高遷移率蛋白1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及其機(jī)制

姜　雙，徐海月

作者單位：(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科

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·實(shí)驗(yàn)論著·

高遷移率蛋白1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及其機(jī)制

姜雙，徐海月

作者單位：(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科

Citation:Jiang S, Xu HY.Expression and mechanism of high mobility group box protein-1 in retinal tissue of diabetic rats.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):829-832

摘要

目的：探討高遷移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及其可能機(jī)制。

方法：將SD大鼠60只隨機(jī)分為糖尿病組和對照組。采用STZ腹腔注射制作糖尿病大鼠模型，糖尿病組大鼠腹腔注射STZ 60mg/kg，對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。分別于1、2和4mo時處死大鼠，摘取視網(wǎng)膜，HE染色觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化，熒光血管造影觀察視網(wǎng)膜血管變化，TUNEL染色觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，Western Blot檢測視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB的表達(dá)。

結(jié)果：與對照組相比，糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞密度減低，可見微血管病變，以及內(nèi)、外核層變薄和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡；熒光血管造影見周邊毛細(xì)血管迂曲，可見血管閉塞及無灌注區(qū)；Western Blot檢測HMGB1和NF-κB表達(dá)呈時間依賴性增高，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。

結(jié)論：HMGB1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)增加，HMGB1可能通過NF-κB信號通路參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：糖尿病視網(wǎng)膜病變；高遷移率蛋白1；核轉(zhuǎn)錄因子κB

引用：姜雙，徐海月.高遷移率蛋白1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及其機(jī)制.國際眼科雜志2016;16(5):829-832

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。目前對DR基本病理過程發(fā)生的機(jī)制仍然不清楚，慢性低度炎癥被認(rèn)為是DR重要的病理生理機(jī)制之一[1]，免疫細(xì)胞異常活化產(chǎn)生的炎癥相關(guān)因子介導(dǎo)視網(wǎng)膜炎癥性損傷是DR發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]。高遷移率蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種晚期炎癥因子，它做為一種損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)通過與其受體結(jié)合參與生理和病理過程，包括炎癥因子的釋放、細(xì)胞遷移和血管新生[3-5]。本研究檢測通過HMGB1和NF-κB在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)，以明確其在DR發(fā)生中的可能作用。

1材料和方法

1.1材料取4月齡Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體質(zhì)量為180～220g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，嚴(yán)格遵守清潔級動物大鼠喂養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)所有條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。鏈脲佐菌素(STZ)和FITC-dextran購于美國Sigma公司，HMGB1兔多克隆抗體和NF-κB兔多克隆抗體購于英國Abcam公司，TUNEL試劑盒購于美國Roche。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1wk后，隨機(jī)分為兩組：對照組和糖尿病組各30只。糖尿病組造模前禁食12h，采用0.1%檸檬酸緩沖液(pH=4.5)配置成1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液，大鼠一次性腹腔注射60mg/kg，注藥后4h恢復(fù)進(jìn)食。72h后鼠尾靜脈測隨機(jī)血糖，血糖高于16.7mmol/L者為造模成功。對照組腹腔注射同等劑量的生理鹽水。

1.2.2 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)變化對照組和糖尿病大鼠均飼養(yǎng)4mo后分別麻醉取眼球，每組各取3只大鼠，4%多聚甲醛固定24h，梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋，沿平行眼軸方向進(jìn)行切片，厚5μm，脫蠟、HE染色、脫水、透明并封片。光鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。

要尊重學(xué)生的主體權(quán)利，盡可能多地滿足學(xué)生的利益訴求，把促進(jìn)學(xué)生的成長和發(fā)展作為出發(fā)點(diǎn)和目標(biāo)；要改變教學(xué)方式以及師生關(guān)系，重新認(rèn)識學(xué)生在教學(xué)過程中的地位，要求學(xué)生從教學(xué)的“邊緣”角色轉(zhuǎn)變?yōu)榻虒W(xué)的參與者，學(xué)習(xí)變成了教師指導(dǎo)下自主探究的過程。

