沙棘不同組織部位的抗氧化活性研究

王曉飛， 李 輝，2， 劉銘佩*， 焦海勝

（1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，甘肅蘭州730030；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000）

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沙棘不同組織部位的抗氧化活性研究

王曉飛1， 李 輝1，2， 劉銘佩1*， 焦海勝1

（1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，甘肅蘭州730030；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000）

摘要:目的 比較沙棘不同組織部位葉、莖和果實的抗氧化活性。方法 分別采用銅離子還原能力法（CUPRAC）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法測定沙棘葉、莖和果實的抗氧化活性，并比較其不同組織部位的抗氧化活性。結果 沙棘葉、莖和果實的DPPH自由基清除能力均低于沒食子酸，其清除DPPH自由基的半數(shù)有效量（IC50）分別為217.8、350.5和739.2 μg/mL；沙棘葉、莖和果實的Cu2 +的還原能力Tro1ox當量（TEAC值）分別為0.146、0.133 和0.057 μg/mL。結論 沙棘葉、莖和果實均具有一定的抗氧化性，其抗氧化能力的強弱順序為葉＞莖＞果實。

關鍵詞:沙棘；DPPH；CUPRAC；抗氧化活性

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.046

隨著分子生物學和醫(yī)學的迅速發(fā)展，人們對生物體中包含的大量自由基反應及其對人體所產(chǎn)生的危害有了越來越多的認識。研究表明，保持機體自由基產(chǎn)生與消除的平衡，防止自由基對細胞和組織的損傷，是預防細胞活力下降、機體衰老、色素形成、血管病變、細胞癌變、糖尿病及并發(fā)癥等80余種疾病的有效措施之一［1-3］。而減少機體氧化損傷的最有效方法是補充抗氧化劑。沙棘（HiPPoPhae rhamnoides Linn）又名醋柳、酸刺，為胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或小喬木，是蒙古族和藏族的慣用藥材，具有止咳化痰、消食化滯、活血散瘀等功效［4］。我國沙棘資源豐富，占世界沙棘資源總面積的90％，廣泛栽植于黃土高原及三北地區(qū)，用于減少水土流失、恢復植被、改善生態(tài)環(huán)境，具有很高的藥用、生態(tài)和經(jīng)濟價值。沙棘葉、莖和果實中含有豐富的微量元素和百種生物活性物質(zhì)［5］，研究證明，沙棘葉、莖和果實均具有抗氧化活性［6-11］。然而，由于抗氧化活性測定方法有多種，目前尚無標準的測定方法，其測定標準、單位表述不統(tǒng)一，關于沙棘葉、莖和果實的抗氧化活性數(shù)據(jù)之間不能有效的進行統(tǒng)計比較［12］。此外，由于沙棘葉、莖和果實化學成分的復雜性，不能只用一種方法測定其抗氧化活性，需要聯(lián)合采用多種方法反映其抗氧化活性［12］。鑒于DPPH法中檢測試劑DPPH自由基穩(wěn)定易得［13］及CUPRAC法其檢測環(huán)境接近于生理環(huán)境［14］，為了比較沙棘不同組織部位葉、莖和果實的抗氧化活性，本文分別采用銅離子還原能力法（CUPRAC）和DPPH法測定沙棘葉、莖和果實的抗氧化活性，并比較其不同組織部位的抗氧化活性。

1 材料與儀器

UV-2450型紫外分光光度儀（日本島津公司），ME215S型吉尼斯系列電子分析天平（德國賽多利斯儀器有限公司），HX2002T電子天平（慈溪市天東衡器廠），MH-2000型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美國Sigma公司，批號D9132），2，9-二甲基-1，10-菲啰啉（新亞銅靈，上海笛柏化學品技術有限公司，批號484-11-7），水溶性維生素E（Tro1ox，美國MPBiomedica1s公司，批號M5491），沒食子酸（分析純，上海中泰化學試劑有限公司，批號20130913），CuC12·2H2O（分析純，天津市百世化工有限公司，批號20130224），醋酸銨（分析純，天津市百世化工有限公司，批號20130221），95％乙醇（分析純，寶雞市康利工貿(mào)有限公司，批號20140409）。

沙棘葉、莖和果實采摘自甘肅省定西市渭源縣，經(jīng)中國科學院蘭州化學物理研究所戚歡陽副研究員鑒定為胡頹子科沙棘屬沙棘的葉、莖和果實。

2方法與結果

2.1 樣品儲備溶液的制備 取沙棘葉、莖和果實常溫陰干，粉碎，分別稱取沙棘葉、莖和果實粉末各3份，每份5 g，加入95％乙醇50 mL加熱回流提取3次，每次1.5 h，提取液過濾合并，用95％的乙醇定容至250 mL，搖勻，作為樣品儲備溶液，置于4℃的冰箱中，備用。

