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      胰島素抵抗肝癌細胞IGF-1R/NF-κB表達及多藥耐藥機制研究*

      2016-03-24 01:47:29王以浪印滇楊莉張亮姚登福
      實用肝臟病雜志 2016年6期
      關鍵詞:阿霉素葡萄糖肝癌

      王以浪,印滇,楊莉,張亮,姚登福

      ·原發(fā)性肝癌·

      胰島素抵抗肝癌細胞IGF-1R/NF-κB表達及多藥耐藥機制研究*

      王以浪,印滇,楊莉,張亮,姚登福

      目的探討胰島素抵抗(IR)肝癌細胞胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)和核因子-κB(NF-κB)表達變化及多藥耐藥(MDR)發(fā)生機制。方法采用高濃度胰島素誘導人肝癌細胞(HepG2和HepG2.2.15)建立胰島素抵抗(IR)細胞模型。采用Western blot法檢測胰島素受體(InsR)、IGF-1R、NF-κB和P-糖蛋白(P-gp)表達變化。使用流式細胞儀(Annexin V-FITC法)檢測阿霉素對細胞凋亡的影響。結果分別用100 nmol/L和1 000 nmol/L胰島素培養(yǎng)HepG2和HepG2.2.15細胞48 h,成功建立IR肝癌細胞模型;IR肝癌細胞IGF-1R、NF-κB、P-gp表達上調(diào),而InsR表達下調(diào);應用25μg/mL阿霉素作用細胞24 h后,IR-HepG2細胞組凋亡率(31.1%±1.9%)顯著低于HepG2細胞組【(49.7%±2.2%),P<0.01】,IR-HepG2.2.15細胞凋亡率【(20.1±1.7)%】顯著低于HepG2.2.15細胞【(33.8±1.8)%,P<0.01】;HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15細胞凋亡率分別較HepG2和IR-HepG2細胞顯著降低(P<0.01)。結論IGF-1R/NF-κB/P-gp過表達可能介導IR肝癌細胞對阿霉素的多藥耐藥。

      HepG2細胞;胰島素抵抗;胰島素樣生長因子1受體;核因子-κB;P糖蛋白;多藥耐藥

      肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。我國HBV相關性HCC約占80%,而代謝異常也是重要的致病因素[1-2]。近來研究顯示,2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM)患者HCC發(fā)病率明顯增高[3-4]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指各種原因使胰島素靶器官(肝、脂肪、骨骼肌等)對胰島素的敏感性降低,導致β細胞代償性分泌過多胰島素,出現(xiàn)高胰島素血癥。IR是T2DM發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[5]。胰島素與胰島素受體(insulin receptor,Ins R)和胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)結合,介導下游信號通路傳遞,并與HCC發(fā)生關系密切[6]。P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表達上調(diào)與腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)表型形成密切相關[7]。我們前期研究提示核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)可誘導肝癌細胞P-gp過表達及MDR形成,而抑制NF-κB表達可以逆轉MDR[8-10]。有研究顯示,胰島素可誘導多種細胞P-gp表達上調(diào),介導MDR[11-12],但胰島素能否誘導人肝癌細胞多藥耐藥以及其作用機制尚不清楚。本研究采用高濃度胰島素加入細胞培養(yǎng)液,誘導人肝癌細胞(HepG2和HepG2.2.15)培養(yǎng),建立肝癌細胞IR模型,觀察了細胞Ins R、IGF-1R、NF-κB和P-gp等表達的變化,以探討IR肝癌細胞對阿霉素多藥耐藥的機制。

      1 材料與方法

      1.1 細胞與試劑人肝癌細胞HepG2和整合HBV DNA的HepG2.2.15細胞株購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。胰島素、瓊脂糖、溴化乙錠、二乙基焦炭酸、無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基(Sigma公司);新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);鼠抗人InsR-β抗體(ab983)、兔抗人InsR-β磷酸化(Y1361)抗體(ab60946)、兔抗人IGF-1R抗體(ab39675)、抗IGF-1R磷酸化(Y1161)抗體(ab39398)、兔抗人p65磷酸化(S536)抗體(ab86299)、兔抗人P-gp抗體(ab10347,美國Abcam公司);兔抗人核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)抗體(SAB4501995,Sigma公司),羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(美國Jackson公司)。

