質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用分析Quark干酪水溶性多肽組成

焦晶凱，劉振民，莫蓓紅，鄭遠(yuǎn)榮，石春權(quán)，于華寧，朱培，孫顏君

(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

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質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用分析Quark干酪水溶性多肽組成

焦晶凱*，劉振民，莫蓓紅，鄭遠(yuǎn)榮，石春權(quán)，于華寧，朱培，孫顏君

(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

摘要通過質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用分析了自制Quark干酪中水溶性多肽的組成，測(cè)定了干酪的理化指標(biāo)及其多肽和蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：干酪涂抹性良好，質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)到62種蛋白和223條多肽，蛋白主要有K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白等，優(yōu)勢(shì)肽段主要來自于這些蛋白，此外，大多數(shù)多肽序列與功能性活性多肽相近或相關(guān)。

關(guān)鍵詞Quark干酪；多肽；質(zhì)譜；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)

蛋白質(zhì)水解是干酪制作成熟過程中一個(gè)重要的生化反應(yīng)，蛋白水解酶主要來自于凝乳劑、原料奶、主要發(fā)酵劑微生物、非發(fā)酵微生物及附屬發(fā)酵劑微生物[1]。在蛋白質(zhì)水解的過程中會(huì)產(chǎn)生一系列的多肽物質(zhì)，乳源活性肽在人體中可以修復(fù)細(xì)胞、促進(jìn)大腦發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能、增強(qiáng)體能、促進(jìn)細(xì)胞繁殖、抗病毒感染、抗衰老、消除體內(nèi)氧自由基、改善調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及改善消化系統(tǒng)功能等[2]。

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其空間結(jié)構(gòu)，而空間結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的功能至關(guān)重要，因此對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證尤為關(guān)鍵，液質(zhì)肽圖可以精確測(cè)定蛋白質(zhì)經(jīng)酶切后各肽段的相對(duì)分子質(zhì)量，并對(duì)每個(gè)色譜峰的肽片段定位[3]。此前測(cè)定多肽及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法存在很多缺點(diǎn)，如在20世紀(jì)50年代氨基酸測(cè)序的唯一方法是Edman降解，隨后出現(xiàn)了自動(dòng)測(cè)序儀，但是這些測(cè)序方法不僅速度慢，還需要高純度的蛋白質(zhì)樣品和自由的氨基端。由于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入開展，大量的功能蛋白迫切需要快速準(zhǔn)確的測(cè)定序列的技術(shù)，經(jīng)過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liguid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)的分析，能得到大量肽段信息，數(shù)據(jù)庫檢索法和從頭測(cè)序法均能準(zhǔn)確的鑒定多肽及蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)[4]，但目前還鮮少應(yīng)用在干酪的多肽研究中。

Quark干酪是一種軟質(zhì)酸凝新鮮干酪，呈乳白色，或者淡黃色，質(zhì)地柔軟，稍有彈性，具有良好的涂抹性，表面不得有水或乳清析出，也不得出現(xiàn)干燥或粒狀物，不得有細(xì)菌檢出，風(fēng)味呈清爽、或溫和的酸味，是一種受人喜歡、易于消化的低脂、高鈣、高蛋白的乳制品[5]。

本文通過LC-MS分析，采用高效液相-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)Quark干酪進(jìn)行了液質(zhì)肽圖分析，為后續(xù)干酪中活性多肽的研究提供了依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

CHOOZITTMMA14菌種、凝乳酶Marzyme 150MG，Danisco公司；磺基水楊酸(SSA，AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，德國(guó)Merk公司產(chǎn)品；甲酸、碳酸氫銨，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胰酶，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

奶酪槽，英國(guó)Armfiled公司；均質(zhì)機(jī)，丹麥APV公司；Inlab solids pro 三合一pH計(jì)探頭，瑞士METTLER 公司；離心機(jī)，美國(guó)Sorvall；TA-Hdi型質(zhì)構(gòu)分析儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司；mb45水分測(cè)定儀，美國(guó)OHAUS；水相針式濾器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；Dionex ultimate3000 HPLC液相系統(tǒng)，Dionex；四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(maxis impact UHRQ-TOF)，德國(guó)Bruker公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Quark干酪的制作

