兩種郁金香品種愈傷組織誘導(dǎo)及顯微觀察

吳阿寶，郭亞蘭，劉　利，李　佳

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

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兩種郁金香品種愈傷組織誘導(dǎo)及顯微觀察

吳阿寶，郭亞蘭，劉利，李佳

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

摘要：以海頓和布拉兩種郁金香(Tulipa gesneriana)品種的種球?yàn)橥庵搀w，采用MS培養(yǎng)基附加不同濃度的激素，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，并對(duì)其愈傷組織進(jìn)行顯微觀察。在該過(guò)程中，對(duì)6-BA、NAA、2,4-D、KT等激素條件對(duì)郁金香愈傷組織誘導(dǎo)的影響進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，采用預(yù)先冷處理的種球作為外植體，在MS培養(yǎng)基附加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L KT和0.5 mg/L 2,4-D中，黑暗培養(yǎng)7 d，后轉(zhuǎn)入光照12 h/d，可誘導(dǎo)出白色、細(xì)碎、狀態(tài)良好的愈傷組織。在顯微觀察中，發(fā)現(xiàn)在該組合下，海頓郁金香的愈傷組織生長(zhǎng)較好，內(nèi)含物顆粒量大，品質(zhì)較高。

關(guān)鍵詞：郁金香；愈傷組織；植物激素;正交設(shè)計(jì)

1引言

郁金香(Tulipagesneriana)屬于百合科，是世界著名的花卉之一，最初產(chǎn)在土耳其和中亞細(xì)亞一帶[1]。郁金香與玫瑰一樣是用來(lái)表達(dá)愛(ài)意的花朵，數(shù)目上的差異也會(huì)帶來(lái)含意的不同。而早在17世紀(jì)，郁金香曾是專門(mén)種給皇室貴族觀賞的花種，收藏在歐洲皇室專屬花園中[2]。在荷蘭，郁金香是四寶之一，與風(fēng)車(chē)、奶酪和木鞋齊名。曾經(jīng)有段時(shí)間，荷蘭人以擁有郁金香為豪，而在現(xiàn)代，荷蘭是郁金香的主要出口國(guó)，為其帶來(lái)了巨大的利潤(rùn)。

在我國(guó)很早就有郁金香的少量栽培，主要在西北地區(qū)。近些年國(guó)內(nèi)很多大、中城市頻繁舉辦花展，都收獲了一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，其中以郁金香花展最為突出，因此，中國(guó)目前已經(jīng)成為郁金香的主要進(jìn)口國(guó)[3- 4]。正是由于郁金香的美麗以及它帶來(lái)的可觀的經(jīng)濟(jì)效益，國(guó)內(nèi)也逐步的開(kāi)展郁金香的大面積栽培，但仍然無(wú)法滿足市場(chǎng)的巨大需求。造成這一現(xiàn)象的原因主要有兩個(gè)：一是郁金香屬于種球花卉，自然繁殖所需時(shí)間長(zhǎng)，并且成功率低；二是由于病害等導(dǎo)致郁金香品種退化。為了改變國(guó)內(nèi)郁金香大量依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀，采用組織培養(yǎng)是一種可行有效的解決方式。

筆者選取了郁金香的海頓和布拉兩個(gè)品種，進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)，希望通過(guò)該方式為郁金香的快速繁殖和良種繁育提供依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料

所選用的材料為海頓和布拉郁金香(Tulipagesneriana)種球。材料來(lái)源為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

2.2主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、光照恒溫培養(yǎng)箱等。

2.3外植體的制備與接種

將郁金香種球置于冰箱中冷藏適宜時(shí)間，取出，剝?nèi)ネ庖拢们逅磧?。超凈工作臺(tái)中，75%酒精浸泡30 s，取出，無(wú)菌水清洗3次，2%次氯酸鈉溶液中浸泡30 min，取出，無(wú)菌水沖洗3次，備用。將郁金香鱗莖切成5—8 mm的塊，接種到培養(yǎng)基中。

