實時熒光PCR方法快速檢測KI多瘤病毒

修文瓊，鄭奎城，吳冰珊，陳煒，劉光華，康育蘭

(1、福建省疾病預防控制中心，福建福州350001；2、福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建福州350001；3、福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福建省婦幼保健院，福建福州350001)

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實時熒光PCR方法快速檢測KI多瘤病毒

修文瓊1，2，鄭奎城1，2，吳冰珊1，2，陳煒1，2，劉光華3，康育蘭3

(1、福建省疾病預防控制中心，福建福州350001；2、福建省人獸共患病研究重點實驗室，福建福州350001；3、福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院福建省婦幼保健院，福建福州350001)

摘要：目的采用實時熒光PCR方法快速檢測KI多瘤病毒（KIPyV），并與巢式PCR擴增法進行比較。方法收集2007 年11月至2015年1月在福州市一家婦幼保健院因呼吸道感染住在兒科重癥監(jiān)護病房（PICU）的259例小兒鼻咽抽取物標本和另兩家綜合醫(yī)院146例因嚴重急性呼吸道感染（SARI）住院的成年患者咽拭子標本，通過實時熒光PCR方法對KIPyV的調(diào)節(jié)區(qū)的基因片段進行檢測。結果在小兒鼻咽抽取物標本中檢測出3例KIPyV感染陽性病例，檢測陽性率約為1.2%，而用巢式PCR擴增法只檢測出1例，這例的Ct值較低，約為23，并且擴增曲線呈S型。其它兩例的Ct值較高，分別約為33和35。在成年患者咽拭子標本中，用兩種方法都未檢測出KIPyV感染。在兩例Ct值較高的小兒病例中，檢測出混合有呼吸道合胞病毒（RSV）感染。結論確立的實時熒光PCR方法可以快速檢測KIPyV，且特異性較高。

關鍵詞：KI多瘤病毒；實時熒光PCR；呼吸道感染

多瘤病毒（Polyomaviridae）是含有約5000堿基對的小的無包膜雙鏈DNA病毒，可感染多種鳥類和哺乳動物，易造成機體潛伏感染，具備致癌潛能[1]。2007年之前，人類只認識兩種可感染人并引發(fā)疾病的多瘤病毒，分別是1971年發(fā)現(xiàn)的JCV[2]和BKV[3]。2007年，科學家在人呼吸道和糞便中又發(fā)現(xiàn)了兩種新的人類多瘤病毒，分別是KI多瘤病毒（KIPyV，Karolinska Institutet Polyomavirus)[4]和WU多瘤病毒(WUPyV，Washington University Polyomavirus)[5]。2008年至今，陸續(xù)又發(fā)現(xiàn)了6種感染人的多瘤病毒。2008年在人類皮膚發(fā)現(xiàn)了Merkel細胞多瘤病毒（MCPyV）[6]；2010年在人皮膚上發(fā)現(xiàn)了HPyV6、HPyV7[7]及生毛細胞發(fā)育異常刺狀多瘤病毒（TSPyV）[8]；2012年在人血清和皮膚中發(fā)現(xiàn)了HPyV9[9]，在糞便和皮膚中發(fā)現(xiàn)了MWPyV[10，11]。血清學研究表明HPyVs亞臨床感染9%~82%的常人[12]，當人體免疫系統(tǒng)減弱時才產(chǎn)生疾病。這些新發(fā)現(xiàn)的HPyVs引發(fā)了人們探討多瘤病毒與人類疾病和癌癥關系的興趣。原癌轉化是由多瘤病毒早期基因編碼的蛋白T（tumor，腫瘤）抗原介導的。目前，人們對有關這些多瘤病毒的感染途徑、傳播和細胞向性知之甚少，對它們在人類癌癥中所扮演的角色也有爭議。對于KIPyV病毒，我們[13]曾經(jīng)用經(jīng)典的巢式PCR方法對200多份重癥呼吸道感染患兒的鼻咽抽取物標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)了一株該病毒并進行了全基因組序列測定，這是目前國內(nèi)唯一一株獲得全基因組序列的KIPyV毒株，命名為FZ52，其GenBank序列號為KM085447。由于我們用常規(guī)的巢式PCR方法的檢出率比較低，只有0.4%，而已知在成年人呼吸道標本中KIPyV感染的檢出率約為0.2%~2.7%[14]，用實時PCR（realtime PCR，rtPCR）分析技術進行檢測的檢出率約為2.6%~3.0%[15-17]，故需要探索更敏感、快速、特異的方法以便進一步調(diào)查KIPyV在人體里是否引起持續(xù)的感染，進而闡明其流行病學，致病性及原癌發(fā)生的潛力等。