      1.2 IR肝癌細胞模型建立取HepG2和HepG2. 2.15細胞,復蘇后用含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞貼壁長滿后,傾去培養(yǎng)基,用0.25%胰蛋白酶消化。根據(jù)細胞生長情況傳代。取對數(shù)生長期細胞接種于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,待細胞完全貼壁,分別加入1、10、100、1 000和10 000 nmol/L的胰島素,孵育24 h、48 h和60 h,用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)上清液葡萄糖含量。計算空白組與不同胰島素濃度組細胞葡萄糖消耗量差值,選擇葡萄糖消耗量差值最小,即達到胰島素抵抗最高狀態(tài)的胰島素作用濃度為胰島素最佳濃度。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定各組細胞活性。

      1.3 細胞蛋白表達檢測分別將各組細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,經(jīng)PBS洗滌,胰酶消化,1000 r/m離心5 min,收集細胞,棄上清液,冰上操作:按照1×106個細胞加細胞裂解液100 μl和PMSF 1μl裂解細胞,冰上靜置10 min,4℃,12000 r/m離心15 min,收集上清液,以BCA法測定蛋白濃度。采用Western blot法檢測蛋白表達,取蛋白樣品20μg,加至0.5 mL EP管內(nèi),加上樣緩沖液按比例稀釋蛋白,混勻后于沸水中煮5 min,使蛋白變性。制作10%分離膠和4%濃縮膠。向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液,每道上樣蛋白樣品20μg,先80 V×35 min,然后改為100 V×60 min。在電泳結束后,以恒流300 mA×110 min轉膜。轉膜結束后,以TBS-T洗滌緩沖液脫色搖床上漂洗5 min,2次,TBS洗5 min。將膜轉移至封閉液,室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。取出膜,用TBS-T漂洗10 min,2次,TBS洗滌10 min。然后,加入一抗,4℃過夜,TBS-T漂洗5 min,2次,TBS洗5 min,加入二抗,室溫孵育2 h,漂洗、DAB顯色并攝像。

      1.4 細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC法,取25μg/mL阿霉素加入各組肝癌細胞培養(yǎng)液中,共培養(yǎng)24 h。分別收集各組細胞,離心,吸凈上清,PBS洗滌細胞2次。加入Annexin V-FITC結合液195μl,輕輕重懸細胞,再加入Annexin V-FITC 5 μl,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min。離心,棄上清,加入Annexin V-FITC結合液190μl,輕輕重懸細胞。加入PI染色液10μl,輕輕混勻,冰浴、避光放置。使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,每組檢測3次,取平均值。

      2 結果

      2.1 胰島素對肝癌細胞存活率的影響應用不同濃度的胰島素作用HepG2和HepG2.2.15細胞不同時間后,各濃度組胰島素均有抑制肝癌細胞增殖的作用。與1 000 nmol/L胰島素組比,10 000 nmol/L胰島素作用HepG2(t=5.57,P<0.01)和HepG2.2.15細胞(t=7.25,P<0.01)24 h,對細胞活性抑制明顯增強,差別有統(tǒng)計學意義(圖1)。

      圖1 胰島素對肝癌細胞存活率的影響A:與1 000nmol/L胰島素作用HepG2細胞24 h組比,#P=0.02;B:與1 000nmol/L胰島素作用HepG2.2.15細胞24 h組比,#P=0.01

      2.2 IR肝癌細胞模型建立成功100 nmol/L胰島素作用HepG2細胞24 h、48 h和72 h,培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度分別為(9.8±0.12)mmol/L、(9.5± 0.25)mmol/L和(8.9±0.21)mmol/L,作用48 h細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度與作用24 h比無顯著性差異(t=1.87,P=0.13),作用72 h培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度較作用48 h無明顯下降(t=3.18,P=0.03,圖2A);1 000 nmol/L濃度胰島素作用HepG2.2.15細胞24 h、48 h和72 h,培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度分別為(9.6±0.17)mmol/L、(9.2±0.20)mmol/L和(8.8± 0.18)mmol/L,作用48 h細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度與作用24 h比無顯著性差異(t=2.64,P=0.06),作用72 h培養(yǎng)上清液葡萄糖濃度較作用48 h無明顯下降(t=2.57,P=0.06,圖2B);100 nmol/L和1 000nmol/L胰島素分別作用HepG2細胞和HepG2.2.15細胞48 h,細胞培養(yǎng)上清液葡萄糖消耗量較作用24 h無顯著降低,形成胰島素抵抗,并能維持72 h。

