米渣蛋白雙酶法制備工藝的研究

曾國(guó)強(qiáng)，胡中澤、2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023;2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

?

米渣蛋白雙酶法制備工藝的研究

曾國(guó)強(qiáng)1，胡中澤1、2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023;2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023)

摘要：以淀粉糖生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物米渣為原料，先用正己烷進(jìn)行脫脂，采用高溫α-淀粉酶和纖維素酶雙酶法對(duì)米渣進(jìn)行酶解，提高蛋白質(zhì)的純度，研究了液固比、高溫α-淀粉酶添加量、纖維素酶添加量、雙酶酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了米渣蛋白的最佳提取工藝為：液固比8∶1，高溫α-淀粉酶添加量300 U/mL，纖維素酶添加量110 U/g，高溫α-淀粉酶作用時(shí)間1.5 h，纖維素酶作用時(shí)間2.5 h。在此條件下米渣蛋白的純度為93.8%，得率為88.76%。

關(guān)鍵詞：米渣蛋白；蛋白質(zhì)純度；酶添加量

1引言

米渣是以早秈稻或碎米為原料生產(chǎn)淀粉糖或發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸、檸檬酸、乳酸以及生化藥品時(shí)，米粉高溫液化或是糖化后的副產(chǎn)品。在以大米為原料的工業(yè)生產(chǎn) (如發(fā)酵和淀粉糖等) 中一般只利用大米的淀粉部分， 副產(chǎn)品米渣中蛋白質(zhì)含量為 40%以上，是純大米的5—7倍[1]。米渣中的蛋白質(zhì)雖然經(jīng)過(guò)高溫處理，但它仍保留了大米中蛋白質(zhì)的部分性質(zhì)，具有大米蛋白的很多優(yōu)點(diǎn)，不含影響食物利用的毒性物質(zhì)和酶阻礙物[2]。大米蛋白氨基酸組成平衡合理，與WHO/FAO推薦理想模式非常接近[3]。大米蛋白具有良好的氨基酸組成配比和低過(guò)敏性，消化率較高，是一種優(yōu)良的植物蛋白[4]。在谷物蛋白中，大米蛋白的生物價(jià)(B.V.)和蛋白價(jià)(P.V.)均比其他蛋白質(zhì)高[5]。長(zhǎng)期以來(lái)，米渣以干粉的形式廉價(jià)賣(mài)給飼料廠，經(jīng)濟(jì)效益很低，米渣的增值利用一直是企業(yè)難以解決的難題[6]。

米渣中提取大米蛋白的方法主要有堿洗酸沉法、纖維素酶和酸洗法，堿酶兩步法等[7]。強(qiáng)堿能使大米淀粉的緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，同時(shí)，堿液對(duì)蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵有破壞作用，從而促使淀粉和蛋白質(zhì)分離，但是強(qiáng)堿的處理會(huì)引起大米蛋白理化性質(zhì)的改變，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)生有毒物質(zhì)。另外，堿法還具有等電點(diǎn)要大量消耗酸、脫鹽純化難度大等問(wèn)題[8]。酶法提取主要是采用一些蛋白酶對(duì)大米蛋白進(jìn)行降解和修飾作用，使其變成可溶性多肽而被提取，酶法提取的米渣蛋白溶解性較好，但酶法提取率較低[9]。米渣中除蛋白質(zhì)外，非蛋白成分主要有油脂、未經(jīng)酶水解或水解不完全而殘留的纖維素、淀粉和糊精等糖類(lèi)物質(zhì)。除雜法實(shí)質(zhì)上是一個(gè)純化的過(guò)程，從理論上分析具有更多的合理性。由于纖維素酶和淀粉酶的使用使提取成本有所提高，因此提取的工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的純度和提取率[10]。本文采用排雜法制備米渣蛋白，先用正己烷脫脂，用高溫α-淀粉酶酶解去除大部分淀粉，在用纖維素酶酶解去除大部分纖維素等多糖，用高溫度水水洗米渣蛋白去除糊精、酶解產(chǎn)生的糖類(lèi)物質(zhì)和鹽類(lèi)物質(zhì)，最后獲得高純度的米渣蛋白。