rtPCR分析技術[17]具有提高的敏感性、特異性，不僅快速而且降低了污染風險，同時還可量化病原。在這項研究中，我們在國內(nèi)率先確立了應用rtPCR技術檢測KIPyV的感染。我們從2007年開始采集福州市一家婦幼保健院因呼吸道感染住在兒科重癥監(jiān)護病房（PICU）的259例小兒鼻咽抽取物（NPA，nasopharyngeal aspirates）標本以及146例因重癥急性呼吸道感染（SARI）住在綜合醫(yī)院的成年人患者咽拭子標本，用rtPCR方法對KIPyV的調(diào)節(jié)區(qū)的基因片段進行檢測，同時也用rtPCR方法檢測6種流感病毒，用PCR方法檢測其它呼吸道病毒，以了解KIPyV和其它幾種常見呼吸道病毒和新病毒在本地區(qū)人群中的混合感染狀況。

1　材料與方法

1.1標本來源采集2007年11月-2015年1月在福建省婦幼保健院PICU的259例因下呼吸道感染住院患兒（臨床診斷為支氣管炎、肺炎或毛細支氣管炎）的NPA標本以及福建省兩家綜合醫(yī)院146例成年SARI患者的咽拭子標本。

1.2儀器與試劑rtPCR反應由ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA）熒光定量儀完成，在FAM通道進行信號收集；PCR反應由ABI 2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems，USA）熱循環(huán)儀完成。熒光試劑采用德國QIAGEN公司的QuantiFast Probe PCR Kit試劑盒。引物和探針由TaKaRa（大連）有限公司合成。PCR試劑盒購自TaKaRa（大連）有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1標本處理將采集的NPA標本或咽拭子標本加入3ml左右DMEM采樣液中，反復吹打在4℃條件下送達的標本，加入雙抗，分裝數(shù)管，置-70℃保存。

1.3.2病毒DNA的提取提取前將標本凍融兩次后，10000g離心15min，吸取上清。采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral DNA Mini Kit，按其手冊所提供的方法提取病毒DNA。

1.3.3實時熒光PCR檢測方法的建立所采用的檢測引物是位于調(diào)節(jié)區(qū)域的保守片段，KIPyV的正向引物序列為5'-ACCTGATACCGGCGGAACT-3'，反向引物序列為5'-CGCAGGAAGCTGGCTCAC-3'；TaqMan探針序列是5'-[FAM]-CCACACAAT AGCTTTCACTCTTGGCGTGA-[TAMRA]-3'[17]。rt-PCR的25μl反應體系含有10pmol的每個引物，4pmol相應的探針，2μl的標本DNA。國外文獻的擴增反應參數(shù)如下：95℃，15min，隨后95℃，15s，60℃，1min，共進行55個循環(huán)；我們實驗最快的擴增反應參數(shù)如下：95℃，3min，隨后95℃，3s，60℃，30s，共進行40個循環(huán)。

1.3.4常規(guī)PCR檢測比較常規(guī)檢測KIPyV病毒的引物序列位于VP1基因片段，用巢式擴增法[4]。第一輪的PCR引物是POLVP1-39F和POLVP1-363R。第二輪的PCR引物是POLVP1-118F和POLVP1-324R，第二輪PCR后的擴增產(chǎn)物為VP1基因的一段，長207bp。

1.3.5混合感染檢測對KIPyV檢測陽性標本也用rtPCR法對甲、乙型流感病毒進行檢測；用PCR法對其它幾種呼吸道病毒和新病毒進行檢測。

2　結果

2.1實時熒光PCR和常規(guī)PCR檢測KIPyV病毒比較總共用rtPCR方法檢測了PICU的259例NPA標本和因SARI住院的146例成人咽拭子標本。根據(jù)國外文獻的擴增反應參數(shù)，在小兒NPA標本中檢測出3例KIPyV感染陽性病例，檢測陽性率約為1.2%，而用巢式PCR擴增法只檢測出1例，這例用rtPCR法檢測的Ct值較低，約為23，且擴增曲線呈S型（圖1）。另外2例只能用rtPCR方法在較長和較多的循環(huán)條件下檢測出，它們的Ct值較高，分別約為33和35（圖1）。在成年患者咽拭子標本中，用兩種方法都未檢測出KIPyV感染陽性病例。根據(jù)國外文獻的循環(huán)反應參數(shù)，所有循環(huán)反應需要90min多完成，而我們確立的實時熒光PCR方法可以更快速檢測KIPyV，所有循環(huán)反應只要30min多一點就可以完成（表1），但未能檢測到只能用較長循環(huán)參數(shù)檢測到的Ct值較高的2例。而常規(guī)巢式PCR則要耗時6h以上。

2.2其它病毒感染情況對這3例用rtPCR檢測出的陽性標本也進行了兩種常見呼吸道病毒-流感病毒（包括H1、新H1、H3、H7和B型兩種）和呼吸道合胞病毒(RSV)及其它幾種呼吸道新病毒：如人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(hMPV)和WU多瘤病毒(WUPyV)的檢測，發(fā)現(xiàn)兩例Ct值較高的病

