食品中偶氮類合成色素的檢測方法研究進(jìn)展

王興等

摘 要：食品在加工的過程中容易丟失原本的顏色，食品加工者為了使食物看起來更美味，向其中添加廉價(jià)的合成色素。而在許多國家因該色素可能存在對人體的危害，禁止在食品中添加偶氮類合成色素，并嚴(yán)格監(jiān)管該類食品在國內(nèi)的流通及進(jìn)出口，監(jiān)管部門采用高靈敏度和高選擇性的分析方法進(jìn)行監(jiān)測，以確保食品的質(zhì)量安全。本文將介紹食品行業(yè)中對于添加偶氮類合成色素的各種分析技術(shù)，并對不同的提取方法做了簡要的描述。

關(guān)鍵詞：偶氮 色素 固相萃取 高效液相色譜 酶聯(lián)免疫

1 簡介

偶氮類合成色素，被廣泛的應(yīng)用在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域，其種類有很多，熟知的有蘇丹紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅等，而這些物質(zhì)在體內(nèi)可被還原為芳香胺類物質(zhì)，從而對DNA造成氧化損傷[1]；同時(shí)色素在制作的過程中難免摻雜有砷、鉛、鎘、苯酚等雜質(zhì)。目前已有不少研究發(fā)現(xiàn)了偶氮類色素的毒性作用，如使肝細(xì)胞生長異常[2]，影響酯酶同工酶的表達(dá)[3]以及致突變作用[4]等，因此多數(shù)偶氮色素已被禁止添加到食物中。我國2014年最新頒布的《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB2760-2014）》中對允許使用的檸檬黃、胭脂紅等11種偶氮類色素在食品中的限量及使用范圍做了明確的規(guī)定，嚴(yán)禁超量或超范圍添加。

2005年3月4日，北京檢出亨氏某批號(hào)的辣椒醬中含有蘇丹紅I。同年，著名連鎖快餐品牌肯德基的調(diào)味料中檢出蘇丹紅I，該調(diào)味料曾被使用在多種產(chǎn)品上，不久，這些產(chǎn)品在國內(nèi)所有肯德基餐廳內(nèi)全部停售，并全部銷毀。2012年，有關(guān)部門發(fā)現(xiàn)紅牛飲料配料中含有國家不允許在該飲料中使用的偶氮類合成色素胭脂紅。

2015年，山東省針對零食的專項(xiàng)抽檢，發(fā)現(xiàn)多數(shù)不合格食品檢出含有檸檬黃、日落黃等合成色素。山西省發(fā)布的食品安全監(jiān)督抽檢公告顯示，在糕點(diǎn)及熟肉制品等中檢出違規(guī)使用的日落黃、檸檬黃、胭脂紅。國家食藥監(jiān)總局在抽檢調(diào)味品時(shí)發(fā)現(xiàn)，江蘇一家公司生產(chǎn)的紅燒醬汁檢出的檸檬黃和日落黃含量均超出限定標(biāo)準(zhǔn)約3倍。

近幾年來，各省市的食藥監(jiān)管部門以及國家食藥監(jiān)總局在對市面銷售的食品進(jìn)行抽檢的過程中發(fā)現(xiàn)，偶氮色素濫用現(xiàn)象仍十分嚴(yán)重，甚至有一些不法商販將廉價(jià)購買的病死豬肉、老鼠肉等未經(jīng)檢驗(yàn)檢疫的劣質(zhì)肉，通過添加明膠、胭脂紅、亞硝酸鹽等手段冒充新鮮肉販賣。

2 分析方法

2.1 樣品的前處理

可應(yīng)用于提取食品中合成色素的方法有很多，如濾膜法、固相萃取法（SPE）、液相萃取法（LLE）、微波輔助萃取法（MAE）、超聲輔助萃取法（UAE）等，但目前沒有一種可以通用的前處理方法，因此針對不同樣品還需要選擇不同的提取方法。

液體食品中，含乳飲料經(jīng)離心沉淀除掉蛋白質(zhì)，碳酸飲料經(jīng)加熱超聲除去二氧化碳，酒類食品加熱除去乙醇，之后再用檸檬酸溶液調(diào)pH到6左右，經(jīng)濾膜過濾后待測。

肉制品首先要將樣品粉碎并混合均勻，經(jīng)石油醚除去肉中的脂肪，再用乙醇-水-氨水溶液（75：24：1，v/v/v）反復(fù)提取色素，水浴除去乙醇和氨水，樣品溶液采用聚酰胺吸附后，將提取液濃縮后調(diào)節(jié)pH值，再定容至一定體積，經(jīng)濾膜過濾后待測。