2材料與方法

2.1主要材料與試劑

米渣：(湖北仙源米業(yè)集團(tuán)有限公司)，高溫α-淀粉酶：20 000 U/mL,( 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司)，纖維素酶：10 000 U/g,(阿拉丁(上海)試劑有限公司)，正己烷、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、定氮指示劑、硫酸銅、硫酸鉀：均為分析純。

2.2主要設(shè)備和儀器

pH計(jì)FE20:(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；SHA-C2水浴恒溫振蕩器：(常州華冠儀器制造有限公司)；k9840自動(dòng)凱式定氮儀：(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱：(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-III型循環(huán)水真空泵：(上海亞榮生化儀器廠)。

2.3試驗(yàn)方法

2.3.1米渣蛋白提取工藝流程

米渣→過(guò)20目篩→脫脂→抽濾→通風(fēng)廚吹干→加入一定比例的水→用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0→90 ℃水浴10 min，搖速120 r/min→加入高溫α-淀粉酶反應(yīng)一段時(shí)間→冷卻→調(diào)節(jié)pH值至4.5→55 ℃水浴10 min，搖速120 r/min→加入纖維素酶反應(yīng)一段時(shí)間→抽濾→90 ℃水洗→抽濾→電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥并保存樣品

2.3.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

蛋白質(zhì)：按GB5009.5-2010中的凱式定氮法進(jìn)行測(cè)定，其中蛋白質(zhì)系數(shù)為6.25。

2.3.3米渣脫脂

參照文獻(xiàn)[1]的方法加以改進(jìn)，稱取20 g過(guò)20目篩的米渣，加入正己烷，料液比為1∶3，在60 ℃水浴恒溫振蕩器下脫脂4 h，搖速為120 r/min。

2.3.4單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)在液固比8∶1、高溫α-淀粉酶添加量200 U/mL、纖維素酶添加量100 U/g、酶解時(shí)間：高溫α-淀粉酶1 h與纖維素酶2 h的基礎(chǔ)上，相應(yīng)變換某因素的水平。液固比選擇4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，高溫α-淀粉酶添加量選擇100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL，纖維素酶添加量選擇60 U/g、80 U/g、100 U/g、120 U/g，酶解時(shí)間選擇高溫α-淀粉酶1 h與纖維素酶1 h、高溫α-淀粉酶1 h與纖維素酶2 h、高溫α-淀粉酶2 h與纖維素酶3 h、高溫α-淀粉酶2 h與纖維素酶4 h，按提取工藝流程提取，測(cè)樣品的蛋白質(zhì)純度，考察各因素對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響。

2.3.5正交試驗(yàn)

選取液固比、高溫α-淀粉酶添加量、纖維素酶添加量、酶解時(shí)間4個(gè)因素，以樣品的蛋白質(zhì)純度為指標(biāo)，用 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表如表1所示。

3結(jié)果與分析

3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1液固比對(duì)米渣蛋白質(zhì)純度的影響

液固比影響酶與底物接觸和碰撞的幾率，與酶解工藝相關(guān)，因此會(huì)影響蛋白質(zhì)純度，液固比對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響如圖1所示。

表1正交試驗(yàn)因素水平表

水平因素(A)液固比(B)高溫α-淀粉酶添加量/(U/mL-1)(C)纖維素酶添加量/(U/g-1)(D)酶解時(shí)間1725090高溫α-淀粉酶0.5h,纖維素酶1.5p8300100高溫α-淀粉酶1h,纖維素酶2p9350110高溫α-淀粉酶1.5h,纖維素酶2.5h

圖1　液固比對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響

從圖1可看出，液固比增大，蛋白質(zhì)純度呈上升趨勢(shì)，液固比從4到6時(shí)，蛋白質(zhì)純度不高，而且上升趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。液固比從6到8，蛋白質(zhì)純度有明顯的上升趨勢(shì)，可能是液固比從6開(kāi)始，酶與底物碰撞幾率越來(lái)越大，因此蛋白質(zhì)純度越來(lái)越高，液固比從8開(kāi)始，酶與底物接觸的幾率很大且趨于穩(wěn)定，從后期液體處理量以及經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇液固比8。

