以特異性引物延伸為基礎(chǔ)的非綜合征唇腭裂易感基因芯片技術(shù)

胥　威　　盧永平　　韓維田▲　　宋方田.遼寧省計劃生育科學(xué)研究院　遼寧省生殖健康重點實驗室，遼寧沈陽　003；.遼河油田總醫(yī)院婦嬰醫(yī)院，遼寧盤錦　400

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以特異性引物延伸為基礎(chǔ)的非綜合征唇腭裂易感基因芯片技術(shù)

胥威1盧永平1韓維田1▲宋方田2
1.遼寧省計劃生育科學(xué)研究院遼寧省生殖健康重點實驗室，遼寧沈陽110031；2.遼河油田總醫(yī)院婦嬰醫(yī)院，遼寧盤錦124010

[摘要]目的設(shè)計一種適合檢測非綜合征唇腭裂（NSCL/P）相關(guān)大量單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因芯片。方法直接測序法驗證基因芯片的準確性，重復(fù)檢測部分樣品驗證基因芯片的重復(fù)性。結(jié)果本研究設(shè)計了一種以特異性引物延伸為基礎(chǔ)的，適合檢測NSCL/P大量相關(guān)SNP的，快速、有效、方便、經(jīng)濟、高通量的基因芯片。結(jié)論這種基因芯片為臨床NSCL/P基因診斷提供一種新型的、靈敏度高、操作簡單的技術(shù)手段。

[關(guān)鍵詞]基因芯片；特異性引物延伸；非綜合征唇腭裂；單核苷酸多態(tài)性

NSCL/P相關(guān)SNP的檢測方法很多，包括限制性內(nèi)切酶酶切法、質(zhì)譜、直接測序、SNPshot等[1]。這些方法僅適合檢測少量SNP，成百上千的SNP檢測就比較困難。而NSCL/P的發(fā)病與大量SNP密切相關(guān)。本研究設(shè)計了一種適合檢測NSCL/P相關(guān)SNP的且快速、方便、有效、經(jīng)濟、高通量的基因芯片。

1　材料與方法

1.1材料來源

選擇2010年7月～2012年7月間經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)師確診的NSCL/P患者50例（男27例，女23例，年齡1～35歲，平均9.96歲），均簽署了知情同意書。

1.2儀器及試劑

點樣儀（Nano-Plotter 2.1，GeSiM），GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀（Axon Instruments）；芯片探針和特異性延伸引物及陽性對照（南京生物科技有限公司）見表1。多重PCR試劑盒（Takara），血液基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN），EXOI及堿性磷酸酶（Takara），VentR（exo-）DNA聚合酶（NEB）。

1.3方法

1.3.1芯片制備24條探針選于www.genome.wi.mit.edu.。30 μM探針溶解在0.3 M碳酸鹽緩沖液。60％相對濕度，點樣儀點樣在醛基修飾玻片上。

1.3.2特異性延伸引物的設(shè)計特異性延伸引物由3’端位于SNP及其上游序列和5’端位于探針互補序列兩部分構(gòu)成。每個SNP設(shè)計兩條特異性延伸引物與之相匹配。

1.3.3DNA提取20 μL蛋白酶K消化200 μL抗凝血，加入200 μL緩沖液GB，70℃10 min；再加入200 μL無水乙醇充分混勻；吸附柱收集絮狀沉淀；再加500 μL緩沖液GD離心，倒掉廢液；600 μL漂洗液PW漂洗；最后50 μL洗脫緩沖液洗脫DNA。

1.3.4多重PCR擴增及純化體系20 μL（10 μL mix2，0.2 μL mix1，0.2μM引物，50 ng DNA）。反應(yīng)條件94℃10 min；94℃30 s，57℃90 s，72℃90 s，35個循環(huán)；最后72℃10 min。多重PCR產(chǎn)物中加入10 μL mix（1.2 U EXOI，0.4 U堿性磷酸酶）純化，條件：37℃30 min，95℃10 min。

1.3.5特異性引物延伸體系15 μL[純化后產(chǎn)物5 μL，dATP、dTTP、dGTP和Cy3dCTP各0.375 μL，VentR（exo-）DNA聚合酶0.02U，特異性引物0.025 μM]。反應(yīng)條件94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，35個循環(huán)；最后72℃3 min。

1.3.6雜交10 μL延伸產(chǎn)物加入10 μL雜交液MIX （1.33×SSC，0.067％SSC，0.033 mg/mL鮭魚精和50 nMCy3標記陽性對照）同芯片雜交，60℃雜交2 h。

1.3.7芯片掃描及檢測分析共聚焦激光掃描儀掃描芯片。基因型通過計算每個SNP的等位基因分數(shù)（AF）讀取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF＜0.4，0.4≤AF≤0.6及AF＞0.6基因型分別為AA，AB及BB。