1.2.3 TUNEL染色觀察視網(wǎng)膜中細(xì)胞凋亡變化石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)，蛋白酶K 37℃孵育30min，滴加Tunel反應(yīng)液50μL(試劑①5μL+試劑②45μL)，置于37℃暗盒中孵育60min，滴加POD 50μL，37℃暗盒中孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，返藍(lán)，梯度酒精常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 FITC-dextran熒光血管造影視網(wǎng)膜鋪片取對照組和糖尿病4mo組各3只大鼠，1%戊巴比妥鈉(0.6mL/100g)腹腔內(nèi)麻醉，麻醉后固定四肢，快速打開胸腔，暴露心臟，心尖部插入注射器針頭，剪開右心耳，用37℃的生理鹽水進(jìn)行灌注，灌注至心臟血液全部流出，再用4%多聚甲醛緩慢灌注2～3mL，最后灌注異硫氰酸葡聚糖熒光素(FITC-dextran，分子量200 000)約2～3mL，輕輕擠壓心臟幫助灌注，使造影充分。摘除眼球，取出眼前節(jié)及玻璃體，小心剝離視網(wǎng)膜，以視盤為中心放射狀剪開，將視網(wǎng)膜移至載玻片上，鋪平，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管情況。

1.2.5 Western Blot檢測大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)分別取對照組、糖尿病組1、2、4mo大鼠，每組各8只，取視網(wǎng)膜，每組各裂解并離心后取上清。按BCA法進(jìn)行蛋白定量和制定樣品。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白印記轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBST封閉1h，一抗(HMGB1和NF-kB，稀釋比例均為1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后二抗(山羊抗兔，稀釋比例1∶1000)常溫孵育1h，洗膜后ECL顯影。使用β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件測量各蛋白與內(nèi)參的灰度值，比較各蛋白與內(nèi)參灰度值的相對量。

2結(jié)果

2.1糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，與糖尿病組相比，對照組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列規(guī)則整齊，密度均勻；而糖尿病4mo組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞密度減低，可見微血管病變、血管擴(kuò)張。隨著病程的延長，出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的水腫、變少，以及內(nèi)、外核層的變薄(圖1)。

圖1兩組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化(HE，×400)A：對照組；B：糖尿病4mo組。

2.2 TUNEL染色觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況糖尿病4mo組大鼠與對照組大鼠視網(wǎng)膜相比，可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)明顯染色陽性的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色，而對照組偶見零散的凋亡細(xì)胞(圖2)。

2.3 FITC-dextran熒光血管造影視網(wǎng)膜鋪片情況對照組視網(wǎng)膜血管自視盤發(fā)出的大血管向四周呈放射狀分布，毛細(xì)血管分布均勻；糖尿病4mo組大鼠視網(wǎng)膜周邊毛細(xì)血管迂曲，可見血管閉塞及無灌注區(qū)(圖3)。

2.4大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)經(jīng)Western Blot檢測，與對照組相比，糖尿病1、2、4mo組HMGB1和NF-κB的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1，圖4～5)。隨糖尿病時間延長，HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)量逐漸增加，呈明顯的時間依賴性。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，表明HMGB1與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.718，P<0.01，圖6)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的進(jìn)展，大鼠視網(wǎng)膜血管逐漸閉塞，且于16wk時出現(xiàn)無灌注區(qū)，同時視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，以神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)最早、程度最重，逐漸擴(kuò)展到內(nèi)、外核層。

圖2TUNEL染色觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡結(jié)果A：對照組；B：糖尿病4mo組。

圖3大鼠視網(wǎng)膜熒光血管造影結(jié)果A：對照組；B：糖尿病4mo組。

HMGB1又稱為高遷移率蛋白1，一種染色質(zhì)結(jié)合蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，在幾乎所有類型的細(xì)胞中都有表達(dá)[6]。在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1參與穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)，參與DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和翻譯[7-9]。HMGB1可以由受損或壞死的細(xì)胞被動分泌，或由有免疫能力的細(xì)胞主動分泌[10-11]。HMGB1被公認(rèn)是一種晚期炎癥因子，通過不同機(jī)制引發(fā)炎癥反應(yīng)[12-14]。近些年又有研究表明它參與新生血管的生成[15-16]，在一些組織中促進(jìn)新生血管的生成[17-19]。

