β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用

蔣夢萍　禤婕瀅　徐春　羅千江　尉秀清

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

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β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用

蔣夢萍禤婕瀅徐春羅千江尉秀清

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

【摘要】目的探討β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用機制。方法建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷模型，將β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩β-arrestin2野生型(WT)小鼠20只分別隨機分成實驗組及對照組(n=10)，實驗組腹腔內(nèi)注射脂多糖(5 mg/kg)，而對照組注射等量生理鹽水，6 h后留小鼠血清和肝臟組織標(biāo)本。實時定量PCR檢測小鼠體內(nèi) β-arrestin2表達量，ELISA檢測各組小鼠血清中ALT、AST及TNF-α水平，蛋白免疫印跡法檢測各組β-arrestin2、p-p65及p-IкBα蛋白的表達。結(jié)果β-arrestin2 WT 實驗組肝臟組織中 β-arrestin2 mRNA為0.18±0.06，明顯低于正常對照組的1.00±0.29(t=-4.669，P<0.001)，β-arrestin2蛋白表達也明顯低于WT對照組；β-arrestin2 KO實驗組血清ALT為(204.33±22.33) U/L、AST為(403.40±53.45) U/L，明顯高于β-arrestin2 WT實驗組ALT的(129.33±9.69)U/L和AST(256.20±40.47) U/L(t=7.55、6.94，P均<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L，明顯高于WT實驗組的(101.36±10.65)pg/L(t=9.25，P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65的蛋白表達量明顯高于β-arrestin2 WT實驗組。結(jié)論β-arrestin2可能通過抑制NF-κB活化、減少TNT-α釋放從而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用。

【關(guān)鍵詞】內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷；β-arrestin2；TLR4/NF-кB/TNF-α信號通路

內(nèi)毒素本質(zhì)是革蘭陰性細菌細胞壁上的脂多糖，當(dāng)細菌裂解或其黏附在其他細胞上時脂多糖可釋放出來。脂多糖是機體內(nèi)誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要致病成分。肝臟既是清除內(nèi)毒素的場所，也是內(nèi)毒素血癥過程中最易受損的器官之一。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是多種肝病的主要病理基礎(chǔ)[1-2]?，F(xiàn)有的大量研究表明，肝臟枯否細胞內(nèi)激活多種信號通路誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷的關(guān)鍵機制[3]。β-arrestin2是Arrestins家族中成員之一，廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞中，尤其是免疫系統(tǒng)；β-arrestin2可作為負調(diào)控因子介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞[4]。除此之外，β-arrestin2可作為“鷹架”蛋白，參與多種信號通路[5-6]。本研究旨在觀察β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的生物學(xué)作用，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

一、 實驗動物

C57BL/6J背景的β-arrestin2+/-雌雄配對小鼠由美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈，在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心按SPF級培育，該動物實驗獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

二、 實驗試劑和儀器

1.主要實驗試劑及抗體

脂多糖(Sigma，US)，ALT試劑盒(Cusabio，武漢)，AST試劑盒(Cusabio，武漢)，TNF-α ELISA試劑盒(Cusabio，武漢)，蛋白質(zhì)定量試劑盒(Genstar，北京)，組織RNA提取試劑盒(Magen，北京)，qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，上海)，30%丙烯酰胺(BIO-RAD, US)，過硫酸鈉(BIO-RAD，US)，TEMED(BIO-RAD，US)，β-arrestin2抗體(美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈)，p-p65抗體(Cell Signaling Technology，US)，p65(Santa Cruz，US)，p-IкBα(Santa Cruz, US)，IкBα(Santa Cruz, US)，GAPDH(Santa Cruz，US)等。

2.主要儀器

低溫高速冷凍離心機(Eppendorf公司，Germany)，SDS-PAGE電泳槽(BIO-RAD，US)，轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD，US)，PCR儀(Labnet，US)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific，US)等。

三、實驗方法

1.內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷模型建立

選取6～8周齡(22～25 g)的雄性β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩來源的β-arrestin2野生型(WT)雄性小鼠20只，分別將它們隨機分成實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射5 mg/kg脂多糖，對照組小鼠注射等量的生理鹽水。

