果樹花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定研究進(jìn)展

王廣富，艾軍，秦紅艷，孫丹，范書田，楊義明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

果樹通常具有生長周期長、遺傳背景復(fù)雜及自交親和性差等特點(diǎn)，這使得果樹常規(guī)育種耗時(shí)長、效率低，且獲得純系難度大。通過花藥培養(yǎng)技術(shù)改變小孢子發(fā)育途徑獲得單倍體果樹植株，進(jìn)而對單倍體植株染色體加倍，可獲得純合的果樹雙單倍體植株，顯著提高育種效率。且由于基因的純合性，還可以提高基因作圖和基因定位的準(zhǔn)確性，因此，單倍體植株是果樹優(yōu)質(zhì)育種、遺傳轉(zhuǎn)化以及分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域的珍貴材料。近幾十年來，果樹花藥培養(yǎng)取得了諸多成果，研究日益深入，下面對其成果進(jìn)行綜述與介紹。

1　單倍體植株獲得途徑

單倍體植株是指含有配子染色體數(shù)的植株。1921年，Bergner等人在曼陀羅植株中首次發(fā)現(xiàn)了天然的孢子體單倍體植株[1]，從此單倍體在植物育種和基因研究中的重要作用很快被廣泛認(rèn)知[2]。單倍體植株經(jīng)染色體加倍產(chǎn)生純合的雙單倍體植株，可快速純合優(yōu)良雜交組合的優(yōu)異基因，使植株的基因型和表現(xiàn)型完全一致，尤其在選擇由隱性基因控制的優(yōu)良性狀時(shí)具有明顯優(yōu)勢[3]。

單倍體植株的獲得有自然發(fā)生和人工誘導(dǎo)2種途徑。石慶華等報(bào)道，蘋果、梨、桃、李、杏等許多果樹能自然產(chǎn)生單倍體，但一般突變數(shù)量少，頻率低，難以在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用[4]。相比較而言，通過花藥或小孢子培養(yǎng)、未授粉子房(胚珠)培養(yǎng)、遠(yuǎn)緣雜交等方法進(jìn)行人工誘導(dǎo)，可顯著提高植物單倍體的產(chǎn)生頻率，其中花藥或小孢子離體培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛[1]。

花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體植株的發(fā)生途徑包括器官發(fā)生途徑和直接或間接的胚狀體途徑。器官發(fā)生途徑是指在一定條件下，愈傷組織中的分生細(xì)胞分化形成芽，再逐漸形成根，最后形成完整植株。胚狀體發(fā)生途徑是指愈傷組織細(xì)胞分化形成含胚芽、胚根、胚軸的胚狀體結(jié)構(gòu)，最后長成完整植株。相對器官發(fā)生途徑，胚狀體發(fā)生途徑再生率高、再生速度快、結(jié)構(gòu)完整，為研究植物細(xì)胞的發(fā)育、分化、全能性的表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化等提供了良好的基礎(chǔ)。

圖1單倍體產(chǎn)生途徑示意圖

Fig.1Pathwaysofhaploidproductioninplants

2　果樹花藥培養(yǎng)研究概況

花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體是指在無菌條件下對未成熟的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，改變其生長發(fā)育途徑，誘導(dǎo)產(chǎn)生染色體減半的單倍體植株的培養(yǎng)方式。1953年，TULECK用銀杏花粉第一次在人工培養(yǎng)基上成功地誘導(dǎo)形成單倍體愈傷組織[5]。Guha和Maheshwari(1964)首次經(jīng)胚狀體途徑由毛葉曼陀羅花藥成功地培養(yǎng)出單倍體植株[6]，使花藥培養(yǎng)成為獲得單倍體植株的高效新途徑。花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究發(fā)展迅速，近30年來，已被廣泛應(yīng)用到200多種植物上，尤其在茄科和禾本科植物中成功較多[5]。

經(jīng)果樹學(xué)家們幾十年的不懈努力，我國的果樹花藥組織培養(yǎng)研究取得較大進(jìn)展，目前在世界上主要栽培的果樹樹種，我國都已獲得了單倍體植株或愈傷組織[7]，例如柑橘(Citrus)、蘋果(Malusdomestica)、西洋梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)、甜櫻桃(Prunusavium)、西洋李(Prunusdomestica)、普通杏(Prunusarmeniaca)、葡萄(Vitisvinifera)、獼猴桃(Actinidiadeliciosa)、桑(Morusalba)、番木瓜(Caricapapaya)、番荔枝(Annonasquamosa)、枇杷(Eriobotryajaponica)等。

