綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染示蹤比格犬體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化

張海峰　杜子婧　趙丹陽(yáng)　韓修國(guó)　韓冬

200011，　　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(張海峰、杜子婧、趙丹陽(yáng)、韓冬)；200011，　　上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張海峰、韓修國(guó))

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·實(shí)驗(yàn)研究·

綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染示蹤比格犬體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化

張海峰杜子婧趙丹陽(yáng)韓修國(guó)韓冬

200011，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(張海峰、杜子婧、趙丹陽(yáng)、韓冬)；200011，上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張海峰、韓修國(guó))

【摘要】目的運(yùn)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記技術(shù)，觀察骨組織工程中種子細(xì)胞的變化和轉(zhuǎn)歸。方法使用重組腺病毒(Ad-GFP)將GFP基因轉(zhuǎn)染比格犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，倒置相差顯微鏡下觀察BMSC形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色情況；熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)狀況。待細(xì)胞標(biāo)記成功后將其離心，接種于β-磷酸三鈣(β-TCP)上，回植于比格犬脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊內(nèi)，構(gòu)建組織工程骨記為A組；單純?chǔ)?TCP植入對(duì)稱脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊記為B組；單純?chǔ)?TCP植入皮下記為C組。術(shù)后2周取材，分別行組織學(xué)觀察、免疫組化檢測(cè)，同時(shí)激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。結(jié)果體外成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，ALP染色以及茜素紅染色陽(yáng)性。組織學(xué)觀察可見，A組新生骨組織以及新生血管均較B組明顯，C組未見新生骨組織。免疫組化檢測(cè)顯示，A組Ⅰ型膠原、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31染色陽(yáng)性；B組Ⅰ型膠原、CD31染色部分陽(yáng)性；C組未見陽(yáng)性表達(dá)。免疫組化半定量檢測(cè)顯示，A、B兩組Ⅰ型膠原、CD31定量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，A組新生骨組織內(nèi)可見GFP表達(dá)，B、C組未見GFP標(biāo)記細(xì)胞。結(jié)論BMSC是組織工程骨早期形成的重要來源，但周圍成骨細(xì)胞并非新生骨組織主要來源;移植BMSC于骨膜下可促進(jìn)新生血管形成。

【關(guān)鍵詞】骨組織工程；綠色熒光蛋白；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是造血微環(huán)境中的一種重要細(xì)胞成分，獲取相對(duì)容易，在特定的理化環(huán)境和細(xì)胞因子誘導(dǎo)下，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞，且免疫原性弱，是組織工程理想的種子細(xì)胞來源[1-4]。然而，新生組織工程骨的細(xì)胞來源是體外植入BMSC還是體內(nèi)周圍組織中的成骨細(xì)胞，或兩者兼有，目前尚存爭(zhēng)議。綠色熒光蛋白(GFP)在體內(nèi)可穩(wěn)定而較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，因此以腺病毒為載體的GFP體外標(biāo)記BMSC可直接追蹤植入BMSC的分化與轉(zhuǎn)歸，為BMSC對(duì)骨組織工程的成骨作用提供有力證據(jù)，同時(shí)也可為組織工程種子細(xì)胞的標(biāo)記提供一種可靠的方法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級(jí)成年雄性比格犬6只，體重10～15 kg(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物中心)。

實(shí)驗(yàn)材料：重組腺病毒(Ad-GFP)；β-磷酸三鈣(β-TCP，上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院)；Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)HyClone公司)；地塞米松、β-磷酸甘油鈉、L-2-磷酸抗壞血酸、茜素紅(美國(guó)Sigma公司)；Ⅰ型膠原、CD31試劑(英國(guó)Abcam公司)；Masson三色法染色試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物制品有限公司)；熒光光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；顯微攝影數(shù)碼相機(jī)(美國(guó)KODAK公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Ad-GFP擴(kuò)增與純化

使用Ad-GFP轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，待90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收集細(xì)胞和上清，在 37℃與-80℃條件下反復(fù)凍融、裂解細(xì)胞，離心收集上清，獲取病毒，同法進(jìn)行大量擴(kuò)增；采用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，采用病毒噬菌斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度(PFU)，然后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2BMSC分離培養(yǎng)、擴(kuò)增以及誘導(dǎo)分化鑒定