      圖2 不同濃度胰島素誘導肝癌細胞葡萄糖消耗變化(A、B)與0 h組比,#P>0.05;與24 h組比,△P<0.05;與48 h組比,*P<0.05

      2.3 IR肝癌細胞IsnR-β和IGF-1R表達變化與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞比,胰島素誘導后形成的IR-HepG2細胞和IR-HepG2.2.15細胞IsnR-β和P-IsnR-β表達下調(diào),而IGF-1R和P-IGF-1R表達上調(diào)(圖3)。

      圖3 IR肝癌細胞蛋白表達變化IR肝癌細胞IsnR-β蛋白表達對照組肝癌細胞下調(diào),而IGF-1R表達上調(diào)

      2.4 IR肝癌細胞P-p65、IκBα和P-gp表達變化與HepG2細胞和HepG2.2.15細胞比,IR-HepG2細胞和IR-HepG2.2.15細胞P-p65和P-gp表達上調(diào),而IκBα表達下調(diào);整合HBV DNA的HepG2.

      2.15 和IR-HepG2.2.15細胞P-gp表達較HepG2和IR-HepG2增強(圖4)。

      圖4 IR肝癌細胞P-p65和P-gp表達的變化IR肝癌細胞P-p65和P-gp表達較對照組肝癌細胞上調(diào),而IκBα表達下調(diào)

      2.5 IR肝癌細胞耐受阿霉素誘導凋亡在25μg/ mL阿霉素作用細胞24 h后,IR-HepG2細胞凋亡率為(31.1±1.9)%,顯著低于HepG2細胞的【(49.7± 2.2)%,P<0.01】;IR-HepG2.2.15細胞凋亡率為(20.1± 1.7)%,顯著低于HepG2.2.15細胞組的【(33.8± 1.8)%,P<0.01】;HepG2.2.15和IR-HepG2.2.15細胞凋亡率分別較HepG2和IR-HepG2細胞顯著降低(P<0.01,圖5)。

      圖5 肝癌細胞凋亡率的變化(A、B)經(jīng)阿霉素誘導后,IR肝癌細胞凋亡率顯著低于對照組肝癌細胞

      3 討論

      IR是T2DM發(fā)病的主要始動因素,也是代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)和基本致病基礎。T2DM與HCC發(fā)生、發(fā)展、治療和預后密切相關[13]。IR和高胰島素血癥介導了T2DM和代謝綜合征與惡性腫瘤發(fā)病之間的橋梁關系。有研究表明T2DM與許多實體惡性腫瘤密切相關,尤其是HCC[14,15]。意大利學者的一項研究表明有31.2%HCC患者患有T2DM,而正常人群T2DM患病率僅為12.7%。一項薈萃分析顯示患有T2DM患者患HCC的風險是正常人的2.31倍,其中使用外源性胰島素治療的糖尿病患者患HCC風險是不使用胰島素患者的4倍,而死亡風險增加1.43倍,提示胰島素不僅參與HCC的形成,而且通過增加化療藥物的多藥耐藥而影響HCC患者的治療效果。由此可見,T2DM是HCC的獨立危險因素,其中高胰島素血癥可能起了重要作用[16,17]。

      胰島素、IsnR、IGF-1R和下游靶基因構成胰島素信號軸,介導機體病理生理過程[18]。其中IGF-1R與惡性腫瘤密切相關,其在HCC表達上調(diào),阻斷IGF-1R使肝癌細胞生長受抑、誘導細胞凋亡,增加放、化療敏感性[19,20]。本研究用高濃度胰島素誘導肝癌細胞,在胰島素作用肝癌細胞后24 h即能誘導肝癌細胞形成IR,并能維持72 h。經(jīng)Western blot檢測顯示IsnR和磷酸化IsnR表達下調(diào),抑制細胞對葡萄糖消耗,符合胰島素抵抗特征。但作為胰島素的另一受體IGF-1R和磷酸化IGF-1R表達卻明顯上調(diào),推測其可能介導了胰島素誘導的細胞分裂、增殖和凋亡抑制等。