圖1 3例KIPyV感染陽性病例的實時熒光PCR擴增曲線例混合感染RSV。

3　討論

在世界各地的成人呼吸道標本中都有檢出KIPyV病毒的感染，但各地報道的檢出率不盡相同，這跟檢測方法的不同也有一定的關系。在中國，北京[18]的檢出率約為0.5%、蘭州[19]的檢出率約為2.7%、浙江溫嶺[20]的檢出率約為0.04%、在福州用巢式PCR方法[13]的檢出率約為0.4%，本文用實時熒光PCR方法的檢出率約為1.2%，可見不同檢測方法對檢出率有較大影響。由于KIPyV的臨床意義還不是很清楚，因此需要探索更敏感、特異的檢測方法以進行進一步研究。這是國內(nèi)首次報道用rtPCR方法檢測KIPyV病毒。國外有研究表明[17]，若用rtPCR方法檢測KIPyV，Ct值為33或以上的，則原始標本中的DNA含量低到在常規(guī)PCR分析中檢測不出來，這在我們的結果中得到了印證。rtPCR檢測的下限是每個反應不低于10拷貝的病毒量，相應的NPA的濃度是2×103copies/mL[14]。而常規(guī)PCR檢測的下限是原始標本中病毒含量不低于100拷貝。應用rtPCR檢測，除檢測的敏感性較高外，還可定量KIPyV病毒。中等的允許擴增的NPA的濃度是1.8×104copies/mL，最大的允許擴增的NPA的濃度是4.1×105copies/mL[14]。

表1　3種檢測方法比較

根據(jù)文獻，與常規(guī)PCR分析相比，rtPCR敏感性是100%，但特異性是94.6%[17]，這是因為有假陽性的情況。用我們的只要半個多小時的循環(huán)反應條件，檢測不出用國外文獻多1h檢測出的Ct值頗高的兩例。是否我們的反應條件更加快速、靈敏而且特異性強，有待進一步分析、比較和研究。由于rtPCR檢測出的這些增加的陽性結果有可能反映出了常規(guī)PCR的假陰性的結果。常規(guī)PCR假陰性的產(chǎn)生可能一是由于其敏感性較低，二是由于目標寡核苷酸序列的改變。結果表明實時熒光PCR提供了敏感快速的檢測KIPyV的方法。用這個方法可以對這個病毒的流行性和致病性進行更加深入的研究。

根據(jù)文獻，KIPyV與其它病毒經(jīng)常以混合感染的形式存在。在澳大利亞[21]的混合感染率約是25%。在泰國混合感染率約是33.3%[22]，因此KIPyV作為獨立病原的臨床意義還有待進一步研究，它的致病性及與腫瘤的相關性、在自然界的分布及感染途徑等都有待進一步研究和闡明。

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Rapid identification of KI polyomaviruses in clinical samples by real-time PCR

XIUWenqiong1，2，ZHENG Kuicheng1，2，WU Bingshan1，2，CHEN Wei1，2，LIU Guanghua3，KANG Yulan3.1.Fujian Center for Disease Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 350001，China；2.Fujian Key Laboratory of Zoonoses，F(xiàn)uzhou 350001，China；3.Fujian Provincial Maternity and Children Health Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China.

Abstract：Objective To develop sensitive and specific assays for the detection of KIpolyomavirus(KIPyV).Methods In our study，real-time polymerase chain reaction(rtPCR)assayswere developed and compared with nested PCR for detecting KIPyV.Nasopharyngeal aspirates(NPA)were collected from children with respiratory tract disease from Nov.2007 to Jan.2015.Throat swabs were collected from SARI(serious acute respiratory infection)patients from 2013 to 2015.A total of 259 NPA samples and 146 throat swabs were tested for KIPyV using two PCR methods.Results KIPyV infection was detected in 3 NPA samples by rtPCR assay.The positive rate was 1.2%.The Ct value ofwhich was detected by nested PCR was about23 by rtPCR assay.The Ct values of the other 2 sampleswere about 33 and 35，and both of them were not detected by nested PCR.Conclusion RT-PCR is a sensitive and fast detection assay for KIPyV in clinical specimens and useful for further research of this virus.

Key words：KIPyV；rtPCR；Respiration tract infections

(收稿日期2015-07-28；修回日期2016-01-06)

作者簡介：修文瓊，女，1969年9月生，主任技師，碩士，從事分子病毒學研究。曾作為川醫(yī)學獎學金制度研究員和特別研究員兩度到日本進修各1年。E-mail:wqshiu@live.cn

基金項目：福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題(2011-CX-20)

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.004

中圖分類號：R446.62，R373.1

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0011-04