圖4大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)。

圖5大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果aP<0.05vs對照組。

圖6HMGB1與NF-κB蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。

表1大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)

分組HMGB1表達(dá)量NF-κB表達(dá)量正常對照組11糖尿病1mo組1.16±0.551.24±0.95糖尿病2mo組1.29±0.131.36±0.49糖尿病4mo組1.48±0.101.64±0.09 F7.74842.57P0.0220.00

本研究表明，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，HMGB1表達(dá)隨病程進(jìn)展而增多，近期有學(xué)者在增殖性DR患者的玻璃體和增殖膜中發(fā)現(xiàn)，HMGB1的表達(dá)明顯高于非糖尿病人群，表明HMGB1可能在DR的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，與本研究結(jié)果相似[20]。同時有多項(xiàng)研究在細(xì)胞層面驗(yàn)證了HMGB1在高糖環(huán)境中表達(dá)增高：Mudaliar等[21]將血管內(nèi)皮細(xì)胞在正常葡萄糖濃度、高糖濃度、中等升高葡萄糖濃度和葡萄糖波動不同組處理后，發(fā)現(xiàn)HMGB1及其受體TLR2和TLR4表達(dá)均增加，TLR4的升高更具有意義。另有研究表明[22]，在高糖處理的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)中，HMGB1的表達(dá)隨高糖處理時間的延長呈逐漸增加的趨勢，且由胞核內(nèi)逐漸向胞漿中轉(zhuǎn)移，這與本研究在動物中的研究結(jié)果相似。

但HMGB1引起的信號通路變化尚不十分明確，因此本研究同時檢測了NF-κB(p65)的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達(dá)隨糖尿病病程的延長呈逐漸增多的趨勢，與HMGB1的表達(dá)趨勢一致，且兩者的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。提示在DR的發(fā)生、發(fā)展過程中，HMGB1可能是通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用的。本研究通過檢測對照組大鼠和糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜中HMGB1和NF-κB的表達(dá)，兩者的表達(dá)均隨病程延長而增加，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，HMGB1的表達(dá)與DR的發(fā)病有關(guān)，可能是通過NF-κB信號通路發(fā)揮作用的，但具體存在怎樣的關(guān)系，其具體調(diào)節(jié)過程怎樣，這些尚不十分明確，這也是我們在今后的研究工作中需要解決的問題，需要進(jìn)一步地探討和驗(yàn)證。

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Expression and mechanism of high mobility group box protein-1 in retinal tissue of diabetic rats

Shuang Jiang, Hai-Yue Xu

Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

Correspondence to:Shuang Jiang. Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China. joa810121@126.com

Received：2016-01-12Accepted：2016-04-13

Abstract

?AIM:To investigate the expression and mechanism of high mobility group box protein-1 (HMGB1) in the retina of diabetic rats.

?METHODS:Sixty SD rats were randomly divided into diabetic group and control group. Diabetic rat model was produced by intraperitioneal injection of 1% STZ with 60mg/Kg weight. The rats in control group received intraperitioneal injection of normal saline with same dosage. After injection, the rats were sacrificed and eyeballs were enucleated for HE staining, the retina fluorescence angiography, TUNEL and Western Blot detection at 1, 2 and 4mo for the expressions of HMGB1 and NF-κB.

?RESULTS:Compared with the control group, the retinal cells disorder, cell densities decreases, microvasculars occlusion were founded with inner and outer nuclear layer thinning and ganglion cell apoptosis. The fluorescence angiography showed that peripheral capillaries became circuitous and vascular occlusion and non-perfusion area could be seen. The expressions of HMGB1 and NF-κB were higher than those of control with time dependence and they had significant positive correlations(P<0.05).

?CONCLUSION:The expression of HMGB1 increases in diabetic rat retina, which may involve in the occurrence of diabetic retinopathy through the NF- κB pathway.

KEYWORDS:?diabetic retinopathy;high mobility group box protein-1;NF-Κb

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.09

收稿日期：2016-01-12 修回日期： 2016-04-13

通訊作者：姜雙.joa810121@126.com

作者簡介：姜雙，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：眼底病。