3　果樹花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株的影響因素

3.1　外植體

3.1.1材料基因型基因型是某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱，又稱遺傳型?；蛐褪怯绊懟ㄋ幣囵B(yǎng)的重要因素之一，不同基因型的植株花藥對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同[8]。武曉紅在棗花藥培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，不同品種在相同條件下花藥的出愈率不同，冬棗花藥出愈率達(dá)到70.26%，阜平大棗僅為7.76%[9]。陳振光在柑橘花藥培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，供試植株的品種對花藥培養(yǎng)的成敗起關(guān)鍵作用[10]。Wang S M等研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的柑橘花藥在同一培養(yǎng)條件下的愈傷組織誘導(dǎo)率不同[11]。

3.1.2小孢子發(fā)育時(shí)期只有處于一定發(fā)育時(shí)期的花粉小孢子才對外界培養(yǎng)條件比較敏感，所以小孢子的發(fā)育時(shí)期是影響誘導(dǎo)花粉胚成功與否的關(guān)鍵因素[12]。植物種類不同，適宜接種時(shí)期也不盡相同。果樹花藥培養(yǎng)最佳時(shí)期大多數(shù)是小孢子核有絲分裂期前后，小孢子處于單核中晚期為宜[5]。處于單核期到雙核早期的小孢子，剛好處于第1次有絲分裂階段，適于誘導(dǎo)其向單倍體方向發(fā)育。

3.1.3母本植株的生長狀況花粉粒的數(shù)量、內(nèi)源激素的水平以及花藥組織的營養(yǎng)狀況都會受母本植株的生長狀況的影響[13，14]，而這些因素都會對單倍體植株的獲得起到重要作用[3]。一般來說，從生長健壯的幼年植株上采集花藥作為接種材料，其花藥培養(yǎng)相對于老齡樹更易獲得成功[15]。陳振光的研究發(fā)現(xiàn)，柑橘花粉對培養(yǎng)環(huán)境的反應(yīng)能力隨供體植株年齡的增加而降低[10]。供體植株的生長環(huán)境不同，花粉的發(fā)育狀態(tài)不同，花藥培養(yǎng)的效率不同。有研究指出，植株生長在長日照和低溫條件下，其花粉的誘導(dǎo)率更高[16]。

3.2　預(yù)處理

有報(bào)道指出，在花藥或花粉接種之前對整個(gè)花序或離體花蕾進(jìn)行預(yù)處理可改變小孢子的發(fā)育途徑，提高培養(yǎng)的成功率[2]?；ㄋ幣囵B(yǎng)的預(yù)處理方式有很多，包括低溫處理、熱激處理、缺素處理、射線處理等，其中常用的預(yù)處理方式有低溫處理和熱激處理[17]。適宜的預(yù)處理溫度和時(shí)間可提高胚產(chǎn)生的效率，誘導(dǎo)胚狀體的產(chǎn)生。低溫預(yù)處理溫度一般在1℃～14℃，處理時(shí)間短則幾個(gè)小時(shí)，長則30d～40d[12]。張春芬等在“紅星”蘋果花藥培養(yǎng)低溫預(yù)處理試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著低溫預(yù)處理時(shí)間的增加，胚狀體誘導(dǎo)率呈增長趨勢[18]。

3.3　培養(yǎng)基

3.3.1基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中包含植物組織培養(yǎng)所需要的大量元素和微量元素，是花藥培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一。較為常用的基本培養(yǎng)基有MS、N6、B5、White、Nitsch等。研究表明，基本培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的成分配比對花藥培養(yǎng)過程中愈傷組織的誘導(dǎo)有決定性的作用[15]。蘋果“元帥”品種花藥培養(yǎng)過程中MS培養(yǎng)基附加不同配比的激素均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織和胚狀體，而N6培養(yǎng)基的各種處理均不能產(chǎn)生胚狀體[19]。劉仁祥等提出，在一定的范圍內(nèi)，大量元素與微量元素的比率對成苗的影響要超過單一元素絕對含量的影響[20]。

3.3.2植物生長調(diào)節(jié)劑植物生長調(diào)節(jié)劑(生長素，細(xì)胞分裂素或二者組合)對花藥培養(yǎng)過程中小孢子的發(fā)育途徑有重要作用。在木本植物花藥培養(yǎng)中，分化培養(yǎng)基需同時(shí)含有生長素和細(xì)胞分裂素才有利于小孢子再分化，而草本植物花藥培養(yǎng)對生長調(diào)節(jié)劑的要求則無固定規(guī)律[21]。植物生長調(diào)節(jié)劑的成分及其含量可影響體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞生長增殖，植物生長調(diào)節(jié)劑適宜的組合及濃度搭配能提高胚狀體的形成率[22，23]。王震星等在金絲小棗花藥培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中附加2，4-D和NAA的濃度和配比不同，其愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著[24]。