3.1.2高溫α-淀粉酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響

高溫α-淀粉酶添加量直接影響酶解工藝，影響去淀粉的程度和能力，從而影響蛋白質(zhì)的純度，高溫α-淀粉酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響如圖2所示。

圖2　高溫α-淀粉酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響

從圖2看出高溫α-淀粉酶添加量從100 U/mL到300 U/mL時(shí)，蛋白質(zhì)純度呈上升趨勢(shì)，從300 U/mL開(kāi)始，蛋白質(zhì)純度呈下降趨勢(shì)，可能是300 U/mL之前，高溫α-淀粉酶添加量越大，酶與底物接觸和碰撞的幾率就越大，酶解越徹底，蛋白質(zhì)純度就越高，300 U/mL之后，高溫α-淀粉酶添加量越大，反而抑制了酶與底物接觸和碰撞，酶解不徹底，蛋白質(zhì)純度更低。因此選擇高溫α-淀粉酶添加量為300 U/mL。

3.1.3纖維素酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響

纖維素酶添加量影響去纖維素等多糖的程度和能力，從而影響蛋白質(zhì)純度，纖維素酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響如圖3所示。

從圖3可看出，隨著纖維素酶添加量變化，蛋白質(zhì)純度呈波浪形變化，纖維素酶添加量從60 U/g到80 U/g，蛋白質(zhì)純度呈下降趨勢(shì)。纖維素酶添加量從80 U/g到100 U/g，細(xì)胞壁破裂的較多，纖維素酶添加量越大，加速了纖維素等物質(zhì)的酶解，蛋白質(zhì)純度呈上升趨勢(shì)。纖維素酶添加量從100 U/g到120 U/g，隨著纖維素酶添加量增加，反而抑制了酶與底物接觸與碰撞。因此選擇纖維素酶添加量為100 U/g。

3.1.4酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響

高溫α-淀粉酶和纖維素酶的酶解時(shí)間影響去除淀粉和纖維素等物質(zhì)的程度，從而影響蛋白質(zhì)純度，酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響如圖4所示。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)純度的影響注:1表示高溫α-淀粉酶1 h,纖維素酶1 h,2表示高溫α-淀粉酶1 h,纖維素酶2 h,3表示高溫α-淀粉酶2 h,纖維素酶3 h,4表示高溫α-淀粉酶2 h,纖維素酶4 h

從圖4可看出，從高溫α-淀粉酶1 h、纖維素酶1 h到高溫α-淀粉酶1 h、纖維素酶2 h，隨著纖維素酶時(shí)間從1 h到2 h，可能是此時(shí)底物濃度較大，隨著纖維素酶酶解時(shí)間增長(zhǎng)，蛋白質(zhì)純度增加。從高溫α-淀粉酶1 h、纖維素酶2 h到高溫α-淀粉酶2 h、纖維素酶3 h，蛋白質(zhì)純度趨于平穩(wěn)趨勢(shì)。從高溫α-淀粉酶2 h、纖維素酶3 h到高溫α-淀粉酶2 h、纖維素酶4 h，蛋白質(zhì)呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)殡S著纖維素酶的作用時(shí)間增長(zhǎng)，酶活力下降。因此選擇高溫α-淀粉酶1 h,纖維素酶2 h。

3.2正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表2和表3所示。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)ABCD蛋白質(zhì)純度/%1111189.42122291.73133392.34212392.15223193.36231292.773132908321392.59332189.2K1276.1277.5270.9184.4K2276274.2185.6274.8K3181.7182.1277.3274.6k191.190.591.590.6k292.792.59191.5k390.691.491.992.3極差R2.120.91.7

表3主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

SourceTypeIIISumofSquaresdfMeanSquareFSig.CorrectedModel37.320a84.66567.7180.000Intercept150590115059021859940.000A14.65327.327106.3550.000B12.04026.02087.3870.000C2.29321.14716.6450.001D8.33324.16760.4840.000Error0.62090.069Total15062818CorrectedTotal37.94017

注：a表示R Squared 0.984(Adjusted 及squared=0.969)

