生物誘導(dǎo)法所產(chǎn)沉香不同部位中3種色酮的含量測定

張林杰，吳澤青，林勵，陳康，李靜

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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生物誘導(dǎo)法所產(chǎn)沉香不同部位中3種色酮的含量測定

張林杰，吳澤青，林勵，陳康，李靜

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 測定生物誘導(dǎo)法所得沉香不同部位色酮類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，評價(jià)生物誘導(dǎo)法刺激結(jié)香的效果。方法 采用高效液相色譜法(HPLC法)測定生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)所得沉香不同部位中aquilarone B、aquilarone C及(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羥基-5,6,7,8-四氫色酮(CX16)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，色譜柱為waters symmetry shield C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為234 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 Aquilarone B、aquilarone C、CX16分別在14.32～716、0.884～44.2、1.54～77 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。白木香木質(zhì)部外側(cè)黑色結(jié)香部分(B部分)中，B1 樣品的aquilarone B、aquilarone C質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.411 8、1.021 6 mg/g，B4樣品的CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.728 5 mg/g；而內(nèi)側(cè)棕色初結(jié)香部分(Z部分)所測得色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于B部分，其中Z1樣品的aquilarone B、aquilarone C質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為1.424 9、0.585 9 mg/g，Z4樣品的CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.158 9 mg/g。結(jié)論 生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)所得沉香不同部位3種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大差異，木質(zhì)部外側(cè)黑色結(jié)香部分中3種色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于內(nèi)側(cè)棕色初結(jié)香部分，推測該法是由外而內(nèi)誘導(dǎo)白木香木質(zhì)部，逐步形成沉香藥材。

關(guān)鍵詞:生物誘導(dǎo)法； 沉香； 高效液相色譜法； 色酮

沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg含有樹脂的木材，味辛、苦、微溫，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[1]，主要用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[2]等癥。此外，沉香也是名貴香料的重要原料。白木香受到外界刺激后才能產(chǎn)生沉香，而且產(chǎn)量較低，傳統(tǒng)的人工結(jié)香方法如火燙法、砍傷法、打洞法等存在結(jié)香產(chǎn)量低、周期長、人工成本高等問題，導(dǎo)致市場上的優(yōu)質(zhì)沉香資源稀缺。色酮為沉香的活性成分之一，已有報(bào)道從沉香中分離得到多種色酮類成分[3-8]，并建立了HPLC法測定沉香中2種色酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，吳澤青[9]等采用HPLC法測定了3種不同方法所形成沉香藥材中aquilarone B、aquilarone C等5種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。生物誘導(dǎo)法是一種可在短期內(nèi)誘導(dǎo)白木香結(jié)香的新方法[10]，然而所得藥材質(zhì)量尚待評價(jià)。為此，筆者開展了本項(xiàng)研究，考察生物誘導(dǎo)法的結(jié)香效果及機(jī)制，以期為沉香誘導(dǎo)結(jié)香技術(shù)的發(fā)展提供一些試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters 2998PDA檢測器(美國Waters公司)；XS225A型電子天平(德國Precisa公司)；BP211D型電子天平(Sartorius公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2試劑

甲醇(AR，廣東光華化學(xué)試劑有限公司，批號：20120918)；H3PO4(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20120821)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)。aquilarone B、aquilarone C及(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羥基-5,6,7,8-四氫色酮(CX16)對照品(自制，經(jīng)核磁質(zhì)譜等方法測定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)。

1.3材料

沉香藥材采自廣東省五華縣七輋徑沉香基地，其樹種經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心林勵研究員鑒定，為瑞香科沉香屬白木香Aquilariasinensis。2013年10月對基地4年樹齡白木香進(jìn)行生物誘導(dǎo)法結(jié)香實(shí)驗(yàn)，于2014年4月采白木香樹干中間木質(zhì)部黑色部分，將其中80 cm長的1段平均分為20 cm的4段，自上而下依次編號為1～4，且將每段按照顏色(外黑、內(nèi)棕黃)分成木質(zhì)部外側(cè)黑色結(jié)香部分(B)和內(nèi)側(cè)棕色初結(jié)香部分(Z)，分別編號為B1、Z1，B2、Z2，B3、Z3，B4、Z4。對照藥材為采自廣東省電白縣沉香基地的自然結(jié)香樣品。

2方法與結(jié)果

2.1混合對照品儲備溶液的制備

分別取aquilarone B、aquilarone C及CX16適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到aquilarone B、aquilarone C、CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.16、0.442、0.77 mg/mL的混合對照品儲備溶液。

2.2供試品溶液的制備

取沉香藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL平底燒瓶中，加入85%(體積分?jǐn)?shù))甲醇12.5 mL，90 ℃水浴回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液并定容至25 mL。0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為waters symmetry shield C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4，梯度洗脫，程序見表1；流速為1 mL/min；檢測波長為234 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL 。

分別精密吸取混合對照品儲備溶液、供試品溶液10 μL，分別按上述條件進(jìn)樣測定。結(jié)果aquilarone B、aquilarone C與CX16色譜峰均能達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系的考察

精密吸取混合對照品儲備溶液1 mL，至10 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，搖勻。再分別精密吸取上述溶液0.2、0.5、1、2、5 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度(剩下的1.3 mL溶液直接作為1個質(zhì)量濃度)，搖勻，配制成aquilarone B質(zhì)量濃度分別為14.32、35.8、71.6、143.2、358、716 μg/mL，aquilarone C 質(zhì)量濃度分別為0.884、2.21、4.42、8.84、22.1、44.2 μg/mL，CX16質(zhì)量濃度分別為1.54、3.85、7.7、15.4、38.5、77 μg/mL的混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以各對照品的質(zhì)量濃度(ρ，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到各自的回歸曲線。3種色酮回歸方程見表2。