使用丹尼斯克菌種CHOOZITTMMA14及凝乳酶Marzyme 150MG制作Quark干酪，菌種接種量為4DCU/100L，凝乳酶使用量為500IMCU，具體操作步驟如圖1所示。所得新鮮干酪置于4℃環(huán)境下儲(chǔ)藏，備用。

圖1　Quark干酪制作流程圖Fig.1　Production flow chart of Quark cheese

1.2.2理化指標(biāo)的測(cè)定

pH值測(cè)定采用用Inlab solids pro 三合一pH計(jì)插入干酪樣品直接測(cè)定。采用mb45水分測(cè)定儀測(cè)定干酪樣品水分含量。干酪中的蛋白質(zhì)測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB 5009.5凱氏定氮法。干酪中的脂肪測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB 5009.6索氏抽提法。干酪的質(zhì)構(gòu)分析采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定，測(cè)量方式為下壓，測(cè)試速度3.0 mm/s；測(cè)量后探頭回程速度10 mm/s；測(cè)試距離18 mm；探頭類型為HKP/SR錐形探頭，每組樣品平行測(cè)定5次。曲線參數(shù)及其定義：

(1)硬度：最大力值以N(g)表示，表示干酪的軟硬程度。

(2)涂抹性：探頭下行過程中受力曲線與時(shí)間軸所形成的峰面積為A, A表示涂抹時(shí)所需的能量，A越小越易涂抹。

1.2.3水溶性多肽的提取

將干酪樣品中加入3倍于其質(zhì)量的去離子水，混合均勻后置于40℃振蕩水浴中保持1 h，后在4 250×g、4℃條件下離心分離30 min，去掉不溶物，上清液透過0.2 μm膜過濾，過濾后樣品儲(chǔ)存在-20℃條件下，備用。

1.2.4質(zhì)譜分析

取4 mL干酪的多肽溶液，向其中加入2.5倍體積的乙腈，于-20℃沉淀1h，冷凍離心取上清，離心濃縮干燥。用300 μL 50 mmol/L NH4HCO3重溶沉淀，15 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移至10 kD超濾管中，12 000 r/min，4℃超濾。取濾液，平分為2份，分別加一定量的50 mmol/L NH4HCO3，定容至200 μL。其中一份用胰酶酶解，并用1 mol/L NH4HCO3調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，酶解過夜。次日，向酶解后的多肽溶液加入3 μL甲酸，用Sep-PAK進(jìn)行脫鹽，離心濃縮干燥。另一份多肽溶液直接加入3 μL甲酸，用SeP-PAK進(jìn)行脫鹽，離心濃縮干燥。

干燥后的2個(gè)樣品加入上樣緩沖液，震蕩10 min重溶，離心取40 μL樣品加入樣品瓶上樣分析。每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Dionex ultimate3000進(jìn)行分離，經(jīng)Trap柱Dionex Trap column，再經(jīng)C18分析柱分離，流速為400 nL/min。經(jīng)高效液相色譜脫鹽及分離后用Brukermaxis impact UHR Q-tof質(zhì)譜進(jìn)行分析。串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)采用的是數(shù)據(jù)依賴掃描(data dependent acquisition，DDA)模式。TOF MS 掃描分辨率為20,000 (FWHM)，質(zhì)荷比范圍設(shè)定為m/z 50～2500；峰高超過100 cps (counts/second)，且電荷為+2～+4的10個(gè)豐度最大的多肽選擇被MS/MS分析，質(zhì)荷比范圍為m/z 350～1500，每個(gè)cycle掃描累積時(shí)間為1.3s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間15s。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)baf文件用Data analysis(德國(guó)Bruker公司)軟件轉(zhuǎn)換為 mgf文件，用protein scape軟件(version3.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索分析，搜索引擎為Mascot(英國(guó)Matrix Science公司)。未酶解多肽混合物樣品數(shù)據(jù)用none enzyme進(jìn)行搜庫，經(jīng)酶解的多肽混合物樣品數(shù)據(jù)分別選擇Trypsin和none enzyme進(jìn)行2次搜庫。

