL甲醇溶液，5.00mLACN溶液及5.00mL去離子水進行活化處理后，備用。

1.5.2樣品溶液的裝載

取1.00mL樣品溶液，裝入分子印跡固相萃取柱中，收集流出液并用HPLC檢測目標化合物是否泄漏。

1.5.3洗滌和洗脫

將吸附有目標化合物的分子印跡聚合物柱，按照表2所設(shè)計的8種方法分別進行洗滌和洗脫，每種方法設(shè)計了3個洗滌步驟和1個洗脫步驟。

1.6高效液相色譜分析

高效液相色譜分析在C18柱（4.6mm×150mm，5mm，依利特分析儀器有限公司）上進行。流動相為甲醇-水-乙酸（40/57/3）混合溶液，流速為0.70mL/min，檢測波長為323 nm，進樣量為10 μL，柱溫為30℃。用標準曲線法進行定性和定量分析。

表2　分子印跡固相萃取方法及洗脫過程

2　結(jié)果與討論

2.1分子印跡聚合物的制備及條件優(yōu)化

以乙腈-二甲基亞砜混合液為溶劑（5/1），阿魏酸與咖啡酸混合物為模板，采用金屬離子配位印跡法制備了雙模板印跡聚合物。固定金屬離子（Zn2+）和模板的總量分別為0.2mmol，改變2種模板分子的摩爾比及功能單體的用量，制備了6種雙分子印跡聚合物（MIP1-6）。同時還制備了2種單模板印跡聚合物（MIP7-8）和2種非印跡聚合物（NIP1-2）。制備時各單體用量如表1所示。

2.1.1優(yōu)化功能單體用量

以阿魏酸和咖啡酸的吸附量為指標，改變功能單體的用量分別為0.60mmol和1.20mmol，所得分子印跡聚合物（MIP1-6）對2種模板的吸附量如圖2所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，當其他條件相同時，功能單體的用量為0.6mmol（即模板與功能單體摩爾比為1∶3）時，制備的分子印跡聚合物對兩種模板吸附量最大。而當功能單體用量為1.2mmol，即模板與功能單體用量比為1∶6時，吸附量反而較低。這種因功能單體用量大而致使分子印跡聚合物吸附量低的現(xiàn)象可能是由于功能單體發(fā)生了自身締合的緣故。功能單體發(fā)生分子締合后，印跡位點無法準確形成并固定，引起特異性識別位點數(shù)目降低及傳質(zhì)阻力增加，從而最終導(dǎo)致聚合物吸附量下降。同樣的情況在文獻[24]中也見報道。另外，圖2也顯示了2種單模板印跡聚合物（MIP7～MIP8）和非印跡聚合物（NIP1～NIP2）對2種模板分子的靜態(tài)吸附量。均存在因功能單體用量增加而聚合物吸附量降低的現(xiàn)象。因此模板與功能單體用量比為1∶3。

圖2　阿魏酸及咖啡酸在聚合物上的吸附量及標準偏差（n=3）

2.1.2優(yōu)化兩種模板分子的用量比

固定模板分子總量和功能單體用量分別為0.20mmol和0.60mmol，改變咖啡酸與阿魏酸的摩爾比分別為1∶1、3∶2和2∶3，制得了3種雙分子印跡聚合物MIP1、MIP3和MIP5（參見表1）。通過比較3種分子印跡聚合物對2種模板的吸附量（圖3），發(fā)現(xiàn)MIP3對兩種模板的吸附量最大，對阿魏酸、咖啡酸的吸附量分別為51.12mg/g和70.26mg/g。這表明模板分子的結(jié)構(gòu)和用量對印跡位點的形成具有重要影響。過去，作者課題組采用沉淀聚合法制備咖啡酸或綠原酸印跡微球的過程中，也曾發(fā)現(xiàn)咖啡酸易于得到均勻微球，而在同樣的條件下，綠原酸則不能[25]。

