針刺聯(lián)合艾灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及血管新生調(diào)控因子的作用研究

申 博，陳 迪，林子昊，徐 超，劉竹青

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽合肥230038）

針刺聯(lián)合艾灸治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及血管新生調(diào)控因子的作用研究

申 博，陳 迪，林子昊，徐 超，劉竹青

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽合肥230038）

目的：探討針刺聯(lián)合艾灸治療對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）模型鼠趾圍及滑膜組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法：采取風(fēng)、寒、濕環(huán)境因素與生物因子（弗氏完全佐劑）聯(lián)合制作RA大鼠模型，測量治療前后各組大鼠趾圍，免疫組織化學(xué)檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF表達(dá)情況。結(jié)果：造模后大鼠踝部和足趾出現(xiàn)明顯的炎癥紅腫。治療后，與模型組比較，艾灸組、針刺組、聯(lián)合治療組大鼠趾圍降低；聯(lián)合治療組大鼠足趾趾圍較針刺組、艾灸組降低（P＜0.01）；艾灸組、針刺組、聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF表達(dá)較模型組顯著減少（P＜0.01），聯(lián)合治療組滑膜中VEGF表達(dá)較艾灸組、針刺組減少（P＜0.01）。結(jié)論：針刺聯(lián)合艾灸可以通過抑制血管內(nèi)皮生長新生因子改善大鼠RA病情，且效果優(yōu)于單純針刺、艾灸治療。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；針刺；艾灸；血管內(nèi)皮生長因子

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因未明、以慢性滑膜炎性增生并形成血管翳為特征的全身性免疫系統(tǒng)疾病，中醫(yī)稱為“歷節(jié)風(fēng)”“骨骱痹”等，其典型癥狀為對稱性、周圍性多個關(guān)節(jié)慢性炎性病變，臨床多表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作過程。其致畸和致殘率較高，是臨床常見的疑難病之一。RA女性和男性發(fā)病率之比為2∶1～3∶1。據(jù)估計我國RA的患病率為0.2%～0.5%［1］，其患病率隨年齡增長，成年RA患者約300萬，其中老年RA患者約24萬［2-3］。

針刺能顯著改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀，明顯提高患者的生存質(zhì)量，具有療效穩(wěn)定、副作用小的優(yōu)點，大量臨床報道充分證實了針刺治療RA的獨特療效。艾灸治療RA能顯著減少活動期RA患者關(guān)節(jié)疼痛感及其并發(fā)癥，臨床療效確切。前期我們通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，針刺聯(lián)合艾灸治療RA效果優(yōu)于單純使用針刺或艾灸治療。以往針灸治療RA的作用機制多從調(diào)節(jié)免疫功能、改善血液流變學(xué)和微循環(huán)、對皮質(zhì)醇分泌的影響以及鎮(zhèn)痛作用等方面入手。目前針對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的治療成為RA治療的一種新的發(fā)展方向［4］。但針灸治療RA對于VEGF因子的影響未見報道。本文探討針刺聯(lián)合艾灸治療RA對于VEGF的抑制作用，為臨床治療RA提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠50只，月齡3～4個月，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供，許可證號：SCXK（皖）2013-0005。

1.1.2 實驗藥物 弗氏完全佐劑（FCA 10mL）美國Sigma公司生產(chǎn)，0.25 mm×25 mm無菌針灸針，特制香煙型純艾條（直徑1 cm）。

1.1.3 試劑與儀器 酶標(biāo)儀（ELX800uv，Bio-TEK公司），MA110型電子分析天平（上海第二天平儀器廠），自制玻璃造模水箱（1.2m×1.0 cm×0.8 cm）。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，免疫組化染色試劑盒，DAB（3-3′-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺）顯色劑，Rabbit Anti-VEGF一抗。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠RA模型的建立 SD雄性大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取10只為正常組，置于室溫18℃～20℃動物房內(nèi)常規(guī)喂養(yǎng)，其余大鼠造模。將造模所用大鼠放置在自制玻璃造模水箱內(nèi)，水面沒過大鼠后肢膝關(guān)節(jié)，濕度控制在80%～90%，溫度（5±2）℃，電風(fēng)扇選擇較高風(fēng)力。將所有造模大鼠放入上述風(fēng)、寒、濕環(huán)境中（12 h/d，8∶00～20∶00）。20 d后于大鼠右側(cè)后肢足趾部注射弗氏完全佐劑0.15 mL/只致炎。觀察3 d，大鼠出現(xiàn)肢體明顯對稱性腫脹或耳部和尾部有炎性結(jié)節(jié)出現(xiàn)，表示造模成功。造模成功后，將大鼠隨機分為模型組、針刺組、艾灸組、針刺聯(lián)合艾灸治療組（聯(lián)合治療組），每組10只。各組均在相同的條件下飼養(yǎng)。模型組不做任何處理，針刺組、艾灸組、聯(lián)合治療組給予相應(yīng)治療。