2.標(biāo)本采集與處理

6 h后，10%水合氯醛麻醉后行開腹手術(shù)，腹腔下靜脈取血，迅速取肝臟組織，將部分肝臟組織放入10%中性福爾馬林中固定制作石蠟標(biāo)本，剩余部分保存于液氮中，待提取蛋白質(zhì)或RNA；血漿在室溫靜置1 h后離心留血清保存于-80℃。

3.ELISA檢測ALT、AST及TNF-α水平

根據(jù)各試劑盒說明書，檢測各組血清中ALT、AST及TNF-α水平。

4.肝臟組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

取適量肝臟組織，按組織RNA提取試劑盒說明書進行提取RNA，并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定RNA濃度及純度，再根據(jù)qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

5.肝臟組織蛋白提取及蛋白質(zhì)電泳

取適量肝臟組織，按蛋白質(zhì)提取裂解液說明書提取組織總蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度。分裝蛋白并進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)、封閉后，用相應(yīng)目的蛋白的抗體孵育，4℃冰箱搖床過夜，其中對總蛋白分別用抗β-arrestin2、p-p65、p65、p-IкBα、IкBα的一抗孵育。次日復(fù)溫30 min后，HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，暗房曝光。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、 β-arrestin2 WT小鼠在腹腔注射脂多糖后實驗組與對照組肝臟組織中β-arrestin2水平比較

腹腔注射脂多糖 6 h后觀察，實驗組小鼠均活動減弱，體毛寒立，蜷曲姿勢，眼睛可見膿性分泌物，解剖時見肝臟腫脹較對照組略大。通過提取肝臟組織RNA，再檢測β-arrestin2的表達量，實驗發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 WT小鼠腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2 mRNA表達量0.18±0.06，對照組1.00±0.29，實驗組比對照組低，此差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.669，P<0.001，圖1A)。進一步提取肝臟組織蛋白，通過蛋白免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠在腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2蛋白水平也明顯下降(圖1B)。

圖1　β-arrestin2 WT小鼠注射脂多糖6 h后肝臟組織中β-arrestin2水平變化

A：β-arrestin2 WT實驗組與對照組肝臟β-arrestin2 mRNA水平比較,*P<0.05；B：蛋白免疫印跡電泳圖β-arrestin2 KO小鼠注射脂多糖后肝臟損傷加重

β-arrestin2 KO實驗組的ALT、AST高于β-arrestin2 WT實驗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.55，P<0.001；t=6.94，P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L，而其β-arrestin2 WT實驗組血清中TNF-α為(101.36±10.65)pg/L，前者分泌更多TNF-α(t=9.25，P<0.001)，見表1。

表1　各組小鼠肝臟損傷情況比較

注：與β-arrestin2 KO對照組比較，aP<0.01；與β-arrestin2 WT實驗組比較，bP<0.01；與β-arrestin2 WT對照組比較，cP<0.01

二、 β-arrestin2 WT組和KO組注射脂多糖6 h后肝臟損傷指標(biāo)比較

比較β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組的肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白的表達量，我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 KO實驗組高于β-arrestin2 WT 實驗組(圖2)。

討論

有關(guān)肝臟損傷的研究仍是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，而其中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是許多其他肝臟疾病的主要病理基礎(chǔ)。大量研究表明，肝臟枯否細胞是肝臟內(nèi)產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)的主要來源，它是機體防御內(nèi)源性、外源性感染的重要效應(yīng)細胞。脂多糖的受體是Toll樣受體4(TLR4)，它在枯否細胞的細胞膜上大量表達，當(dāng)脂多糖與其受體TLR4結(jié)合后可引發(fā)枯否細胞內(nèi)一系列的信號通路激活從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。激活后的枯否細胞可釋放多種炎癥介質(zhì)，間接作用于肝細胞從而引起肝細胞的壞死、凋亡和損傷[8]。其中，TLR4/NF-кB 信號通路激活是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷的重要機制之一，TNF-α一方面誘導(dǎo)中性粒細胞在肝內(nèi)聚集，另一方面又可誘導(dǎo)激活肝內(nèi)凝血系統(tǒng)，進一步加重肝臟損傷。