2結(jié)果與分析

2.1Quark干酪的理化指標(biāo)

根據(jù)圖1所示Quark干酪制作流程，我們得到了pH值1.36、水分69.37%、蛋白質(zhì)13.7%、脂肪13.1%、硬度2.309 kg及涂抹性2.487/(kg ·s)的新鮮Quark干酪，干酪涂抹性良好，這些理化指標(biāo)作為后續(xù)檢測(cè)Quark干酪中多肽成分的理論基礎(chǔ)。

表1　制作Quark干酪理化指標(biāo)結(jié)果

2.2LC-MS分析Quark干酪中蛋白和多肽種類

Quark干酪前處理分別使用了酶解和非酶解2種方法，更全面地分析了Quark干酪的蛋白和多肽組成成分，如圖2和圖3所示，分別是非酶解和酶解后的分析色譜圖，LC-MS分析出共有62種蛋白達(dá)到檢測(cè)限，并分析出來自于這些蛋白的多肽223條。

這些蛋白包含K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-s2-酪蛋白、血清白蛋白、β2-微球蛋白、Α-1B-糖蛋白等組成蛋白；還包含酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶(AMCase)、視網(wǎng)膜鳥苷酸環(huán)化酶2、乳過氧(化)物酶、MOV-10解旋酶、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶?、泛素羧基末端水解酶10、脂肪酸合酶及RNA聚合酶等酶類蛋白；此外還有一些如如膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白2等載體蛋白、如鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白2等調(diào)節(jié)蛋白、纖維鞘CABYR結(jié)合蛋白等結(jié)合蛋白及一些抗菌肽。

分離于來自62種蛋白的多肽223條，多肽所占比例為0.11%～4.31%不等，其中有21條多肽占比達(dá)到1%以上。許多多肽彼此間是相互聯(lián)系的，由于不同而復(fù)雜的蛋白酶作用于同一蛋白而形成了不同長(zhǎng)度的肽段，如RIZZELLO等人[6]在羅曼諾羊奶酪的抗菌片段中檢測(cè)到了來自β-酪蛋白158～178的VMFPPQSVL多肽序列，而在此quark干酪中檢測(cè)到的同樣來自于β-酪蛋白的MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL多肽可能就是此抗菌肽序列的前導(dǎo)片段。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的多肽多數(shù)與已經(jīng)報(bào)道的具有抗氧化、抗菌性、ACE抑制和免疫調(diào)節(jié)功能的肽段覆蓋相同序列，如來自K酪蛋白的VIESPPEINTVQVTSTAV與已報(bào)道的具有抗菌功能的TVQVTSTAV多肽序列；LC-MS檢測(cè)中出現(xiàn)的多肽序列RDMPIQAF、KAVPYPQRDMPIQAF、SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAF，他們共同具有的MPIQAF序列已被鑒定為具有抗菌活性。

來自Quark干酪的多肽組成了復(fù)雜的多肽圖譜，通過MS/MS對(duì)這些多肽進(jìn)行了鑒定和分析，已有報(bào)道指出干酪中的多肽通常具有較高的生物活性，如抗血栓、降膽固醇、抗氧化性、降血壓、抗菌性和免疫調(diào)節(jié)等[7]，這些活性多肽成分增加了干酪的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此對(duì)干酪中多肽的研究具有深遠(yuǎn)意義。

圖2　Quark干酪前處理不經(jīng)酶解分析色譜圖Fig.2　chromatogram map of Quark cheese protein with none enzymatic hydrolysis

圖3　Quark干酪前處理經(jīng)酶解后分析色譜圖Fig.3　chromatogram map of Quark cheese protein with enzymatic hydrolysis

2.3Quark干酪蛋白和多肽分布組成

表2中為主要的蛋白質(zhì)組成(emPAI value>1)及其信息，emPAI 值表示該蛋白在樣品中的豐度，值越高，說明該蛋白在樣品中的含量越高。除K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白、糖基化依賴性細(xì)胞粘附分子1和α-s2-酪蛋白6種蛋白外，剩余56種蛋白的emPAI值均在0.01～0.45，說明此Quark干酪中主要蛋白為K-酪蛋白，剩余56種蛋白所占比例較小。檢測(cè)到的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)從4.47(DPY30域含蛋白1)到11.05(ASPM同源基因片段)不等，檢測(cè)蛋白覆蓋率最高達(dá)到72.3%。