1.3.8直接測序隨機挑選10％樣本測序，驗證芯片檢測結(jié)果。

表1　SNP位點的探針及特異性延伸引物

2　結(jié)果

2.1芯片設(shè)計

查閱NSCL/P易感基因相關(guān)的文章，挑選研究較多的SNP，進行Meta分析（具體檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫、中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫和PUBMED獲得全部相關(guān)的中英文文獻，匯總?cè)课墨I中的結(jié)果進行分析）。選取與NSCL/P密切相關(guān)的SNP（表1），其相應(yīng)探針陣列見封三圖5A。

2.2芯片檢測結(jié)果

封三圖5B可見SNP檢測結(jié)果：rs11466285TC， rs2235371CT和rs3917201GA，其他SNP均為常見基因型。

2.3準確性與重復(fù)性

芯片檢測50例樣本，檢出率為100％。另外，芯片的檢測結(jié)果與直接測序的結(jié)果完全一致，準確性（兩種方法檢測結(jié)果一致的樣本數(shù)/10％樣本總數(shù)）亦為100％。隨機選取25個樣本，芯片檢測3次，其結(jié)果均一致，重復(fù)率（3次芯片檢測結(jié)果一致樣本數(shù)/25例）為100％。

3　討論

NSCL/P是不伴發(fā)其他系統(tǒng)畸形的、不屬任何綜合征的唇裂、唇裂合并腭裂的總稱，是一種常見的先天性顏面部缺陷[2-5]。世界各地發(fā)病率為1/2500～1/500，不同種族和地域發(fā)病率有很大差異，其中亞洲黃種人最高，歐洲白種人次之，非洲黑種人最低[6，8]。病因研究認為NSCL/P是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的結(jié)果。遺傳學(xué)認為NSCL/P是一種多基因相關(guān)的遺傳病。目前，大量NSCL/P發(fā)病密切相關(guān)候選基因（包括MTHFR、TGFA、TGFB3、RARA、MSX1、IRF6及RFC1等）及其SNP已被確定[9-12]。本研究查閱以往大量文獻，收集相關(guān)數(shù)據(jù)，通過Meta分析，挑選出有意義的且與NSCL/P發(fā)病相關(guān)的SNP作為檢查對象，來設(shè)計基因芯片陣列。

基因芯片是人類基因組計劃帶來的最有應(yīng)用價值的科研成果，融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計算機科學(xué)、統(tǒng)計學(xué)和生命信息學(xué)等多種學(xué)科的最新技術(shù)。寡核苷酸芯片技術(shù)是目前SNP檢測中最有前景的一種方法，在芯片幾平方毫米的面積上可以固定幾百個檢測探針，具有高通量的特點，同時它的點樣、標記、檢測等的自動化過程高，為準確、高效、低廉的SNP檢測奠定了基礎(chǔ)[13-15]。本研究采用的這種寡核苷酸芯片針對NSCL/P相關(guān)7個易感基因的12個SNP位點進行檢測，該方法信息量大、效率高、速度快。本研究采用的以特異性引物延伸為基礎(chǔ)的基因芯片，只需要一種單色熒光系統(tǒng)，而且熒光信號較強，費用較低，同時簡化了數(shù)據(jù)分析。

本研究中，基因芯片檢測50例NSCL/P樣本，檢出率為100％。隨機選取樣本的測序結(jié)果與基因芯片結(jié)果完全一致，說明該芯片檢測結(jié)果準確可靠。因此，該芯片是一種適合NSCL/P相關(guān)SNP檢測的且快速、有效、經(jīng)濟、高通量的方法，為臨床NSCL/P易感基因檢測提供了一個新的技術(shù)平臺。未來我們將在該基因芯片的基礎(chǔ)上添加更多的NSCL/P相關(guān)SNP，以滿足將來臨床基因診斷需要。

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Gene microarray based on allele-specific primer extension for NSCL/P

XU Wei1LU Yongping1HAN Weitian1SONG Fangtian2
1.Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Liaoning Provincial Key Laboratory of Reproductive Health, Shenyang 110031, China; 2.Liaohe Oilfield General Hospital, Panjin 124010, China

[Abstract]Objective To design gene microarray suitable for genotyping extensive SNPs involved in NSCL/P. Methods Direct sequencing was used to ensure the accuracy of gene microarray results. In order to ensure the repeatability of gene microarray results, some samples were tested three times. Results In this study, we designed an efficient, rapid, convenient, highly parallel, and inexpensive gene microarray that is based on allele-specific primer extension and suitable for genotyping SNPs involved in NSCL/P. Conclusion It is a new, sensitive, simple method for NSCL/P gene diagnosis in clinic.

[Key words]Gene microarray; Allele-specific primer extension; NSCL/P; SNP

收稿日期：（2015-10-29）

[基金項目]遼寧省科技攻關(guān)項目（2009225007-7）▲通訊作者

[中圖分類號]R782.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1673-9701（2016）02-0076-03