2.2雙模板印跡聚合物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1紅外光譜分析

采用KBr壓片法，用傅里葉變換紅外光譜儀在4000～400cm?1范圍測試了阿魏酸、咖啡酸、雙模板印跡聚合物MIP3及非印跡聚合物NIP1的紅外光譜，結(jié)果如圖4所示。對阿魏酸，3438cm?1為—O —H伸縮振動吸收，3017cm?1為甲基的C—H伸縮振動吸收，1692cm?1為C=O伸縮振動吸收，1624cm?1為C=C雙鍵伸縮振動吸收；對咖啡酸，3422cm?1為—O—H伸縮振動吸收，3230cm?1為=C—H伸縮振動吸收，1645cm?1為C=O伸縮振動吸收，1620cm?1為C=C雙鍵伸縮振動吸收；對雙模板印跡聚合物，3614cm?1和 3442cm?1處的吸收峰分別為—N—H和—O—H伸縮振動，2958cm?1處的吸收峰分別為甲基中—C—H的對稱伸縮振動，1733cm?1處的吸收峰為—C=O伸縮振動，1641cm?1處的吸收峰為—C=C的伸縮振動，1461cm?1處的吸收峰為吡啶環(huán)的—C=N伸縮振動，1263cm?1和1163cm?1處的吸附峰分別是—C—O—C的對稱和不對稱伸縮振動。這些紅外吸收峰的形成及吸收位置的變化表明了印跡位點的有效生成。對非印跡聚合物NIP1，3634cm?1和3448cm?1處的吸收峰分別為—N—H和—O—H伸縮振動，2991cm?1處的吸收峰分別為甲基中—C—H的對稱伸縮振動，1733cm?1處的吸收峰為—C=O伸縮振動，1601cm?1處的吸收峰為—C=C的伸縮振動，1461cm?1處的吸收峰為吡啶環(huán)的—C=N伸縮振動，1263cm?1和1163cm?1處的吸附峰分別是—C—O—C的對稱和不對稱伸縮振動，這些紅外吸收主要來自功能單體、交聯(lián)劑及溶劑分子等。

圖3　雙分子印跡聚合物MIP1、MIP3及MIP5對阿魏酸和咖啡酸的吸附量（n=3）

圖4　阿魏酸、咖啡酸、雙模板印跡聚合物MIP3及非印跡聚合物NIP1的紅外光譜圖

2.2.2電鏡分析和比表面測試

圖5　分子印跡聚合物MIP3(a)及非印跡聚合物NIP1(b)的掃描電鏡圖

圖5為雙模板印跡聚合物MIP3及非印跡聚合物NIP1的掃描電鏡圖，可以觀察到MIP3的表面粗糙，結(jié)構(gòu)疏松并有很多微小孔穴，這些孔穴有利于分子印跡聚合物的表面吸附；而非印跡聚合物NIP1結(jié)構(gòu)致密，表面較為平整光滑。圖6給出了分子印跡聚合物MIP3和非印跡聚合物NIP1的比表面測定結(jié)果.顯然分子印跡聚合物的比表面積（82.7176m2/g）比非印跡聚合物（18.7022m2/g）要大許多。比表面積越大，越有利于吸附，因此分子印跡聚合物的吸附量高于非印跡聚合物（見圖2）。

圖6　聚合物的比表面積測試

2.3分子印跡固相萃取模擬樣品溶液

分別測試了分子印跡固相萃取阿魏酸和咖啡酸模擬樣品溶液的效能。將阿魏酸和咖啡酸模擬樣品溶液上樣后，按照表2所設(shè)計的8種洗脫方法分別進行洗滌和洗脫，每種方法設(shè)計了3個洗滌步驟和1個洗脫步驟。8種洗脫方法中各洗滌和洗脫步驟的產(chǎn)品回收率如表3所示。從中可知，對2種目標化合物而言，方法8在選擇性和回收率方面均最好。因此，洗滌步驟的優(yōu)化洗滌溶劑為1mL水、1mL（甲醇/水，3/7）和5mL（甲醇/水/乙腈，4/4/2）。再用2mL甲醇洗脫目標產(chǎn)物。在優(yōu)化條件下，分子印跡固相萃取阿魏酸和咖啡酸的回收率分別為101.3％ 和105.4％。

2.4吸附動力學(xué)

圖7給出了雙模板印跡聚合物MIP3對阿魏酸[圖7(a)]和咖啡酸[圖7(b)]的吸附量隨時間的變化關(guān)系。從圖7(a)可知，在2.5h前，分子印跡聚合物對阿魏酸的吸附量隨著時間而迅速增加，吸附速率最快，這是因為吸附剛開始時，特異性和非特異性位點均未飽和，模板分子迅速占據(jù)印跡位點的原故；之后，吸附量緩慢增加；3h后吸附量幾乎不再增加，這是由于印跡位點幾乎被模板分子所占據(jù)，達到了吸附平衡狀態(tài)，這表明復(fù)合模板印跡聚合物對阿魏酸分子較快的吸附動力學(xué)。分子印跡聚合物對咖啡酸的吸附量隨時間的變化規(guī)律與此相似。而非印跡聚合物對2種模板分子的吸附量則隨時間延長而緩慢增加，需要較長時間才能達到吸附平衡。