3.3.3碳源碳源不僅可以為植物組織培養(yǎng)提供能量，還可調(diào)節(jié)植物離體組織的滲透壓。一定濃度范圍內(nèi)的碳源對抑制體細(xì)胞愈傷組織的生成具有一定作用，從而提高生殖細(xì)胞的愈傷組織生成率，比如在花藥組織培養(yǎng)中，適當(dāng)濃度的碳源可以降低花絲或花藥壁的愈傷組織生成率，從而提高花粉胚的形成效率[25]。在花藥培養(yǎng)中，碳源組分和濃度對花粉小孢子的活力以及胚狀體發(fā)生有重要影響[12]。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，其中，蔗糖最為常用。薛光榮等用不同濃度的蔗糖處理“元帥”蘋果離體花藥，其愈傷組織及胚狀體的誘導(dǎo)率不同[19]。

3.4　培養(yǎng)條件

離體花藥一般是培養(yǎng)在溫度24℃～27℃、每天光照10h～14h、光強(qiáng)2000lux的環(huán)境下，也有一些其他的培養(yǎng)條件。不同基因型的植物適宜的培養(yǎng)條件不同，光照是調(diào)節(jié)離體花藥形態(tài)發(fā)生的環(huán)境信號，光照強(qiáng)度和光周期是花藥培養(yǎng)過程中重要的調(diào)節(jié)因子。花藥在離體培養(yǎng)過程中對溫度比較敏感[26]，前期的冷處理或者是熱處理能顯著影響胚狀體和再生植株的數(shù)量[27]。所以適宜的培養(yǎng)條件能提高花藥離體培養(yǎng)的成功率。

4　再生植株倍性鑒定

在花藥培養(yǎng)過程中，由于體細(xì)胞(花藥壁、藥隔、花絲等)干擾、單倍體自然加倍等情況的存在，再生植株的倍性比較復(fù)雜，所以對再生植株進(jìn)行有效地倍性鑒定具有重要的意義。倍性鑒定方法主要包括：

4.1　形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定是指根據(jù)植株器官形態(tài)、顏色等的差異來進(jìn)行倍性識別[1]。單倍體植株和二倍體、多倍體植株的區(qū)別比較明顯，一般來說，單倍體植株生長緩慢甚至死亡，器官體積小，葉片窄小，葉及果實(shí)的形狀異常[15]。Einset 1945年就已報(bào)道了染色體加倍的蘋果芽變植株莖干粗壯，還出現(xiàn)了“大果”或“巨果”[28]。田義等發(fā)現(xiàn)“寒富”蘋果花藥培養(yǎng)植株與親本植株相比葉片變小、變薄，葉被茸毛也大幅度減少[29]。形態(tài)學(xué)鑒定簡便直觀，但不夠精確，需結(jié)合其他方法判定植株的具體倍性。

4.2　解剖學(xué)鑒定

植物葉片單位面積上的氣孔數(shù)、保衛(wèi)細(xì)胞大小以及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與植株倍性具有一定的相關(guān)性[17]。通常情況下，單倍體與正常植株相比，葉片下表皮的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞變小，葉綠體數(shù)目變少，因此氣孔的變化可用來間接鑒定植株倍性[12]。Blasco等發(fā)現(xiàn)，枇杷植株單位葉面積上的氣孔數(shù)量和氣孔的面積與植株的倍性呈正相關(guān)，在所測二倍體和三倍體、四倍體樣品植株之間差異顯著，可作為鑒定植株倍性的重要依據(jù)[30]。

4.3　染色體計(jì)數(shù)

單倍體細(xì)胞含有正常二倍體細(xì)胞半數(shù)的染色體，選取處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，可準(zhǔn)確地鑒定花藥培養(yǎng)再生植株倍性[31]。在葡萄[32]、蘋果[33]、草莓[34]、柑橘[35]等許多果樹都使用染色體計(jì)數(shù)的方法對花培植株進(jìn)行了倍性鑒定[1]。常用的染色體計(jì)數(shù)法包括根尖或莖尖常規(guī)壓片法及去壁低滲火焰干燥法制片，所選細(xì)胞所處的時(shí)期及染色體的分散程度都會對鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響[15]。