      MDR基因編碼的細胞膜P-gp是一種ATP依賴的流出泵,一旦與抗腫瘤藥物結合,通過ATP提供能量就可將藥物從細胞內(nèi)泵出細胞外,出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。惡性腫瘤細胞往往高表達P-gp[21]。有研究顯示胰島素可誘導P-gp表達,其具體機制尚不明確[22,23]。NF-κB是首先在B細胞中發(fā)現(xiàn)的一種結合于免疫球蛋白κ輕鏈增強子上的核蛋白,有RelA(p65)、RelB、C-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)五個亞基,亞基間可形成同源或異源二聚體,其中p50/p65二聚體最常見。NF-κB是胰島素信號通路下游重要靶點,我們前期研究顯示抑制NF-κB后HepG2細胞P-gp表達顯著下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)IR肝癌細胞NF-κB亞單位磷酸化的p-65(P-p65)和多P-gp表達較肝癌細胞顯著增強;采用流式細胞儀檢測經(jīng)阿霉素誘導的細胞凋亡顯示阿霉素誘導的IR肝癌細胞凋亡率較肝癌細胞明顯減低。上述結果提示NF-κB可能介導了胰島素誘導的肝癌細胞P-gp表達及對阿霉素的多藥耐藥。

      HBV相關性肝癌高耐藥性是HCC化療不敏感的主要原因。本研究提示整合HBV DNA的HepG2.2.15細胞P-gp蛋白表達較HepG2細胞增高,對阿霉素有更高的耐藥性,但其具體機制尚不清楚。

      本研究以高濃度胰島素誘導肝癌細胞形成IR肝癌細胞模型,研究提示NF-κB介導了胰島素/IGF-1R誘導肝癌細胞P-gp表達及對阿霉素的多藥耐藥,推測HBV可能與肝癌細胞多藥耐藥相關,這些結果可能為肝癌的耐藥逆轉提供了潛在的靶點。

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      (收稿:2016-06-20)

      (本文編輯:陳從新)

      Exp ression of IGF-1R/NF-kappa B and multi-d rug resistance in insulin resistance-HepG2 and HepG2. 2.15 cells in vitro


      Wang Yilang,Yin Dian,Yang Li,et al.
      Department of Oncology,Research Center of Clinical Medicine,F(xiàn)irst People's Hospital A ffiliated to Nantong University,Nantong,226001,Jiangsu Province,China Corresponding author:Yao Dengfu,E-mail:yaodf@ahnmc.com

      Ob jective To investigate the expression of insulin-like growth factor 1 receptor(IGF-1R),nuclear factor-κB(NF-κB)and the mechanism of multi-drug resistance(MDR)in insulin resistance(IR)-hepatoma cells in vitro.Methods The human hepatoma cells(HepG2 and HepG2.2.15)were induced by high concentration of insulin to establish a insulin resistance model.The expression of insulin receptor(InsR),IGF-1R,NF kappa B,P glycoprotein(P-gp)were detected by Western bloting and the effect of adriamycin on cell apoptosis were detected by flow cytometry(annexin V-FITC).Resu lts IR model of hepatoma cells were established successfully by subjecting the HepG2 and HepG2.2.15 cells to 100 nmol/L and 1 000 n mol/L insulin respectively for 48 hours.The expression of IGF-1R,NF-kappa B and P-gp were up-regulated in IR hepatoma cells,while the InsR expression was down-regulated;After treatment of the two cells with 25μg/m l doxorubicin for 24 hours,the apoptosis rate of IR-HpeG 2 cells(31.1%±1.9%)was significantly lower than HepG2 cells[(49.7± 2.2)%,P<0.01],and the apoptosis rate of IR-HepG2.2.15 cells(20.1±1.7)%was significantly lower than HepG2.2.15 cells[(33.8±1.8)%,P<0.01];The apoptotic rates of HepG2.2.15 or IR-HepG2.2.15 cells were significantly lower than HepG2 or IR-HepG2 cells(P<0.01),respectively.Conclusion The expression of IGF-1R,NF-kappa B and P-gp are up-regulated in IR-hepatoma cells,which might induce the MDR to adriamycin.

      HepG2 cells;Insulin resistance;Insulin-like growth factor I receptor;NF-kappa B;P-glycoprotein;Multi-drug resistance

      10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.016

      南通市衛(wèi)生局青年醫(yī)學人才科研基金項目(編號:WQ2014005)

      226001江蘇省南通市第一人民醫(yī)院腫瘤科(王以浪,印滇,楊莉,張亮);南通大學附屬醫(yī)院臨床研究中心(姚登福)

      王以浪,男,34歲,醫(yī)學碩士,主治醫(yī)師。從事腫瘤學基礎及臨床研究。E-mail:oncowang@163.com

      姚登福,E-mail:yaodf@ahnmc.com

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