1.2.2 檢測指標(biāo) ①測量大鼠趾圍。②大鼠內(nèi)固定處死，取關(guān)節(jié)滑膜組織，部分切片，作免疫組化染色，在光鏡下觀察HE染色切片組織結(jié)構(gòu)變化。③大鼠內(nèi)固定處死，取關(guān)節(jié)滑膜組織，部分制備勻漿液，按照試劑盒說明書檢測VEGF的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠趾圍比較

造模前，各組大鼠右后肢足趾趾圍比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。注射弗氏完全佐劑3 d后，除正常組外，其余各組大鼠踝部和足趾出現(xiàn)明顯的紅腫，大鼠右后肢足趾趾圍明顯增加，表明造模成功。經(jīng)過15 d治療后，艾灸組、針刺組、聯(lián)合治療組大鼠右后肢由炎癥引起的腫脹度較模型組有所減輕（P＜0.01），聯(lián)合治療組大鼠的足趾趾圍較針刺組、艾灸組減?。≒＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 治療前后大鼠足趾趾圍比較 （cm，±s）

表1 治療前后大鼠足趾趾圍比較 （cm，±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與聯(lián)合治療組比較，2）P＜0.01

組別 n 造模前 造模后 治療后正常組 10 3.0±0.1 3.0±0.1 3.0±0.1模型組 10 3.0±0.2 4.1±0.21） 3.8±0.2針刺組 10 3.0±0.1 4.1±0.2 3.6±0.21）2）艾灸組 10 3.0±0.1 4.1±0.1 3.5±0.11）2）聯(lián)合治療組 10 3.0±0.2 4.1±0.1 3.4±0.21）

2.2 各組大鼠滑膜組織中VEGF表達(dá)比較結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠滑膜組織中VEGF的表達(dá) （±s）

表2 各組大鼠滑膜組織中VEGF的表達(dá) （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與聯(lián)合治療組比較，2）P＜0.01

組別 n 總面積（像素單位）正常組 10 3 000.86±268.271）模型組 10 22 897.12±1123.68針刺組 10 10 667.23±448.251）2）艾灸組 10 9 887.64±609.371）2）聯(lián)合治療組 10 6 889.75±378.281）

由表2可見，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF表達(dá)較正常組顯著增多（P＜0.01）；艾灸組、針刺組、聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF表達(dá)較模型組顯著減少（P＜0.01），聯(lián)合治療組滑膜組織中VEGF表達(dá)較艾灸組、針刺組減少（P＜0.01）。表明艾灸、針刺、針刺聯(lián)合艾灸治療均可使RA大鼠滑膜組織中的VEGF表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合治療效果優(yōu)于單純針刺、艾灸治療。

3 討 論

針刺治療RA，刺激腧穴通過經(jīng)絡(luò)的傳輸傳導(dǎo)作用，激發(fā)經(jīng)氣調(diào)整臟腑氣血的功能，調(diào)動人體內(nèi)在的抗病能力，從而達(dá)到扶正祛邪、防治疾病的作用［5］。《靈樞·經(jīng)脈》：“經(jīng)脈者，所以決死生，處百病，調(diào)虛實，不可不通?！卑脑谥袊延袔浊甑臍v史，具有溫經(jīng)通絡(luò)、祛寒止痛、消瘀散結(jié)等作用。大量臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)灸法對機體免疫功能、血液循環(huán)、神經(jīng)內(nèi)分泌等各個系統(tǒng)都有促進(jìn)和調(diào)整作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)艾灸“足三里”“腎俞”“阿是穴”后關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵、壓痛等臨床癥狀、體征及實驗室指標(biāo)均得到改善［6］。大量實驗研究證明，艾灸“足三里”“腎俞”“阿是穴”能顯著改善RA大鼠的局部和全身癥狀［7-8］。

3.1 RA與血管新生的關(guān)系

血管新生是在機體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧和炎癥等情況下，原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過程。RA是一種病因未明的以慢性滑膜炎性增生并形成血管翳為特征的全身性免疫系統(tǒng)疾病，RA形態(tài)學(xué)的主要表現(xiàn)為滑膜增生，在滑膜增生的過程中，早期會存在著新生血管成分。RA發(fā)展過程中，一個重要的病理改變就是血管翳的形成，新生血管生成是產(chǎn)生和維持血管翳的重要標(biāo)志。在增生的滑膜中局部促血管生成因子的異常表達(dá)導(dǎo)致血管生成過度活躍，增生的血管進(jìn)而形成特征性的血管翳［9］。RA的病程發(fā)展與局部血管新生關(guān)系密切，多種因子參與并調(diào)控了這一過程。RA局部炎癥及血管新生與滑膜病變進(jìn)展關(guān)系密切，這提示我們，抑制血管新生可能有助于減輕關(guān)節(jié)炎癥狀。

