星毛冠蓋藤中總黃酮超聲乙醇浸提工藝的優(yōu)化

謝金攀　謝裕安　楊　帆　毛賽蘭　廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院　530021　南寧市河堤路71號梁瓊平　金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院　545708龐趙生　金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)藥研究所　545708

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星毛冠蓋藤中總黃酮超聲乙醇浸提工藝的優(yōu)化

謝金攀謝裕安楊帆毛賽蘭廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院530021南寧市河堤路71號
梁瓊平金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院545708
龐趙生金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)藥研究所545708

摘要目的：優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的超聲乙醇浸提工藝。方法：以料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲處理時間、浸泡時間為考察因素，以總黃酮含量為評價指標，以正交試驗優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的提取工藝。結(jié)果：優(yōu)選出的最佳提取工藝為：在40℃水浴，超聲功率100 W的條件下，加入20倍量65%乙醇，室溫下浸泡星毛冠蓋藤3 h，超聲提取50 min。結(jié)論：所選工藝合理、可行，可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

關(guān)鍵詞星毛冠蓋藤；總黃酮；超聲提??；正交試驗

星毛冠蓋藤（Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.）為虎耳草科冠蓋藤屬植物，分布于湖南、廣東、廣西等省，具有祛風除濕、散瘀止痛、消腫解毒功能，主治腰腿酸痛、風濕麻木、跌打損傷、骨折、外傷出血、癰腫瘡毒［1］。其同屬植物冠蓋藤（Pileostegia viburnoides Hook.f.et Thoms.）具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理活性［2-3］。目前有關(guān)星毛冠蓋藤的藥理研究尚無文獻報道，實驗證實，星毛冠蓋藤中含有黃酮類化合物［4］，而黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化等功能［5］。超聲提取因其能縮短提取時間、效率高、溶劑用量少、低溫不破壞有效成分等優(yōu)點，廣泛用于天然物質(zhì)的提取。本實驗優(yōu)選星毛冠蓋藤中總黃酮的超聲乙醇浸提工藝，為后續(xù)的開發(fā)利用提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1　實驗材料

1.1儀器AL204電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，最大功率：100 W，頻率：28/45 kHz）。

1.2藥材星毛冠蓋藤莖和枝，2014年7月采于廣西金秀瑤族自治縣，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物研究所鑒定為星毛冠蓋藤，烘干，粉碎，過40目篩，備用。

1.3試劑蘆丁對照品（上海彩佑實業(yè)有限公司，批號為KB140211，純度≥98%）；無水乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；氯化鋁（分析純，臺山市粵僑試劑塑料有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1星毛冠蓋藤中總黃酮的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品6.0 mg，置25 ml容量瓶中，加適量60%乙醇溶解并定容，搖勻，得0.24 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，置250 ml具塞玻璃錐形瓶中，超聲提取前無預(yù)浸泡處理，加入60%乙醇200 ml，在40℃水浴（用儀器的水浴加熱功能和流動水控制溫度），超聲功率100 W的條件下，28/45 kHz（每5秒轉(zhuǎn)換頻率1次）超聲提取40 min。用相應(yīng)濃度乙醇補足重量，搖勻，抽濾，取續(xù)濾液，放冷至室溫，作為供試品溶液。

2.1.3反應(yīng)試劑的添加精密吸取一定量待測溶液，加入25 ml容量瓶中，再精密加入0.1 mol/L AlCl3溶液1.0 ml，反應(yīng)40 min后，加60%乙醇定容至刻度。供試品溶液與AlCl3溶液反應(yīng)會產(chǎn)生少量的白色絮狀沉淀，定容前過濾。

2.1.4最佳吸收波長的選擇以試劑為空白，取適量對照品溶液和供試品溶液，按“2.1.3”項下方法操作后在190～1 100 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果蘆丁在可見光區(qū)域有唯一波峰出現(xiàn)于412 nm處，樣品在可見光區(qū)域無吸收波峰出現(xiàn)，在紫外光區(qū)域蘆丁與樣品于270 nm有一致的波峰，故選擇270 nm為最佳吸收波長。加三氯化鋁后光譜掃描圖見圖1。