4.4　流式細(xì)胞儀法鑒定

流式分析儀又稱倍性分析儀，可定量地測定某一細(xì)胞以及細(xì)胞群中的DNA含量，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定簡便、快捷，且準(zhǔn)確度高[36]。流式細(xì)胞儀檢測器可捕捉經(jīng)DNA特異性染料染色后的單細(xì)胞懸浮液中的細(xì)胞核所發(fā)射的熒光信號，通過直方圖進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，進(jìn)而推斷出細(xì)胞的倍性[15]。李等利用流式細(xì)胞光度術(shù)測定蘋果細(xì)胞核DNA含量結(jié)果表明，不同倍性品種間細(xì)胞核DNA含量差異顯著，利用流式細(xì)胞儀法可以較為可靠地進(jìn)行蘋果倍性鑒定[37]。流式細(xì)胞儀已被用于柑橘[38]、甜柿[39]、葡萄[40]等果樹的倍性鑒定，且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

4.5　分子水平鑒定

花藥培養(yǎng)中的單倍體植株在生長過程中有自然加倍的現(xiàn)象，用染色體計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀分析法無法鑒定植株的倍性起源[15]。通過RFLP、AFLP、SSRs(又稱微衛(wèi)星分子標(biāo)記)、SCAR分子標(biāo)記、指紋圖譜、基因組原位雜交(GISH)、熒光原位雜交(FISH)等技術(shù)可在分子水平上對再生植株進(jìn)行純合性鑒定[3]。SSRs因其是共顯性標(biāo)記，可以應(yīng)用于雙單倍體的鑒定與篩選上。已被用來進(jìn)行柑橘花藥培養(yǎng)再生植株的特征研究[41]及判定梨[42]和蘋果植株[43]的純合性。

5　果樹花藥培養(yǎng)存在的問題和展望

我國的果樹花藥培養(yǎng)起步于20世紀(jì)70年代，在科學(xué)家們過去幾十年的辛勤努力下，我國果樹花藥培養(yǎng)技術(shù)已取得較大進(jìn)展，但果樹花藥培養(yǎng)技術(shù)依然存在一些問題和阻礙。①基因型依賴，果樹花粉的培養(yǎng)力受多基因調(diào)控，目前果樹的花藥培養(yǎng)技術(shù)依然落后于禾本科植物，許多重要果樹依然沒有通過花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株；②果樹愈傷組織再生困難，單倍體植株的誘導(dǎo)率較低，且部分已報(bào)道成功獲得花藥單倍體植株的果樹，其培養(yǎng)的結(jié)果重演性差；③體細(xì)胞干擾，花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)，花藥壁及花絲等體細(xì)胞會干擾誘導(dǎo)結(jié)果；④單倍體一般植株矮小，生長勢弱，甚至難以存活。今后應(yīng)加強(qiáng)在上述領(lǐng)域的研究，不斷深入果樹花藥培養(yǎng)研究，改進(jìn)培養(yǎng)機(jī)制，完善花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，提高果樹單倍體植株的誘導(dǎo)率和存活率，以便與傳統(tǒng)雜交育種等技術(shù)相結(jié)合，培育出更多優(yōu)良新品種，同時(shí)為果樹分子標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供理想的研究材料，并將促進(jìn)果樹遺傳育種、遺傳轉(zhuǎn)化等研究快速發(fā)展。

[1]Blakeslee AF，Belling J,Farnham ME,et al.A haploid mutant in the Jimson weed,Daturastramonium[J].Science,1922,55:646-647.

[2]Germanà M A.Anther culture for haploid and doubled haploid production[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2011,104(3):283-300.

[3]張圣倉,魏安智,楊途熙.果樹單倍體和加倍單倍體(DH)技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào),2011,28(5):869-874.

[4]石慶華,劉平,劉孟軍.果樹倍性育種研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(9):1639-1654.

[5]張潔,張學(xué)英,葛會波.果樹花藥培養(yǎng)研究概況[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(S):95-97.

[6]Guha S,Maheshwari S C.In vitro production of embryos from anthers ofDatura[J].Nature,1964,204:497.

[7]Germanà M A.Doubled haploid production in fruit crops[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2006,86(2):131-146.

[8]王延玲,豐震,趙蘭勇.植物花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,37(1):149-151.

[9]武曉紅.棗花藥再生植株及單倍體的獲得[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[10]陳振光.誘導(dǎo)柑橘花粉植株的研究[J].園藝學(xué)報(bào),1983,10(2):73-78.

[11]Wang S M,Lan H,Cao H B,et al.Recovery and characterization of homozygous lines from two sweet orange cultivars via anther culture[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2015,123(3):633-644.

[12]雷秀娟.人參花藥、雜種胚培養(yǎng)及基于皂苷含量的特性評價(jià)[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2013.