3.2 VEGF與RA的關(guān)系

VEGF可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖，在體內(nèi)還可誘導(dǎo)血管發(fā)生，增加血管通透性。RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中新生血管形成，可為滑膜增生帶來充足的血流和營養(yǎng)，同時也是炎細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放的基礎(chǔ)，為形成類腫瘤樣的具有侵蝕性生長的RA滑膜組織提供了條件。VEGF通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長、新生血管形成和炎性細(xì)胞的趨化性，在RA滑膜血管新生和炎癥反應(yīng)等病理過程中具有至關(guān)重要的作用［10］。程琦等［11］研究結(jié)果顯示RA病情穩(wěn)定期關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF蛋白陽性表達(dá)明顯低于活動期，提示可以VEGF為靶點治療RA。如通過抑制VEGF基因或蛋白的表達(dá)，或采用VEGF抗體、可溶性VEGF受體干擾VEGF與其受體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制滑膜血管增生及血管翳形成，降低血管通透性、減少血漿蛋白外滲，達(dá)到緩解滑膜炎癥、減輕關(guān)節(jié)腫脹、延緩關(guān)節(jié)骨破壞的目的。在抑制血管新生時，RA血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)明顯降低，且滑膜炎癥狀明顯減輕。

3.3 針刺與血管新生的關(guān)系

血管新生是一個復(fù)雜的促進(jìn)和抑制血管新生因子的嚴(yán)格調(diào)控的生理和病理過程。VEGF是特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂劑，通過其受體特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮的增生，從而促進(jìn)新生血管的形成［12-13］。RA患者滑膜組織VEGF過度增高，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)局部血管組織新生微血管豁形成、關(guān)節(jié)滑膜組織異常增生、滑膜腫脹充血、關(guān)節(jié)蛻變等。針刺在發(fā)揮血管新生方面起著多環(huán)節(jié)、多水平、多層次、多途徑的調(diào)節(jié)作用。郭麗紅等［14］研究發(fā)現(xiàn)電針可以顯著改善RA大鼠的飲食狀況，增加體質(zhì)量，減輕關(guān)節(jié)腫脹，并且能減少VEGF的分泌。說明針刺對VEGF有一定的抑制作用。因此，筆者猜想針刺治療RA可能是通過抑制VEGF而發(fā)揮治療作用的。

3.4 艾灸抑制血管新生因子治療RA的理論依據(jù)

羅磊等［7］研究發(fā)現(xiàn)艾灸能顯著改善RA模型大鼠局部和全身癥狀，減輕關(guān)節(jié)腫脹，提高大鼠進(jìn)食、進(jìn)水量，并能有效調(diào)節(jié)大鼠血清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF）的含量，改善神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)機制，糾正炎癥時自由基代謝紊亂，誘導(dǎo)滑膜炎癥細(xì)胞凋亡，改善局部關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，并證實艾灸對局部關(guān)節(jié)組織中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)是其抗炎免疫機制之一。提示我們艾灸可以抑制細(xì)胞因子的促炎效應(yīng)，增強細(xì)胞因子的抗炎效應(yīng)，從而抑制血管新生。

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（編輯：梁葆朱）

Effectof acupuncture andmoxibustion on the expression of vascular endothelialgrow th factor in RA ratmodels

Shen Bo，Chen Di，Lin Zihao，Xu Chao，Liu Zhuqing
（AnhuiUniversity of Chinese Medicine，Hefei Anhui230038）

Objective：To investigate the effect of acupuncture and moxibustion on the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）in the toe of ratmodel of rheumatoid arthritis（RA）.Methods：Rheumatoid arthritis（RA）ratmodel wasmade by using the wind，cold，wet environmental factors and biological factors（Freund's complete adjuvant）.Rat toe girth wasmeasured and the rat synovial tissue VEGF expression was detected by immunohistochemicalmethod.Results：Rats ankle and toes appearred obvious inflammatory swelling after model establishment.After treatment，compared with model group，moxibustion group，acupuncture group and combined treatment group rats toe girth were decreased and VEGF expression of rat synovial tissuewere decreased significantly（P＜0.01）.Compared withmoxibustion group and acupuncture group，VEGF expression of rat synovial tissue in combined treatment group was decreased（P＜0.01）.Conclusion：Acupuncture combined withmoxibustion can improve the condition of rheumatoid arthritis in rats by inhibiting the growth of vascular endothelial growth factor，and the effect is superior to thatof simple acupuncture andmoxibustion.

rheumatoid arthritis；acupuncture；moxibustion；VEGF

R285.5

A

1671-0258（2016）01-0025-03

2014年安徽中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2014043）

申博，本科，E-mail：624441574@qq.com

劉竹青，E-mail：ahaqliuzhuqing@126.com