比格犬麻醉后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，于髂后上棘穿刺抽取骨髓液4～5 mL，加入50 mL肝素化的無菌離心管內(nèi)，與20 mL 10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)混勻，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。分別于3、6 d后半量換液，9 d后完全換液，以后每3日完全換液1 次。待原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積的90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按1∶3接種于新細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。傳至第3代進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將第2代純化的BMSC細(xì)胞懸液(調(diào)整細(xì)胞密度為l×105/mL)接種于十二孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到容器底部的60%～70%時(shí)，一部分孔內(nèi)加入10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、50 μmol/L L-2-磷酸抗壞血酸的DMEM成骨條件培養(yǎng)液；另一部分細(xì)胞作為陰性對(duì)照，仍用普通含胎牛血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每3日完全換液1次。成骨誘導(dǎo)1～2周后行ALP染色，3周后行茜素紅染色。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及ALP染色、茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)形成情況[5]。

1.2.3Ad-GFP標(biāo)記BMSC

取第3代BMSC，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，在其培養(yǎng)液中加入PFU為1×109(每皿細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè))的Ad-GFP，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察[6]。

1.2.4BMSC與β-TCP體外復(fù)合培養(yǎng)

Ad-GFP標(biāo)記的BMSC體外擴(kuò)增后3 d，行細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用0.25%胰蛋白酶消化并收集腺病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，離心后將1 mL DMEM 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液接種于β-TCP上，接種密度約2×107個(gè)/cm3。

1.2.5比格犬模型建立及分組

比格犬以2.5%異戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)靜脈麻醉后，后肢及背部常規(guī)備皮并消毒鋪巾。于脛骨內(nèi)側(cè)縱行切開皮膚，弧形切開骨膜后，剝離脛骨內(nèi)側(cè)骨膜，將植入材料置于骨膜下，最后將骨膜囊狀縫合(圖1)；于比格犬背側(cè)行弧形小切口，將材料置于皮下，縫合皮膚。根據(jù)放置材料部位的不同以及植入材料是否為復(fù)合細(xì)胞分成以下3組：A組為將復(fù)合BMSC的β-TCP植入于比格犬脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊內(nèi)；B組為單純植入β-TCP于比格犬脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊內(nèi)；C組為單純植入β-TCP于比格犬皮下，術(shù)后肌肉注射青霉素80萬(wàn)U/次，每日2次，持續(xù)3 d。術(shù)后3周取材，進(jìn)行檢測(cè)。

圖1　 手術(shù)縫合比格犬脛骨內(nèi)側(cè)骨膜囊

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1ALP及茜素紅染色觀察

體外成骨誘導(dǎo)后第1～2周行ALP染色觀察，第3周行茜素紅染色觀察。

1.3.2組織學(xué)觀察

取材后肉眼觀察新生組織結(jié)構(gòu)。將標(biāo)本用4%甲醛溶液固定后，脫鈣、石蠟包埋、切片、HE 染色及Masson 三色法染色，顯微鏡下觀察骨膜下及皮下新生組織。

1.3.3免疫組化檢測(cè)

比格犬脛骨內(nèi)側(cè)骨膜下取材，采用4%甲醛溶液固定，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周，行石蠟切片；正置顯微鏡下觀察Ⅰ型膠原、CD31染色情況。

1.3.4GFP表達(dá)檢測(cè)

術(shù)后3周全部取材，4%甲醛溶液固定，10%EDTA脫鈣4周，行冰凍切片；激光共聚焦顯微鏡下觀察新生組織GFP表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Stata/SE12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Ad-GFP擴(kuò)增與純化

Ad-GFP感染HEK293A細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)貼壁不牢，部分細(xì)胞漂浮或死亡；熒光顯微鏡下，24 h后發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，轉(zhuǎn)染率超過80%(圖2)，48 h 后有較多細(xì)胞漂浮，仍可發(fā)出綠色熒光。

2.2BMSC分離培養(yǎng)及GFP 標(biāo)記

原代培養(yǎng)BMSC 24 h后細(xì)胞開始貼壁，48 h后大量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈短小梭形或多角形，排列不規(guī)則；培養(yǎng)1周左右，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速并互相融成集落，呈旋渦狀排列(圖3a)。Ad-GFP感染BMSC后，細(xì)胞仍貼壁生長(zhǎng)，呈梭形、三角形或多角形，但其增殖速度有所降低，部分BMSC漂浮。熒光顯微鏡下，24 h后可見綠色熒光表達(dá)，48 h后細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈熒光，呈現(xiàn)全細(xì)胞分布，感染率達(dá)到60%～80%(圖3b)。

圖2　24 h后熒光顯微鏡下腺病毒轉(zhuǎn)染率超過80%(×40)

圖3BMSC分離培養(yǎng)及GFP 標(biāo)記后情況a. 光鏡下BMSC培養(yǎng)1周情況(×40)b.Ad-GFP轉(zhuǎn)染BMSC24 h后轉(zhuǎn)染率為60%～80%(×100)