2.1.5標準曲線的測定分別精密吸取對照品溶液0 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，置25 ml容量瓶中，按“2.1.3”項下方法精密加入反應(yīng)試劑，顯色40 min，加60%乙醇至刻度，搖勻。以第1份為空白，在270 nm波長處測定吸光度（A）。以蘆丁對照品溶液的濃度（C）為橫坐標，A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A= 35.732C-0.0002（R2=0.9999），蘆丁對照品溶液的濃度在0～0.048 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.6樣品含量測定精密量取供試品溶液2 ml，按“2.1.3”項下方法操作，以不加供試品溶液為空白，在270 nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算各樣品中總黃酮含量。

2.2方法學考察

2.2.1精密度試驗精密量取供試品溶液2 ml，按“2.1.3”項下方法操作，測定吸光度，連續(xù)測定6次。結(jié)果RSD＝0.18%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.2穩(wěn)定性試驗精密量取供試品溶液2 ml，按“2.1.3”項下方法操作，分別在0 h、0.5 h、1.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h測定吸光度。結(jié)果RSD＝1.02%（n＝7），表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3重復性試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再分別精密量取供試品溶液2 ml，按“2.1.3”項下方法操作，測定吸光度。結(jié)果RSD＝0.53%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.4加樣回收率試驗精密稱取0.5 g已知總黃酮含量（2.29 mg/g）的星毛冠蓋藤粉末，共18份，分別倒入50 ml具塞尖底玻璃離心瓶中，其中9份分為3組，分別精密加入7.63 ml、9.54 ml、11.45 ml的蘆丁對照品溶液［6］，另外9份作為本底管［7］，超聲提取前未浸泡，各加60%乙醇至20倍量、超聲提取40 min，按“2.1.5”項下方法操作，測定總黃酮的含量。計算得平均加樣回收率為98.85%，RSD＝1.20%（n＝9）。

2.3單因素試驗

2.3.1超聲功率單因素試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共5份，各加入15倍量55%乙醇，超聲提取前未浸泡，分別在60 W、70 W、80 W、90 W、100 W超聲功率下超聲提取40 min，按“2.1.5”項下方法測定總黃酮含量。結(jié)果如圖2所示，隨超聲功率的提高（100 W內(nèi)）總黃酮提取率呈線性上升，故選擇超聲功率為100 W。

2.3.2料液比單因素試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共5份，分別加入5、10、15、20、25倍量55%乙醇，超聲提取前未浸泡，超聲提取40 min，按“2.1.5”項下方法測定總黃酮含量。結(jié)果如圖3所示，用20倍量的乙醇提取得到的總黃酮含量最高。

2.3.3乙醇體積分數(shù)單因素試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共5份，分別加入20倍量的55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，超聲提取前未浸泡，超聲提取40 min，按“2.1.5”項下方法測定總黃酮含量。結(jié)果如圖4所示，在65%乙醇中提取得到的總黃酮含量最高。

圖1　光譜掃描圖

圖2　超聲功率對總黃酮含量的影響

圖3　料液比對總黃酮含量的影響

圖4　乙醇體積分數(shù)對總黃酮含量的影響

圖5　超聲提取時間對總黃酮含量的影響

2.3.4超聲提取時間單因素試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共5份，各加入20倍量的65%乙醇超聲提取，超聲提取前未浸泡，超聲處理時間分別為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，按“2.1.5”項下方法測定總黃酮含量。結(jié)果如圖5所示，當提取50 min時，總黃酮的溶出已達到極限。

2.3.5浸泡時間單因素試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共5份，分別加入20倍量的65%乙醇室溫下浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，超聲提取50 min，按“2.1.5”項下方法測定總黃酮含量。結(jié)果如圖6所示，浸泡2 h后總黃酮含量已趨于平衡。