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果可知：蛋白質(zhì)純度影響因素由大到小依次是液固比A>高溫α-淀粉酶添加量B>酶解時(shí)間D>纖維素酶C，由各因素的平均值可以比較出最優(yōu)水平，并初步確定最佳組合為A2B2C3D3,，即液固比8∶1，高溫α-淀粉酶添加量300 U/mL，纖維素酶添加量110 U/g，高溫α-淀粉酶酶解時(shí)間1.5 h，纖維素酶酶解時(shí)間2.5 h。

根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果可知：液固比A、高溫α-淀粉酶添加量B、纖維素酶C、酶解時(shí)間D對(duì)蛋白質(zhì)純度都有非常顯著的影響，影響因素的主次順序?yàn)橐汗瘫華>高溫α-淀粉酶添加量B>酶解時(shí)間D>纖維素酶C，與極差法分析結(jié)果一致。對(duì)最優(yōu)組合條件進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果：蛋白質(zhì)純度為93.8%，得率為88.76%。

3結(jié)論

采用雙酶法制備米渣蛋白，蛋白質(zhì)純度和得率均較高，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了米渣蛋白雙酶法制備的最佳工藝為：液固比8∶1，高溫α-淀粉酶添加量300 U/mL，纖維素酶添加量110 U/g，高溫α-淀粉酶作用時(shí)間1.5 h，纖維素酶作用時(shí)間2.5 h。在此條件下米渣蛋白的純度為93.8%，得率為88.76%。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫紅星,龐雪鳳,尤夢(mèng)圓,等.從米渣中制備米渣蛋白的研究[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械,2013(23):50-53.

[2]李明,李赟高,高紅艷.大米蛋白研究概述[J].糧食與油脂, 2006(8):3-5.

[3]姚惠源,周素梅,王立,等.米糠和米糠蛋白的開(kāi)發(fā)利用[J].無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào),2002,21(3):312-316.

[4]董歡歡,曹樹(shù)穩(wěn),余燕影.異抗壞血酸鈉改善米渣蛋白加工性能的研究[J].食品科學(xué),2008,29(4)：167-191.

[5]余兆海.稻谷綜合利用[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1987：1-15.

[6]王威,曾里.中性蛋白酶提取米渣中大米蛋白的工藝研究[J].飼料工業(yè),2008,29(6):35-37.

[7]黃軍,熊華,李亮,等.米渣美杰工藝及其蛋白等電點(diǎn)測(cè)定[J].食品工業(yè)科技,2008,29(9):174-176.

[8]陳季旺,孫慶杰，夏文水,等.堿酶兩步法制備大米蛋白的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(5):169-172.

[9]李清筱,王修法.堿性蛋白酶提取米蛋白的功能特性研究[J].廣西輕工業(yè),2006,6:17-18.

[10]江漓,林洮,趙小虎,等.除雜和酶法相結(jié)合提取米渣蛋白[J].2011,36(12):179-186.

[11]任東東.米渣蛋白改性及在高蛋白粉末油脂中的應(yīng)用[D].南昌:南昌大學(xué),2008.

Study on double enzymatic preparation of rice residue protein

ZENGGuo-qiang1，HUZhong-ze1、2

(1.School of Food Science and Engineeing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products，Wuhan 430023，China)

Abstract：By product rice residue of starch sugar production process for raw materials, rice residue was first degreased with n-hexane, rice residue was hydrolysised at high temperature α- amylase and cellulase double enzyme, to improve the purity of protein.Effects of liquid-solid ratio, the amount of high-temperature α- amylase, cellulase dosage, double enzyme hydrolysis time on protein purity were studied. On the basis of single factor test, through orthogonal experiment, best rice residue protein good extraction process was determined: liquid to solid ratio of 8∶1, the amount of high-temperature α-amylase 300U/mL, cellulase enzyme dosage 110U/g, high temperature α- amylase time 1.5h, the cellulase reaction time 2.5h. Under these conditions, rice residue protein purity was 93.8%, yield was 88.76%.

Key words：rice residue protein;purity of protein;the amount of enzyme

中圖分類(lèi)號(hào)：TS 210.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.022

文章編號(hào)：2095-7386(2016)01-0099-05

作者簡(jiǎn)介：曾國(guó)強(qiáng)(1991-)，男，碩士研究生，E-mail：974401442@qq.com.

收稿日期：2015-11-30.