2.3BMSC與β-TCP體外復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果

將GFP標(biāo)記的BMSC接種到β-TCP材料48 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BMSC在材料上生長(zhǎng)良好，細(xì)胞熒光表達(dá)較強(qiáng)(圖4)。

圖4　48 h后熒光顯微鏡下BMSC在材料上生長(zhǎng)情況(×100)

2.4ALP及茜素紅染色觀察

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSC后1～2周，ALP染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)呈紫色(下頁(yè)圖5a)；3周時(shí)茜素紅染色陽(yáng)性，細(xì)胞外基質(zhì)中可見典型紅色礦化結(jié)節(jié)(下頁(yè)圖5b)。

2.5大體觀察及組織學(xué)觀察

術(shù)后2 d，全部比格犬均存活，無異常死亡。切口均干燥、無分泌物，未見明顯感染。

術(shù)后取材， A組肉眼見骨膜下新生骨明顯(圖6a)，B組僅見部分新生軟骨樣組織及纖維樣組織結(jié)構(gòu)(圖6b)，C組未見新生骨及軟骨樣組織。

圖5BMSC成骨誘導(dǎo)后ALP染色及茜素紅染色情況

a. BMSC成骨誘導(dǎo)2周后ALP染色陽(yáng)性(×100) b. BMSC成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色陽(yáng)性(×100)

圖6A、B組大體觀察a. A組大體觀察b. B組大體觀察

A組光鏡下HE染色以及Masson染色可見：脛骨骨膜下大量新生編織骨明顯存在，且新生血管較B組明顯，B組、C組骨膜下未見明顯骨組織形成(圖7)。

圖7術(shù)后A、B組組織學(xué)觀察a. A組HE染色(×40) b. B組HE染色(×40) c. A組Masson染色(×100) d. B組Masson染色(×100)

2.6免疫組化檢測(cè)結(jié)果

免疫組化染色顯示A組Ⅰ型膠原以及CD31檢測(cè)陽(yáng)性(圖8a、8b)；B組Ⅰ型膠原、CD31染色部分陽(yáng)性(圖8c、8d)；C組未見陽(yáng)性表達(dá)。

免疫組化半定量法[7]檢測(cè)顯示A組表達(dá)Ⅰ型膠原、CD31較 B組明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖8免疫組化染色結(jié)果a. A組Ⅰ型膠原免疫組化染色(×100) b. A組CD31免疫組化染色(×100) c. B組Ⅰ型膠原免疫組化染色(×100)d. B組CD31免疫組化染色(×100)

表1　免疫組化半定量檢測(cè)A、B組Ⅰ型膠原、CD31比較

2.7GFP對(duì)BMSC的體內(nèi)示蹤結(jié)果

在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)A組骨膜下新生骨組織細(xì)胞仍能表達(dá)GFP(圖9)，B組、C組均未見GFP表達(dá)。

圖9激光共聚焦顯微鏡下A組新生骨組織表達(dá)GFP (×200)

3討論

3.1骨組織工程新生骨細(xì)胞來源

BMSC為骨髓中非造血干細(xì)胞，具有橫向或跨胚層向多種組織細(xì)胞分化的潛力，是骨、軟骨等組織工程較理想的種子細(xì)胞[8-9]；由于其免疫原性低，可作為基因轉(zhuǎn)染的適宜細(xì)胞載體, 同時(shí)也可提供建立在細(xì)胞基礎(chǔ)上的治療方法，其中包括自體及異體細(xì)胞治療，其應(yīng)用前景樂觀[10-16]。近年來，在骨組織工程研究新生骨組織細(xì)胞來源及其作用方面的觀點(diǎn)存在許多爭(zhēng)議。新生組織工程骨細(xì)胞來源主要為外植入的BMSC還是體內(nèi)周圍細(xì)胞，目前尚不明確。

3.2支架材料及細(xì)胞標(biāo)記方法的選擇

目前關(guān)于骨組織工程支架材料如人工合成材料、天然衍生材料、新型復(fù)合材料等的研究較多[17-19]。無機(jī)材料中β-TCP在骨組織工程中應(yīng)用廣泛，其主要成分類似于骨基質(zhì)的無機(jī)成分，具有良好的生物相容性、降解性以及骨傳導(dǎo)性，其降解產(chǎn)物鈣離子可促進(jìn)局部骨生成[20-22]。本實(shí)驗(yàn)所使用的β-TCP為經(jīng)特定材料制備技術(shù)形成的多孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑400 μm，孔隙率大于70%，有利于BMSC生長(zhǎng)，提高成骨能力[21]。采用該材料構(gòu)建組織工程骨時(shí)，若無合適的種子細(xì)胞標(biāo)記方法，勢(shì)必干預(yù)最終的效果評(píng)估。目前常用GFP標(biāo)記干細(xì)胞的方法主要包括：病毒載體轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染以及直接從GFP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中獲取[23-24]，其中熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的一種新型細(xì)胞示蹤技術(shù)，具有易于檢測(cè)、表達(dá)穩(wěn)定以及可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞觀察等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已廣泛使用[25]。研究表明，以GFP示蹤、腺病毒為載體轉(zhuǎn)染BMSC，腺病毒不會(huì)對(duì)BMSC產(chǎn)生毒性，BMSC感染率較高，且不影響其體外多向分化潛能，為研究BMSC在體內(nèi)分化和轉(zhuǎn)歸較好的方法[26-27]。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