表1沉香中3種色酮成分的HPLC洗脫條件

Table 1HPLC elution conditions for 3 kinds of chromones in agarwood

t/minφ(乙腈)/%φ(0.1%H3PO4)/%01387282278312674413070473565654555808515841387851387

0.160.140.120.080.040.000.160.140.120.080.040.00051015202530t/min321BA321AUAU

1.aquilarone B； 2.CX16； 3.aquilarone C。

圖1混合對照品儲備溶液(A)、供試品溶液(B)的HPLC色譜圖

Figure 1HPLC results of mixed references(A) and the sample(B)

表2　沉香中3種色酮的線性回歸方程

2.5精密度試驗(yàn)

取一定質(zhì)量濃度(aquilarone B、aquilarone C、CX16質(zhì)量濃度分別為716、44.2、77 μg/mL)的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項(xiàng)下方法測定并記錄峰面積。結(jié)果aquilarone B、aquilarone C、CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.49%、0.78%、0.64%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取B1樣品約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算得aquilarone B、aquilarone C、CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.48%、0.67%、1.41%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取B1供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、32 h精密吸取10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果aquilarone B、aquilarone C、CX16峰面積的RSD值分別為0.35%、0.44%、0.66%，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

分別取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的B3樣品約0.5 g，精密稱定，平行操作6份，分別精密加入混合對照品溶液(aquilaroneB、aquilaroneC和CX16質(zhì)量濃度分別為0.7、0.15、0.2 mg/mL)1 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法提取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.9樣品的測定

分別取9批樣品，各約1.0 g，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。

表3　沉香中3種色酮的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4　9批沉香樣品中3種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

3討論

從本文結(jié)果可見，B部分3種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于Z部分，B部分中aquilarone B、aquilarone C質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的均為B1，CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為B4；Z部分中，aquilarone B、aquilarone C質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的均為Z1，CX16質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的為Z4。與自然結(jié)香的沉香樣品相比，B部分和Z1部分的aquilarone B、aquilarone C質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高。

生物誘導(dǎo)法刺激所得沉香3種色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，與自然結(jié)香的沉香藥材進(jìn)行對比，B部分有2種色酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于自然結(jié)香樣品，表明此新方法刺激所得沉香的質(zhì)量較好；從不同部位來看，B部分以B1中色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，Z部分以Z1中色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，B部分的整體色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于Z部分，提示該法誘導(dǎo)沉香結(jié)香過程可能具有由外逐步向內(nèi)的特點(diǎn)，Z部分可能是由白木到沉香形成過程的中間階段。本文通過對生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)結(jié)香藥材不同部位3種色酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，為該新方法結(jié)香效果的評價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時為其機(jī)制研究提供了參考依據(jù)。生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)白木香結(jié)香是一個復(fù)雜的過程，而對于所結(jié)沉香的質(zhì)量評價(jià)及誘導(dǎo)結(jié)香機(jī)制的研究也是一個系統(tǒng)而復(fù)雜的工作，本文所做研究只是系列研究的一個組成部分，在后續(xù)的工作中會對其他相關(guān)方面開展進(jìn)一步探究。

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(責(zé)任編輯：劉曉涵)

Determination of 3 kinds of chromones in different parts of agarwood by biology induction

ZHANG Linjie,WU Zeqing,LIN Li,CHEN Kang,LI Jing

(SchoolofChineseHerbalMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To determine the chromones′ contents in the agarwood generated by biology induction method and evaluate the effect of the new technology. Methods High performance liquid chromatography (HPLC) was used for the determination of aquilarone B,aquilarone C and (5S,6R,7R,8S)-2- [2- (4- methoxy-phenyl)-ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-chromones (CX16) in different parts of the agarwood. Waters Symmetry Shield C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm) was employed eluting gradiently with acetonitrile-0.1% phosphoric acid water. The flow rate was 1 mL/min,and the detection wavelength was 234 nm. The column temperature was 30 ℃,and the injection volume was 10 μL. Results The linear ranges of aquilarone B,aquilarone C and CX16 were 14.32-716,0.884-44.2,and 1.54-77 μg/mL,respectively. B1 sample contained the highest contents of aquilarone B (3.411 8mg/g) and aquilarone C (1.021 6 mg/g) among the knot incense part (part B) located outside of Aquilaria sinensis xylem,and the highest content of CX16 is 0.728 5 mg/g in B4 sample. The highest contents of aquilarone B (1.424 9 mg/g) and aquilarone C (0.585 9 mg/g) among the little knot incense part (part Z) located inside of Aquilaria sinensis xylem was in Z1 sample,and the highest content of CX16 is 0.158 9 mg/g in Z4 sample among part Z. Conclusion The contents of 3 chromones varied in different parts of the agarwood induced by biological stimulation. They were significantly higher in part B than in part Z. The new method might affect the xylem with generating agarwood gradually from outside to inside.

Key words:biologically induced method; agarwood; HPLC; chromones

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015092901

中圖分類號:R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0041-05

作者簡介：張林杰(1991—)，男，2013級碩士研究生，主要從事中藥炮制規(guī)范化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email：zhanglinjie1991@163.com；通信作者：林勵(1954—)，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥資源開發(fā)與新藥研究，電話：020-39358270，Email：LL76611@126.com。

基金項(xiàng)目：國家發(fā)改委高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2011-56)

收稿日期：2015-09-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-15 18:24網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1824.007.html