表2　Quark干酪中主要蛋白質(zhì)組成及其信息

檢測(cè)到的223條多肽，但其中占比在1%以上的多肽序列僅有21條，如表3所示，這21條序列分別來自于K-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-酪蛋白和β-乳球蛋白。肽段的實(shí)驗(yàn)分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量的差值控制在一個(gè)較小的范圍之內(nèi)。

表3　Quark干酪中主要多肽組成及其信息

SRYPSYGLNYY 多肽序列是此Quark干酪中含量最多的肽段，來自于K-酪蛋白，此多肽與具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑作用的YPSYGLNYY多肽非常相近，并且由于YPSYGLNYY在C-末端具有酪氨酸殘基，被認(rèn)為很可能具有抗氧化活性[8]。ARHPHPHLSF來自于K-酪蛋白，已被報(bào)道具有ACEI活性[9]，該多肽在此Quark干酪中含量位居第二。FVAPFPEVFGKEKVNEL多肽分解于α-s1-酪蛋白，此前已有報(bào)道指出此序列多肽具有ACE-抑制活性[10]。除此以外，研究分析發(fā)現(xiàn)，Quark干酪中多數(shù)多肽與已鑒定的功能性多肽共享相同或相似的肽段序列，也就是說這些多肽多數(shù)是這些功能性多肽的前導(dǎo)序列或者其進(jìn)一步分解產(chǎn)物。21種優(yōu)勢(shì)肽段序列中分解于K-酪蛋白的多肽有10條，來自于β-酪蛋白的多肽有6條，分解與α-s1-酪蛋白的多肽有3條，分解于β-乳球蛋白的多肽有2條。

3結(jié)論

乳蛋白是目前生物活性肽的一個(gè)重要來源，許多帶有生物活性的多肽都以非活性狀態(tài)覆蓋在牛乳原始蛋白中，在腸道消化或是發(fā)酵過程中，蛋白酶將其降解并釋放這些帶有生物活性的多肽。干酪是乳蛋白的主要凝結(jié)產(chǎn)物，其中所包含的生物活性多肽也是最值得研究的，在此研究中，分析出Quark干酪中含有很多功能性蛋白及活性多肽，對(duì)人體有益，此外，由研究結(jié)果可以看出不同類型和加工方式制作出的奶酪，也可能生成同一種或相似的活性多肽，進(jìn)而可以進(jìn)一步分析這些活性多肽的成因和機(jī)理。

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Applications of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of water-soluble peptides in quark cheese

JIAO Jing-kai*, LIU Zhen-min, MO Bei-hong, ZHENG Yuan-rong,SHI Chun-quan, YU Hua-ning, ZHU Pei, SUN Yan-jun

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy & FoodCo.,Ltd., Shanghai 200436,China)

ABSTRACTWater-soluble Peptides in Quark cheese were analyzed in this paper by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry method. Physicochemical indexes, peptides and Primary Structure of protein of Quark cheese were detected. The results showed that there were 62 kinds of protein and 223 peptide fragments in the Quark cheese with high spreadability. The dominant peptides were derived from the protein like Kappa-casein, Beta-casein, Alpha-S1-casein, and Beta-lactoglobulin and so on. Furthermore, Most of the identified peptides share sequences with milk derived peptides, which have been reported to exert biologically active abilities.

Key wordsquark cheese; peptides; mass spectrometry; liquid chromatography-mass spectrometry

收稿日期：2015-07-06，改回日期：2015-09-27

基金項(xiàng)目：安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(AH2014103753122)、2013年黃山學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(編號(hào)：2013xkj002)、2015年度安徽省教育廳高校自然科學(xué)一般研究項(xiàng)目(KJHS2015B03)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603033

第一作者：碩士,工程師(本文通訊作者，E-mail:xndxjjk@126.com)。