多項(xiàng)研究[28]表明，骨膜內(nèi)富含成骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞，是形成新生骨的重要來源。實(shí)驗(yàn)選用比格犬研究種子細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)歸，將標(biāo)記細(xì)胞的材料不通過細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)而直接植入骨膜囊內(nèi)，在此特定環(huán)境內(nèi)促進(jìn)骨生成[29-31]。A組新生組織來自于外植入的BMSC以及自體骨膜下的成骨細(xì)胞；B組新生組織來源于自體骨膜囊內(nèi)的成骨細(xì)胞；C組單純將材料植入皮下，可避免體內(nèi)、外成骨細(xì)胞的長(zhǎng)入。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組新生骨組織具備表達(dá)GFP的能力，并且新生骨組織以及新生血管較B、C兩組明顯。這表明外植入的BMSC在生成組織工程骨的過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也提示移植BMSC能夠在骨膜下促進(jìn)新生骨內(nèi)微血管生成。

3.4問題及展望

由于在生成骨組織過程中，轉(zhuǎn)染的BMSC表達(dá)GFP的能力隨時(shí)間增加而逐漸下降[32]，為GFP標(biāo)記技術(shù)長(zhǎng)期檢測(cè)帶來困難。為了進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的觀察以明確BMSC在體內(nèi)的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸，需在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索出一種更為有效的種子細(xì)胞標(biāo)記方法，對(duì)骨組織內(nèi)新生微血管的數(shù)量以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子進(jìn)行更為精確的檢測(cè)。

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(收稿：2015-05-28；修回：2015-10-01)

(本文編輯：李昱霏)

Green fluorescent protein genes transdution and tracer the differentiation of bone mesenchymal stem cells in beaglesZHANGHai-feng1,2,DUZi-jing1,ZHAODan-yang1,HANXiu-guo2,HANDong1

.DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine1,Shanghai200011,China;ShanghaiKeyLaboratoryofOrthopaedicImplants2,Shanghai200011,China

【Abstract】ObjectiveTo observe differentiation and transformation of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) labeled with green fluorescent protein (GFP) technology in bone tissue engineering. Methods Adenoviral delivery of GFP genes (Ad-GFP) transfected to canine BMSCs. The morphology of BMSCs, alkaline phosphatase (ALP) and alizarin red staining were observed with the help of invert light microscope, and the expression of GFP was scrutinized by using fluorescence microscope. Once succeeding, the centrifuged BMSCs were collected and mixed with beta-tricalcium phosphate (β-TCP), then they were transplanted under tibial periosteum. The beagles using the above way to construct tissue engineering bone were marked group A, which only with β-TCP transplated into tibial periosteum were marked group B, and which with β-TCP subcutaneously placed were marked group C. In the postoperative 2 weeks, histology and immunohistochemistry results were studied and the expression of GFP was observed by laser scanning confocal microscope. Results After induced differentiation in vitro, observing BMSCs found that ALP staining and alizarin red mineralization nodules staining were positive. Histology observation revealed that compared with group B, abundant bone formed and neovascularized significantly in group A, and bone formation did not exist in group C. Immunohistochemistry staining showed that type Ⅰ collagen and platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) were positive in group A, type Ⅰ collagen and CD31 were positive partly in group B rather than group C. The expression of typeⅠcollagen and CD31 were analyzed in group A and group B by the way of semi-quantitative immunohistochemical staining. The value of type Ⅰ collagen and CD31 had significant differences between group A and group B. The expression of GFP was observed by laser scanning confocal microscope in group A not in group B nor group C. Conclusion BMSCs is the important factor to accelerate the generation of tissue engineering bone instead of osteoblasts in surrounding. They could promote endothelial cell tube formation inside periosteum.

【Key words】Bone tissue engineering; Green fluorescent protein; Bone mesenchymal stem cells

Corresponding author:HAN DongE-mail: handong12000@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1673-7083.2016.02.012

通信作者：韓冬E-mail: handong12000@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81272132)