圖2　β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白表達水平比較

β-arrestin2最早被發(fā)現(xiàn)是作為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的重要負性調(diào)節(jié)因子，可介導(dǎo)細胞膜表面多種受體的脫敏和內(nèi)吞作用。實際上，β-arrestin2是一種多功能“鷹架”蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2可以與IкBα 結(jié)合進一步干擾IкBα的磷酸化、降解和抑制NF-кB活化。另外有研究指出，在脂多糖或IL-1β刺激下，β-arrestins能直接結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)而阻止后者的寡聚化和泛素化。TRAF6和IкBα都是TLR4/NF-кB 信號通路中重要的信號分子；我們以此推測β-arrestin2可以負性調(diào)控TLR4/NF-кB 信號通路。在本實驗中，我們的結(jié)果顯示β-arrestin2 WT小鼠在腹腔內(nèi)注射脂多糖(5 mg/kg)6 h后，肝臟組織β-arrestin 2 mRNA和蛋白表達均明顯下降；接著我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 KO實驗組的炎癥因子表達量高于β-arrestin2 WT實驗組，而且前者的血清ALT、AST和TNF-α含量都高于后者，這說明了β-arrestin2 KO實驗組的肝臟損傷情況比β-arrestin2 WT實驗組的嚴(yán)重。β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用，在肝臟損傷過程，β-arrestin2表達受到抑制，進而內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)更加強烈。同時，我們的結(jié)果分析提示了β-arrestin2起保護作用的機制可能與抑制NF-кB 磷酸化和核內(nèi)移、減少TNF-α釋放有關(guān)。

綜上所述，β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用，其機制可能是抑制了NF-кB活化，減少促炎因子TNF-α釋放，進而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)放大，但具體的分子機制尚需進一步深入研究。

參考文獻

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(本文編輯：楊江瑜)

Effect of β-arrestin2 in endotoxin-induced liver injury

JiangMengping,XuanJieying,XuChun,LuoQianjiang,WeiXiuqing.

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of the function of β-arrestin2 in the endotoxin-induced liver injury. MethodsEndotoxin-induced liver injury mouse models were established. Twenty β-arrestin2 knockout (KO) mice and twenty β-arrestin2 wild-type (WT) littermates were randomly divided into the experimental and control groups(n=10). In the experimental group, liver injury was induced by intraperitoneal injection of 5 mg/kg of lipopolysaccharide, and the control mice were administered with an equivalent quantity of normal saline. Six hours later, serum sampling and liver tissue were collected. The expression of β-arrestin2 in the mouse liver was measured by quantitative real-time PCR. The serum levels of ALT, AST and TNF-α were detected by ELISA. The expression of β-arrestin2, p-p65 and p-IкBα proteins was determined by Western blot. ResultsThe expression level of β-arrestin2 mRNA in the β-arrestin2 WT group was 0.18±0.06, significantly lower than 1.00±0.29 in the control group (t=-4.669, P<0.001). The expression of β-arrestin2 protein was also obviously down-regulated. In the β-arrestin2 KO group, the values of ALT and AST were (204.33±22.33)U/L and (403.40±53.45)U/L, significantly higher compared with (129.33±9.69)U/L and (256.20±40.47) in the β-arrestin2 WT group (t=7.55, P<0.001; t=6.94, P<0.001). The serum level of TNF-α in the β-arrestin2 KO group was (155.89±14.89) pg/L, significantly higher than (101.36±10.65) pg/L in the β-arrestin2 WT group (t=9.25，P<0.001). In the β-arrestin2 KO group, the expression of p-IкBα and p-p65 proteins within the mouse liver was significantly higher compared with that in the β-arrestin2 WT group. Conclusionβ-arrestin2 alleviates endotoxin-induced inflammatory response probably inhibiting the activation of NF-кB and reducing the production of TNF-α, which plays a protective role in endotoxin-induced liver injury.

【Key words】Endotoxin-induced liver injury; β-arrestin2; TLR4/NF-кB/TNF-α signaling pathway

(收稿日期：2015-11-06)

Corresponding author, Wei Xiuqing, E-mail: wei-xiuqing@163.com

通訊作者，尉秀清，E-mail: wei-xiuqing@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81470848)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.005

·基礎(chǔ)研究論著·