2.4正交試驗優(yōu)選提取工藝根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在40℃水浴和超聲功率100 W的條件下，選取浸泡時間（A）、料液比（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、超聲提取時間（D）為考察因素，以總黃酮含量為評價指標，選用L9（34）正交表進行試驗，因素水平見表1。正交試驗結(jié)果見表2。取離差平方和（SS）最小的因素A為誤差列［8］，方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3的統(tǒng)計學分析結(jié)果可知，在考察范圍內(nèi)，各因素影響提取工藝的主次順序為B＞C＞D＞A，即料液比＞乙醇體積分數(shù)＞超聲提取時間＞浸泡時間，因素B、C 和D對提取工藝的影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即用20倍量的65%乙醇室溫下浸泡3 h后超聲提取50 min。

2.5驗證試驗精密稱取星毛冠蓋藤粉末10.0 g，共3份，按上述優(yōu)選的最佳提取工藝進行提取，其中3份測得總黃酮含量分別為5.921 mg/g、5.918 mg/g、5.919 mg/g，平均總黃酮含量為5.920 mg/g，高于表2中的最高值，表明所選工藝穩(wěn)定、可行，可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

3　討　論

因為高溫會破壞成分，所以本研究未采用回流提取法和熱水提取法。隨著提取時間的增加，由于超聲的熱效應(yīng)，水浴溫度會有所升高，故本實驗同時采用流動水控制水浴溫度。雖然黃酮類化合物因分子中具有酚羥基而顯酸性，但堿性條件下的處理和后期的酸化對成分研究均產(chǎn)生一定程度的干擾，因此不將溶劑的pH值作為考察因素。綜上考慮，本實驗在40℃水浴，以超聲功率、料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間、浸泡時間為考察因素，通過單因素和正交試驗，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

(4) 盾尾間隙的大小由盾構(gòu)機機型和刀具布置決定，過小的盾尾間隙對于減小地表沉降有一定作用，但結(jié)合工程實際，盾尾間隙過小亦可能對盾構(gòu)機掘進姿態(tài)調(diào)整帶來不便。因此需通過全面考慮和權(quán)衡再來進行盾構(gòu)機機型的選取[14]。

實驗表明在其它條件不變時，60～100 W范圍內(nèi)的超聲功率對星毛冠蓋藤中總黃酮的提取率有所影響（圖2），但100 W以上的超聲功率是否更佳則有待進一步探究。同等條件下，隨著料液比的增加，溶劑過多，可能是由于分散了作用于藥材的超聲能量，導致總黃酮的提取量更低（圖3）。不同體積分數(shù)的乙醇可以提取不同極性的黃酮，高濃度的乙醇（90%～95%）適用于游離黃酮的提取，60%濃度左右的乙醇適用于黃酮苷類的提取［9］，從圖4和表2結(jié)果可以推測星毛冠蓋藤中總黃酮以黃酮苷類為主，而含游離黃酮較少。正交設(shè)計沒有空白列時，雖然重復試驗可提高試驗精確度和可靠性，但明顯增加了試驗次數(shù)。根據(jù)專業(yè)書籍［8］，選擇離差平方和中最小者作近似估計也是允許的。盡管在表3中取離差平方和（SS）最小的因素A（浸泡時間）為誤差項，但從圖6能夠看出浸泡作為超聲提取的預(yù)處理也很有必要。提取時間和浸泡時間越長，雜質(zhì)也產(chǎn)生越多，超出一定范圍，對總黃酮的提取可產(chǎn)生不利影響（圖5、圖6）。兼顧節(jié)約能源和節(jié)省時間，本實驗優(yōu)選最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即用20倍量的65%乙醇室溫下浸泡3 h后超聲提取50 min。根據(jù)驗證試驗結(jié)果，表明提取工藝合理、可行，可用于星毛冠蓋藤中總黃酮的提取。

圖6　浸泡時間對總黃酮含量的影響

表1　因素水平表

表2　正交試驗方案安排與結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

參考文獻

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（2015－12－29收稿/編輯陳明偉）

基金項目：廣西衛(wèi)生廳適宜技術(shù)研究與開發(fā)項目（編號：S201417-05）

中圖分類號：R284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1003-0719（2016）01-0069-05