2.5樣品應(yīng)用

表3　分子印跡固相萃取阿魏酸及咖啡酸模擬樣品溶液

在優(yōu)化條件下，用分子印跡固相萃取柱提取升麻樣品溶液。獲得的產(chǎn)品經(jīng)減壓蒸餾脫除溶劑后，再溶解在甲醇溶液中，并用HPLC測定，得到色譜圖如圖8所示。圖8(a)為咖啡酸與阿魏酸對照品的液相色譜圖，咖啡酸的保留時間是3.67min，阿魏酸的保留時間是5.48min。圖8(b)為產(chǎn)品的色譜圖，可以發(fā)現(xiàn)升麻樣品溶液中的阿魏酸和咖啡酸，通過分子印跡固相萃取得到了選擇富集，阿魏酸和咖啡酸的回收率分別為92.67％和95.42％。此外，為了評價分子印跡聚合物的選擇富集能力，測試了在優(yōu)化洗脫條件下[洗滌溶劑為1mL水、1mL甲醇/水(3/7) 和5mL甲醇/水/乙腈(4/4/2)；洗脫溶劑為2mL甲醇]，硅膠固相萃取升麻樣品溶液所得產(chǎn)品的高效液相色譜圖，示于圖8(c)中。比較圖8(b)和8(c)，發(fā)現(xiàn)分子印跡萃取的產(chǎn)品雜質(zhì)較少，而硅膠萃取所得產(chǎn)物雜質(zhì)較多，這是由分子印跡聚合物對模板分子的選擇保留性能所決定的。利用雙模板分子印跡聚合物對模板的選擇富集性能也可用于選擇脫除汽油中的苯并噻吩和二苯并噻吩[26]。

圖7　雙模板分子印跡聚合物MIP5對阿魏酸及咖啡酸的吸附動力學(xué)

3　結(jié)論

以Zn2+-阿魏酸-咖啡酸配合物為模板分子，控制阿魏酸-咖啡酸物質(zhì)的量比為2∶3，調(diào)節(jié)預(yù)反應(yīng)混合液中金屬離子、模板分子、功能單體及交聯(lián)劑用量比為1∶1∶3∶30（摩爾比），成功制備了阿魏酸-咖啡酸雙分子印跡聚合物。所得印跡聚合物對阿魏酸和咖啡酸均具有較快的吸附動力學(xué)，平衡吸附量分別達51.12mg/g和70.26mg/g。分子印跡固相萃取的優(yōu)化洗滌溶劑為1.00mLH2O、1.00mL甲醇-H2O (3/7)及1.00mL甲醇- H2O-ACN (4/4/2)，然后用2.00mL甲醇洗脫目標化合物。該分子印跡聚合物可用于對升麻樣品中阿魏酸和咖啡酸的選擇富集，二者回收率分別為92.67％和95.42％。

圖8　咖啡酸、阿魏酸對照品、MIP-SPE萃取產(chǎn)品及硅膠固相萃取產(chǎn)品的高效液相色譜圖

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Preparation and characterization of Zn2+-bi-templates imprinted polymers for the simultaneous extraction of ferulic acid and caffeic acid in Rhizoma Cimicifugae

WANG Susu1，ZHANG Yue1，LI Hui1，2
（1College of Chemistry and Chemical Engineering，Jishou University，Jishou 416000，Hunan，China；2Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Utilization，Jishou University，Jishou 416000，Hunan，China）

Abstract：A group of bi-templates imprinted polymers (MIPs) was synthesized using Zn2+-ferulic acid-caffeic acid complex as the template. The preparation conditions were optimized. Structural characterizations were performed using FTIR and SEM and the adsorption capacity was tested. Also，the applicability of this MIP in the solid phase extraction was explored after the washing and elution conditions were optimized. Results indicated that when the molar ratio of Zn2+-two templates (the molar ratio of ferulic acid to caffeic acid was 2∶3)-functional monomer-cross linker was 1∶1∶3∶30 in the pre-polymerization mixture，the obtained imprinted polymer possessed the highest adsorption capacity toward two templates，with a value of 51.12mg/g for ferulic acid and 70.26mg/g for caffeic acid. The adsorption equilibrium can be reached within 3h. The optimized conditions for this MIPsphase extraction were 1.00mL H2O，1.00mL methanol- H2O mixture (3/7，volume ratio) and 1.00 mL methanol-H2O-acetonitrile mixture(4/4/2，volume ratio) for the washing procedure and 2.00 mL methanol for the elution one. This MIP revealed selective enrichment capability toward ferulic acid and caffeic acid in the crude extract of Rhizoma Cimicifugae，with recovery rates of 92.67％ and 95.42％ respectively under the optimized conditions. The product contains less impurities than that obtained by silica solid phase extraction.

Key words：ferulic acid; caffeic acid; mixed-templates; molecularly imprinted polymers; solid phase extraction

中圖分類號：TQ 31

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–1132–08

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.026

收稿日期：2015-09-14；修改稿日期：2015-10-27。

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（21077042）、湖南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃、吉首大學(xué)研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基地開放項目（2014KFXM02）及吉首大學(xué)研究生專項（37）。