糕點(diǎn)類食品可利用乙醇氨溶液作為提取劑，超聲提取試樣溶液，經(jīng)甲醇溶液洗滌，聚酰胺柱吸附后，收集溶液，調(diào)節(jié)pH值，經(jīng)濾膜過濾后待測。

2.2 檢測食品中的偶氮類色素

2.2.1 分光光度法

食用合成色素在可見光區(qū)具有高度的吸光性，同時(shí)由于該方法成本低，對操作者要求低，因此分光光度法是一種理想的定量分析方法。然而，含混合色素的溶液缺乏特異性可見吸收峰阻礙了這一技術(shù)的發(fā)展，主要是多種偶氮染料混合時(shí)吸收波長發(fā)生重疊。

Soylak等應(yīng)用MCI GEL CHP20P作為填料的固相萃取技術(shù)處理食品樣品，提高了分光光度法測定水樣中誘惑紅的靈敏度。Kaur在2012年對使用導(dǎo)數(shù)分光光度法配合H點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)加入法（HPSAM）以及濁點(diǎn)萃取法（CPE）測定食品中的合成色素及其鋁色淀的研究現(xiàn)狀做了綜述。Turak等人利用四階導(dǎo)數(shù)分光光度法測定了飲料中的誘惑紅和胭脂紅，方法簡單、快速、適用性廣。

2.2.2 薄層液相色譜法（TLC）

薄層液相色譜法是最簡單、經(jīng)濟(jì)和最合適的定量分析色譜技術(shù)，該方法總體檢測時(shí)間小于30min，適用于色素的現(xiàn)場快速檢測，但其干擾較大，僅能用于初步判斷，不能準(zhǔn)確定性定量。

Kucharska等對使用TLC技術(shù)檢測不同食品中各種色素的前處理方法和色譜條件做了綜述。de Andrade等以異丙醇和氨水混合作為流動(dòng)相洗脫液，利用固相萃取及TLC技術(shù)成功檢測出了無醇飲料中的合成色素。

2.2.3 毛細(xì)管電泳法（CE）

該方法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配上的差異而實(shí)現(xiàn)分離樣品的電泳分離分析方法。毛細(xì)管電泳法有多種分離模式，如毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC），毛細(xì)管等速電泳等。

已經(jīng)有很多利用CE分析食品中合成色素的方法被媒體報(bào)道，如1995年Thompson等通過膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法來測定糖果和甜酒中使用的10種常用偶氮類合成色素；Huang等通過微乳液電動(dòng)色譜法（MEEKC）成功檢測了食品中的8種合成色素；Prado等使用CE-UV/vi分析了酒精飲料中的11種色素；Del Giovine等使用CE-PDA的方法對冰淇淋中的日落黃、酸性紅和胭脂紅含量估值。

2.2.4 高效液相色譜法（HPLC）

液相色譜法是根據(jù)保留時(shí)間以及峰面積來進(jìn)行定性、定量的方法，具有分離效能好、檢測靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于檢測食品中添加的各種色素，并且常常與UV-Vis、PDA或MS等檢測技術(shù)聯(lián)用，但該方法的樣品前處理比較繁瑣，所需儀器設(shè)備昂貴，且檢測所需時(shí)間長，從而不便于現(xiàn)場快速檢測。

液相色譜法中最常用的方式是反相液相色譜，其中固定相是相對非極性的，而流動(dòng)相是極性的。Bonan等人[5]以C8為固定相的梯度洗脫模式同時(shí)檢測固體食品和飲料中的多種食用色素。Dossi等使用梯度反相色譜技術(shù)利用較少的樣品同時(shí)檢測了多種食品添加劑。Gennaro通過離子交換液相色譜測定了糖果中的紅色染料。Jurcovan等使用水和乙腈作為流動(dòng)相，同時(shí)測定無醇飲料中的誘惑紅和胭脂紅。Culzoni等使用RP-UFLC-PDA快速分析液體食品中的20種食用色素。Al-Degs[6]采用混合線性分析法（HLA/GO）定量分析了無醇飲料中的誘惑紅、日落黃和檸檬黃，結(jié)果表明HLA/GO技術(shù)檢測無醇飲料中的合成色素比HPLC更加簡單、快速。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)液相色譜法會(huì)使用有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，這將對人類的健康和生存環(huán)境造成消極的影響，因此，開發(fā)一種綠色且簡單高效的分析方法顯得尤為重要。其中，tritonX-100（一種表面活性劑）作為流動(dòng)相就是一項(xiàng)新的改進(jìn)。