2.4培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件

采用MS基本培養(yǎng)基添加不同濃度激素，另加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH值5.8。

培養(yǎng)過(guò)程首先在黑暗中處理7 d，之后光照12 min /d，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.5愈傷組織顯微觀察

取誘導(dǎo)出的愈傷組織適量，放置于載玻片上，輕輕壓碎，番紅染液染色2 min，95%酒精沖洗，蓋蓋玻片，顯微鏡下觀察拍照。

2.6正交實(shí)驗(yàn)

確定影響郁金香愈傷組織誘導(dǎo)的因素為4個(gè)，分別進(jìn)行兩組正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)定3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1、表2)。

表16-BA和NAA組合的正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

水平因素6-BA(A)/(mg/L)NAA(B)/(mg/L)10.5021.00.132.00.2

表26-BA、KT和2,4-D組合的正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

水平因素6-BA(A)/(mg/L)KT(B)/(mg/L)2,4-D(C)/(mg/L)10.50021.00.10.532.00.21.0

3結(jié)果與分析

3.1不同激素組合對(duì)郁金香愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3.1.16-BA和NAA組合

6-BA與NAA組合誘導(dǎo)郁金香愈傷組織的結(jié)果如表3所示。

表36-BA和NAA組合誘導(dǎo)郁金香愈傷組織正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)編號(hào)AB誘導(dǎo)率/%111021220.031326.7421052226.762333.373113.383226.793333.3K115.5674.433K220.00024.467K324.43331.100R8.86626.667

注：誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)目/接種的外植體數(shù)目×100%。

從表3中數(shù)據(jù)可以看出，NAA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響更大，極差為26.667，其作用效果K值顯示，隨著NAA濃度的增加，誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體量有所增加，此外，每塊外植體上，愈傷組織的產(chǎn)量也有增加。

6-BA的添加也是必不可少，與NAA配合后，可明顯提高愈傷組織的產(chǎn)量。然而隨著6-BA的濃度增加，愈傷組織易產(chǎn)生硬塊，而且褐化較為嚴(yán)重。

3.1.26-BA、KT和2,4-D組合

表4為6-BA、KT和2,4-D組合時(shí)，郁金香愈傷組織誘導(dǎo)情況的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表46-BA、KT和2,4-D組合誘導(dǎo)郁金香愈傷組織正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABC誘導(dǎo)率/%11110212226.7313333.3421213.3522340.062310731346.783210933246.7K120.00020.0000.000K217.76722.23328.900K331.13326.66740.000R13.3666.66740.000

注：誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)目/接種的外植體數(shù)目×100%。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在6-BA、KT和2,4-D組合中，對(duì)郁金香愈傷組織誘導(dǎo)影響最顯著的是2,4-D，其影響極差為40.0，比較三個(gè)水平的作用效果值，為K3>K2>K1，其中K3和K2數(shù)值相差不大，當(dāng)2,4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)，可誘導(dǎo)出白色細(xì)碎的愈傷組織，而隨著2,4-D濃度的增加，誘導(dǎo)出的愈傷組織出現(xiàn)顆粒狀結(jié)節(jié)，容易褐化死亡。

其次，6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響極差為13.366，比較K值，為K3>K1>K2，且發(fā)現(xiàn)添加低濃度的6-BA可誘導(dǎo)出較多的白色愈傷，狀態(tài)良好。此外，KT也對(duì)愈傷組織的狀態(tài)有利，少量的添加可增加愈傷組織的產(chǎn)量，且愈傷組織細(xì)碎、色白，不易褐化。

3.2不同郁金香品種在愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中的差異

選擇1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L KT和0.5 mg/L 2,4-D組合時(shí)，比較海頓和布拉兩個(gè)品種的郁金香愈傷組織誘導(dǎo)情況，結(jié)果顯示二者的愈傷誘導(dǎo)率沒(méi)有顯著差異，均能達(dá)到20%左右，且愈傷組織狀態(tài)良好。