2.2 樣品抗氧化活性的DPPH法測定

2.2.1 DPPH溶液及陽性對照沒食子酸溶液的制備 精密稱取DPPH 8.32 mg，95％乙醇溶解，定容至250 mL，搖勻，避光置于4℃的冰箱中，備用；精密稱取沒食子酸11.58 mg，95％乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻，精密量取上述溶液8 mL，95％乙醇定容至25 mL，作為陽性對照溶液，置于4℃的冰箱中，備用。

2.2.2 反應時間的優(yōu)化 分別精密量取沙棘葉、莖及果實儲備溶液6.5、10、8 mL，95％乙醇定容至25 m L，作為沙棘葉、莖及果實樣品溶液，精密量取DPPH溶液4 mL，按表1依次加入樣品溶液和95％乙醇，混合均勻后，于517 nm處每隔3 min測定其吸光度值，結果如圖1所示。

表1　樣品溶液和9 5％乙醇的加入量

圖1　樣品、陽性對照溶液與D P P H混合后不同時間點的吸光度

由圖1可知，樣品、陽性對照溶液與DPPH混合后，吸光度值隨著時間推移變小，前6 min變化明顯，之后變化漸漸緩慢，20 min后基本平穩(wěn)。為了節(jié)約時間及便于比較，選擇20 min為樣品、陽性對照溶液與DPPH的適宜反應時間。

2.2.3 沙棘不同組織部位DPPH清除能力的測定 精密量取DPPH溶液4 mL，分別按表2依次加入樣品和95％乙醇，混合均勻后，常溫避光反應20 min，于517 nm處測定其吸光度值，平行測定3次。DPPH清除率按式（1）計算。

其中，A空白為4 mL DPPH溶液與1 mL 95％乙醇溶液混合后的吸光度值，A樣品為4 mL DPPH溶液依次加入樣品和95％乙醇反應20 min后的吸光度值。按式（1）計算其DPPH清除率，以質(zhì)量濃度和DPPH清除率作圖，其結果見圖2，求得清除50％DPPH所需的質(zhì)量濃度，即半數(shù)抑制濃度IC50值。

由圖2可知，沙棘葉、莖、果實及沒食子酸溶液分別在0～312、0～560、0～1 280及0～7.41 μg/mL之間與DPPH清除率線性相關，相關系數(shù)分別為0.999 5、0.991 1、0.996 2及0.999 0，根據(jù)線性方程計算沙棘葉、莖、果實及沒食子酸的IC50值分別為217.8、350.5、739.2及6.11 μg/mL，其清除DPPH的能力強弱順序為沒食子酸﹥?nèi)~＞莖＞果實。

2.3 樣品抗氧化活性的CUPRAC法測定

表2　樣品溶液和9 5％乙醇的加入量

圖2　不同質(zhì)量濃度樣品、陽性對照溶液的D P P H清除率

2.3.1 檢測試劑及標準品溶液的制備 稱取CuC12·2H2O 42.808 mg于250 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻；稱取醋酸銨19.27 g于250 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻；稱取新亞銅靈164.89 mg于100 mL的棕色量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。將配制好的溶液放置于4℃的冰箱中，備用。

精密稱取Tro1ox 10.05 mg于25 mL的量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。置于4℃的冰箱中，備用。

2.3.2 反應時間的優(yōu)化 分別精密量取沙棘葉、莖及果實儲備溶液5 mL，95％乙醇定容至25 mL，作為沙棘葉、莖及果實樣品溶液。精密量取新亞銅靈溶液1 mL、CuC12溶液1 mL及醋酸銨溶液1 mL，按表3依次加入樣品溶液和95％乙醇，混合均勻后，于450 nm處每隔5 min測定其吸光度值，結果如圖3所示。

表3　樣品溶液和9 5％乙醇的加入量

圖3　樣品、標準品溶液與檢測試劑混合后不同時間點的吸光度

由圖3可知，樣品溶液與檢測試劑混合后，吸光度值隨著時間推移增加，而標準品溶液與檢測試劑混合后，吸光度值隨著時間推移減少。前10 min變化明顯，之后變化漸漸緩慢，30 min后基本平穩(wěn)。為了節(jié)約時間及便于比較，選擇30 min為樣品、標準品溶液與檢測試劑的適宜反應時間。

2.3.3 標準曲線的繪制 精密量取新亞銅靈溶液1 mL、CuC12溶液1 mL及醋酸銨溶液1 mL，分別加入Tro1ox溶液30、45、60、75、90、105 μL，混合均勻，95％乙醇補足4 mL，常溫避光30 min后，于450 nm處測定其吸光度值。以吸光度A為縱坐標，以質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，其標準曲線見圖4。結果表明，Tro1ox溶液在12.06～42.12 μg/mL之間與吸光度具有良好的線性相關，相關系數(shù)為0.9981。