[13]Heberle-Bors E.In vitro haploid formation from pollen:a critical review[J].Theoretical and applied genetics,1985,71:361-374.

[14]Sunderland N,Dunwell JM.Anther and pollen culture.In:Street HE(ed)Plant tissue and cell culture[M].Oxford:Blackwell,1977:223-265.

[15]吳麗萍.“冬棗”花藥培養(yǎng)體系優(yōu)化和再生植株鑒定研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2013.

[16]許智宏.植物生物技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1998:207-212.

[17]Dwivedi S L,Britt A B,Tripathi L,et al.Haploids:constraints and opportunities in plant breeding[J].Biotechnology advances,2015,33(6):812-829.

[18]張春芬,鄧舒,孟玉平,等.小孢子發(fā)育時(shí)期與低溫預(yù)處理對蘋果花藥培養(yǎng)胚狀體形成的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2013,40(S):258.

[19]薛光榮,費(fèi)開韋.“元帥”蘋果花藥培養(yǎng)形成植株簡報(bào)[J].中國果樹,1981,(1):15.

[20]劉仁祥,張憲銀.活性炭促進(jìn)煙草花藥培養(yǎng)出苗的作用機(jī)制研究[J].種子,2002,2(3):11-14.

[21]李守嶺,莊南生.植物花藥培養(yǎng)及其影響因素研究進(jìn)展[J].亞熱帶植物科學(xué),2006,35(3):76-80.

[22]Fraser L G,Harvey C F.Somatic embryogenesis from anther-derived callus in twoActinidiaspecies[J].Scientia horticulturae,1986,29(4):335-346.

[23]侯喜林.不同品種和激素條件對草莓花藥培養(yǎng)的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1992,15(2):21-28.

[24]王震星,楊恩芹,劉貴仁,等.金絲小棗花藥離體培養(yǎng)再生植株研究[J].河北果樹,1996,(3):9-10.

[25]張冰玉,蘇曉華,周祥明,等.林木花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展及展望[J].植物學(xué)通報(bào),2003,20(6):656-663.

[26]李俊明.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京:北京農(nóng)大出版社,1992:378-388.

[27]Li J,Wang Y,Lin L,et al.Embryogenesis and plant regeneration from anther culture in loquat(EriobotryajaponicaL.)[J].Scientia horticulturae,2008,115(4):329-336.

[28]Einset J.The spootaneous origin of polyploidy apples[J].Proc Amcr Soc Hort Sci,1945,46:91-93.

[29]田義,張彩霞,康國棟,等.寒富蘋果花藥培養(yǎng)植株的獲得及鑒定[J].中國果樹,2015,(5):8.

[30]Blasco M,Badenes M L,del Mar Naval M.Colchicine-induced polyploidy in loquat(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2015,120(2):453-461.

[31]陶抵輝,李小紅,王利群,等.植物染色體倍性鑒定方法研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2009,13(5):453-458.

[32]鮑雪珍,張建琪,于洪浩,等.葡萄胚狀體發(fā)生的初步研究[J].中外葡萄與葡萄酒,1981,(1):5-8.

[33]吳絳云.蘋果花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株[J].園藝學(xué)報(bào),1981,8(4):36-37.

[34]薛光榮,費(fèi)開偉,胡軍.草莓花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體植株[J].園藝學(xué)報(bào),1981,8(1):9-12.

[35]鄧秀新,章文才.柑橘花藥培養(yǎng)研究[J].浙江柑橘,1987,(1):11-12.

[36]朱道圩,楊宵,理莎莎,等.流式細(xì)胞儀在果樹作物倍性鑒定上的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,34(24):6480-6482.

[38]張俊娥,劉繼紅,鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(2):169-174.

[39]陳緒中,羅正榮.鄂柿1號離體葉片秋水仙素誘導(dǎo)和再生植株倍性鑒定[J].果樹學(xué)報(bào),2005,22(5):554-556.

[40]馬愛紅,范培格,孫建設(shè),等.四倍體葡萄誘導(dǎo)技術(shù)的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(8):1645-1651.

[41]Germanà M A,Chiancone B.Improvement of the anther culture protocol inCitrusclementineHort.ex Tan[J].Plant Cell Rep,2003,22(3):181-187.

[42]Boutilier K,Offringa R,Sharma V K,et al.Ectopic expression of BABY BOOM triggers a conversion from vegetative to embryonic growth[J].The Plant Cell,2002,14(8):1737-1749.

[43]H?fer M,Gomez A,Aguiriano E,et al.Analysis of simple sequence repeat markers in homozygous lines of apple[J].Plant Breeding,2002,121(2):159-162.