3.3郁金香愈傷組織顯微觀察

將1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L KT和0.5 mg/L 2,4-D組合下誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行染色后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)兩種郁金香的愈傷組織均有大量的儲(chǔ)藏細(xì)胞，其中含有顆粒狀儲(chǔ)藏物(如圖1，圖2)。而海頓郁金香中的儲(chǔ)藏顆粒相對(duì)更多、更大，說(shuō)明其品質(zhì)更加優(yōu)良。

圖1　布拉郁金香愈傷組織顯微形態(tài)觀察結(jié)果

圖2　海頓郁金香愈傷組織顯微形態(tài)觀察結(jié)果

因此，綜合以上結(jié)果，筆者認(rèn)為在對(duì)郁金香進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，可采用預(yù)先冷處理的種球，在MS培養(yǎng)基附加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L KT和0.5 mg/L 2,4-D中，黑暗培養(yǎng)7 d，后轉(zhuǎn)入光照12 h/d，可誘導(dǎo)白色、細(xì)碎、狀態(tài)良好的愈傷組織。

4結(jié)果與討論

在對(duì)郁金香進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素的添加是必不可少的，其中，2,4-D比NAA誘導(dǎo)的愈傷組織的量更多，但是誘導(dǎo)出的狀態(tài)往往欠佳，濃度高時(shí)，容易褐化。有報(bào)道顯示[5-6]，生長(zhǎng)素采用NAA，其誘導(dǎo)率最高可達(dá)50%左右，然而當(dāng)我們同樣采用NAA時(shí)，誘導(dǎo)的結(jié)果最高只達(dá)到33.3%，雖然同樣采用前人報(bào)道的黑暗處理的方法，但未添加活性炭，可能是由于該原因，未達(dá)到更高的誘導(dǎo)率。然而當(dāng)我們將生長(zhǎng)素更換為2,4-D，愈傷誘導(dǎo)率明顯增加，雖然狀態(tài)欠佳，但通過(guò)另外添加KT，可有效改善愈傷組織的狀態(tài)。

此外，布拉和海頓兩個(gè)郁金香品種在愈傷組織誘導(dǎo)率上沒(méi)有顯著差異，然而在顯微觀察后，發(fā)現(xiàn)海頓郁金香愈傷組織中儲(chǔ)藏顆粒更多，品質(zhì)更佳。

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Callus induction and microscopic observation of two Tulip Varieties

WUA-bao,GUOYa-lan,LIULi,LIJia

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

Abstract：In this article, with bulbs of Brad and Haydn tulip (Tulipa gesneriana) as explants, MS medium plus different concentrations of plant growth regulators was used in callus inducement. The callus was microexamined. In this process, orthogonal experimental methods were used to analysis the impact of 6-BA, NAA, 2,4-D and KT to callus inducement of Tulips. The results showed that, after cool pretreatment, the explants of bulbs were cultured on MS medium supplemented with 1.0mg/L 6-BA, 0.1mg/L KT and 0.5mg/L 2,4-D. Firstly, the culture was in dark for 7 days, and then transferred to 12 h/d light. Then the white, loose and good status callus was induced. The microexamination results showed that the callus of Haydn tulip grew better, and the cell inclusion particles were bigger and had higher quality in abovementioned conditions.

Key words：Tulipa gesneriana; callus;plant growth regulator;orthogonal design method

中圖分類(lèi)號(hào)：S 682.263

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.009

文章編號(hào)：2095-7386(2016)01-0039-04

作者簡(jiǎn)介：吳阿寶(1994 -)，男，本科生，E-mail:1538176726@qq.com.通信作者：李佳(1975-)，女，博士，講師，E-mail:wljiajia@126.com.

收稿日期：2015-12-01.