圖4　Tr o l o x標準曲線

2.3.4 沙棘葉不同部位Cu2 +的還原能力的測定 分別精密量沙棘葉、莖及果實樣品溶液50、50、120 μL，按照2.3.3項的測定方法測定其吸光度值，將測量的吸光度值，代入標準曲線求得X，則樣品的Cu2 +的還原能力Tro1ox當量（TEAC值）為X/C樣品（即1 μg/mL的樣品溶液相當?shù)腡ro1ox溶液），其中C樣品表示樣品溶液的質(zhì)量濃度。結果表明，沙棘葉、莖和果實的Cu2 +的還原能力Tro1ox當量（TEAC值）分別為0.146、0.133和0.057 μg/mL。其Cu2 +的還原能力強弱順序為葉＞莖＞果實。

3 討論

雖然當前關于沙棘葉、莖及果實抗氧化活性的報道較多，但是由于缺乏標準的測定方法，其測定標準、單位表述不統(tǒng)一，尚不能對沙棘葉、莖及果實的抗氧化活性進行比較。此外，由于沙棘葉、莖和果實化學成分的復雜性，不能只用一種方法測定其抗氧化活性。用不同的抗氧化指標綜合評價沙棘葉、莖和果實的抗氧化能力，有利于全面比較沙棘葉、莖和果實之間的差異。雖然DPPH法和CUPRAC法不能完全模擬體內(nèi)過程，但是由于DPPH法中檢測試劑DPPH自由基穩(wěn)定易得［10］及CUPRAC法其檢測環(huán)境接近于生理環(huán)境，本文采用DPPH法和CUPRAC法對沙棘葉、莖和果實的抗氧化活性進行檢測。雖然采用DPPH法和CUPRAC法測定沙棘葉、莖和果實的抗氧化活性的結果不同，但通過比較可以發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力的強弱順序為葉＞莖＞果實。本研究結果為科學合理的利用沙棘資源提供了理論基礎。

參考文獻:

［1］ Va1ko M，Eibfritz L D，Monco1J，et al.Free radica1s and antioxidants in norma1Physio1ogica1 functions and human disease ［J］.Int JBiochem Cell Biol，2007，39（1）: 44-84.

［2］ Ames B N，Go1d L S.Endogenousmutagens and the causes of aging and cancer［J］.Mutat Res，1991，250（1-2）: 3-16.

［3］ Mayne S T.Antioxidant nutrients and chronic disease: use of biomarkers of exPosure and oxidative stress status in ePidemio-1ogic research［J］.JNutr，2003，133（3）: 933S-940S.

［4］ 張 穎，張立木，李同德，等.泰山沙棘果對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（6）: 464-466.

［5］ 郭青莖，趙二勞，白建華.沙棘葉提取物抗氧化性能研究［J］.化學與生物工程，2008，25（3）: 58-59.

［6］ 包怡紅，秦 蕾，王 戈，等.沙棘葉多糖的提取工藝及抗氧化研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（1）: 286-290.

［7］ 李芳亮，王 銳，高 楊，等.沙棘葉水溶性多糖分級組分抗氧化活性的研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2011，24（6）: 63-66.

［8］ 張 穎，張立木，李同德，等.泰山沙棘果中總黃酮與槲皮素含量測定及其抗氧化性探討［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2011，31（8）: 644-646.

［9］ 馬寧安，何茂軍，魯平原，等.沙棘果粉體外抗氧化活性的研究［J］.國際沙棘研究與開發(fā)，2014，12（2）: 25-28.

［10］ 焦 揚，李彩霞，高海寧，等.沙棘枝葉與果漿黃酮抗氧化活性比較［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（4）: 655-660.

［11］ 李振海，劉祥忠，付 佳，等.沙棘對輻射損傷大鼠免疫功能及清除自由基酶活性的影響［J］.佳木斯醫(yī)學院學報，1996，19（4）: 32-34.

［12］ 王曉宇，葡萄酒抗氧化活性及其檢測方法的研究［D］.楊凌:西北農(nóng)林大學，2008.

［13］ Pérez-Boni11a M，Sa1ido S，van Beek TA，etal.Iso1ation and identification of radica1scavengers in o1ive tree（Olea euroPaea）wood［J］.JChromatogr A，2009，1112（1-2）: 311-318.

［14］ APark R，Gü?1ü K，?zyürek M，et al.Nova1 tota1antioxidant caPacity index for dietary Po1yPheno1s and Vitamins C and E，using their cuPric ion reducing caPabi1ity in the Presence of NeocuProine: CUPRACmethod［J］.J Agric Food Chem，2004，52（26）: 7970-7981.

*通信作者:劉銘佩（1967—），女，主任藥師，主要從事藥物新劑型、新技術的研究。Te1:（0931）8942571，E-mai1: 1iumingPei67 @163.com

作者簡介:王曉飛（1982—），男，博士，從事天然藥物化學研究。Te1:（0931）8942491，E-mai1: wxf_ 2511@163.com

基金項目:中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（1zujbky-2013-46）；蘭州大學第二醫(yī)院院內(nèi)中醫(yī)藥項目（YJzy2013-14）

收稿日期:2015-04-22

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0437-04