2.2.5 液譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）

由于許多合成色素的光譜非常相似，有時(shí)使用普通的PDA或UV-Vis檢測食品中的混合合成色素顯得尤為困難。因此，許多研究人員使用質(zhì)譜檢測器來輔助識(shí)別樣品中的合成色素。質(zhì)譜技術(shù)不依賴光譜，不僅可以提高靈敏度，同樣也可以使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS）檢測樣品的分子量、裂解模式等結(jié)構(gòu)信息。

Ma等通過LC-PDA-MS同時(shí)測定飲料和調(diào)味料中的脂溶性與水溶性合成色素。Gosetti等的研究使用HPLC-MS證明日曬會(huì)降低飲料中日落黃的含量是由于日落黃被降解為5-氨基-6-萘酚-2-磺酸。最近，Zou[7]等使用醋酸銨、乙腈洗脫液提高了ESI負(fù)離子模式對食品中7種合成色素的電離效率。Chen等采用C18柱為固定相，醋酸銨、乙腈與水的混合溶液作為流動(dòng)相的UFLC-MS/MS方法，準(zhǔn)確分析了酒和飲料中的7種偶氮類色素。

2.2.6 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法是基于抗原與抗體的特異性結(jié)合原理來進(jìn)行分析測定，它的被測物須是可以作為抗原或抗體的物質(zhì)，該方法的最大特點(diǎn)就是特異性強(qiáng)、操作簡單、靈敏度高、易于現(xiàn)場快速檢測。

韓丹等[8]試驗(yàn)先通過對蘇丹紅I分子進(jìn)行修飾，并交聯(lián)載體蛋白得到了蘇丹紅I的完全抗原，免疫家兔后獲得多克隆抗體，建立了測定食品中蘇丹紅I含量的ELISA方法，邢玥[9]同理設(shè)計(jì)得到了日落黃及胭脂紅的多克隆抗體，建立了合適的ELISA方法，該方法具備較高的準(zhǔn)確度，而且前處理簡單，能夠應(yīng)用于食品中合成色素的快速檢測。

2.2.7 其他方法

傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)的目標(biāo)物與吸附劑之間的作用力是非特異性的，通常需要對萃取和洗脫條件進(jìn)行仔細(xì)選擇，而分子印跡技術(shù)（MIP）獨(dú)特的選擇性和親和能力適應(yīng)了這一需求，使得MIP-SPE技術(shù)對于目標(biāo)物的選擇性大大提高。同時(shí)，楊晶等[10]制作的日落黃分子印跡修飾電極通過微分脈沖伏安法測定了飲料中的日落黃，回收率大大提高。

此外，劉宇等[11]以甲基紫作為光譜探針，建立了分別測定日落黃和胭脂紅的共振光散射光譜法（RLS），該方法利用甲基紫與合成色素通過靜電作用形成離子締合物能夠增強(qiáng)共振光散射的強(qiáng)度，準(zhǔn)確測定了飲料中的日落黃和胭脂紅。

3 結(jié)論

針對食品中偶氮類合成色素的檢測方法大體有以下3個(gè)發(fā)展趨勢：一是簡單快速，對食品的監(jiān)管過程中往往要求檢測機(jī)構(gòu)在最短的時(shí)間內(nèi)對其色素成分進(jìn)行鑒定，這就要求檢測設(shè)備簡便，前處理過程簡單；二是定性定量準(zhǔn)確，食品中合成色素的檢測關(guān)鍵在于準(zhǔn)確的定性與定量，否則將對生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失，并以損害消費(fèi)者的身體健康為代價(jià)來縱容不法行為；三是多組分同時(shí)測定，合成色素的種類繁多，不法商販可能向食品中添加各種合成色素，能夠同時(shí)檢測多種色素?zé)o疑可以提高對產(chǎn)品監(jiān)管的效率。

因此，一種簡單、準(zhǔn)確、通用型的檢測食品中偶氮類合成色素的方法，對于加強(qiáng)監(jiān)管食品中的色素添加十分必要。

通過本文來看，使用ELISA試劑盒與HPLC-MS方法配合使用的檢測方法，能夠快速鎖定食品中偶氮類合成色素的檢測范圍，并可進(jìn)行樣品的準(zhǔn)確定量分析，希望有關(guān)食品監(jiān)管部門考慮采用。

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