周 昱,張 元,周一平,袁明美,馮雪松
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽(yáng)110013)
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高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中的頭孢尼西
周昱,張?jiān)?,周一平,袁明美,馮雪松*
(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧沈陽(yáng)110013)
摘要:建立了牛奶中頭孢尼西的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜( HPLC-MS/MS)快速測(cè)定方法.樣品采用乙腈提取,離心( 10 000 rmp,10 min),上清液加入乙腈飽和的正己烷,振蕩,取乙腈層,進(jìn)行分析.采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱為分析柱,以5 mmol/L乙酸銨和乙腈為流動(dòng)相,梯度洗脫分離,流速0.8 mL/min,溫度35℃,進(jìn)樣量5 μL,采用電噴霧負(fù)離子模式進(jìn)行電離,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè),外標(biāo)法定量分析.頭孢尼西在1.0~100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好( r2=0.997),檢出限( LOD)為0.04 μg/L,定量限( LOQ)為0.15 μg/L,采用低、中、高3個(gè)添加水平,平行測(cè)定6次,所得平均回收率分別為90.3%、87.4%、93.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD)分別為4.5%、2.3%、2.1%.
關(guān)鍵詞:牛奶;頭孢尼西;高效液相色譜;質(zhì)譜
β-內(nèi)酰胺類抗生素是歷史最悠久的抗微生物藥物,同時(shí)也是使用量最大和最重要的一類抗生素[1],主要用于抑制革蘭氏菌[2],如葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌等.β-內(nèi)酰胺類抗生素作為奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常使用的一類抗生素,其在牛奶中的殘留將會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)重要影響[3-5].如引起過(guò)敏反應(yīng)、造成泌尿系統(tǒng)損害和引起血液系統(tǒng)的反應(yīng),甚至偶爾引發(fā)肝炎[6]等.為了避免消費(fèi)者受到食品中抗生素殘留的危害,保護(hù)人民的身體健康,各國(guó)都對(duì)各種抗生素制定了嚴(yán)格的最高殘留限量( MRL)[7].如歐盟規(guī)定動(dòng)物組織和牛奶中各類頭孢菌素的MRL在20~100 μg/kg之間,其中牛奶中頭孢喹諾的MRL為20 μg/kg,而頭孢噻呋的MRL為100 μg/kg.頭孢尼西作為第二代注射用廣譜長(zhǎng)效頭孢菌素,其抗菌譜與頭孢孟多類似,主要用于敏感菌所致的下呼吸道感染、尿路感染以及敗血癥等,殘留在牛奶中的頭孢尼西可造成消費(fèi)者抽搐、頭痛、精神緊張等健康問(wèn)題.
目前,β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)方法主要有微生物法、免疫測(cè)定法、氣相色譜法、液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜法等[8-15].液相色譜-質(zhì)譜法作為一種高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)方法,其檢出限越來(lái)越低,提供的碎片信息越來(lái)越多,在食品獸藥殘留中的應(yīng)用也日趨廣泛[16-17].然而由于文獻(xiàn)中所見(jiàn)報(bào)道的前處理繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),并且頭孢尼西在常溫條件下極不穩(wěn)定.預(yù)實(shí)驗(yàn)證明頭孢尼西鈉1 000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫下放置一天將分解10%,因此關(guān)于頭孢尼西的液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究采用乙腈提取牛奶中的頭孢尼西,而后采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了牛奶中頭孢尼西含量的測(cè)定方法,該方法具有前處理簡(jiǎn)單、檢出限低、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn),可用于日常食品樣品中頭孢尼西含量的測(cè)定.
1.1儀器與試劑
液相色譜儀1260 (美國(guó)Agilent公司)串聯(lián)API5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem公司) ; Avanti J-30I離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司) ; Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司) ; SA-31振蕩器(日本Yamato公司) ;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司).
頭孢尼西鈉(純度≥99%),購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、正己烷、乙酸銨為色譜純,購(gòu)自美國(guó)J&K公司;實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備.
1.2溶液配制
乙腈飽和正己烷:取100 mL正己烷和50 mL乙腈加入250 mL分液漏斗中,振搖1 min,靜置分層后棄掉乙腈.
5 mmol/L乙酸銨:取385.4 mg乙酸銨加入1 L溶劑瓶?jī)?nèi),去離子水定容.
1.3實(shí)驗(yàn)步驟
稱取5 g試樣(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中,加入20 mL乙腈,均質(zhì)器均質(zhì)2 min,提取液使用高速冷凍離心機(jī)在10℃,10 000 r/min離心10 min,然后加入10 mL乙腈飽和正己烷,震蕩1 min,棄掉正己烷,過(guò)膜,上機(jī).
1.4實(shí)驗(yàn)條件
液相色譜條件:色譜柱ZORBAX Eclipse XDBC18 column ( 150 mm×4.6 mm,5 μm) ;柱溫35℃;樣品室溫度4℃;進(jìn)樣體積5 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液,流動(dòng)相B為乙腈.梯度洗脫程序: 0~3.0 min,5%~50% B; 3.1~4.0 min,95% B; 4.1 ~5.0 min,5% B,流速為0.8 mL/min.
質(zhì)譜條件:電噴霧電離源5 500℃,負(fù)離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)( MRM) ;實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?,碰撞? CAD)壓力為7 kPa,氣簾氣( CUR)壓力為30 kPa,霧化氣( GS1)壓力為55 kPa,輔助氣( GS2)壓力為65 kPa.電噴霧電壓( IS)為-4.5 kV,去溶劑溫度( TEM)為600℃,碰撞室出口電壓( CXP)為-21 V.分析物的定性/定量離子對(duì),去簇電壓( DP)及碰撞電壓( CE)見(jiàn)表1.
表1 頭孢尼西的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometer parameters of Cefonicid
2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
多數(shù)乳制品樣品中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪,這會(huì)給后續(xù)的檢測(cè)帶來(lái)極大的干擾,所以在樣品前處理中需要使用酸或有機(jī)溶劑將其中大部分的蛋白成分進(jìn)行變性和沉淀.考慮到頭孢尼西含有的四元環(huán)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)酸條件下不穩(wěn)定,因此樣品提取及沉淀蛋白應(yīng)避免強(qiáng)酸的使用.本研究對(duì)比了有機(jī)溶劑甲醇和乙腈的提取效果,發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效率優(yōu)于甲醇的,結(jié)果見(jiàn)圖1.乙腈提取物經(jīng)過(guò)離心取上清液,用乙腈飽和的正己烷對(duì)上清液進(jìn)行液液萃取,以有效去除牛奶中的脂肪.此方法離心后可以直接上機(jī)檢測(cè),不需采用SPE柱凈化處理,大大縮短了前處理時(shí)間,并且節(jié)省了SPE柱耗材費(fèi)用.
圖1 不同試劑的提取效率對(duì)比Fig.1 Comparison of extract efficiency of different solvent
2.2色譜條件優(yōu)化
液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于頭孢尼西的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道,因此本研究考察了甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)檢測(cè)頭孢尼西的靈敏度(圖2).采用乙腈-水作為流動(dòng)相,100 ppb頭孢尼西的響應(yīng)強(qiáng)度是甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)的2倍,并且甲醇-水作為流動(dòng)相的噪音較高,本研究選擇乙腈-水為流動(dòng)相.
圖2 不同流動(dòng)相頭孢尼西標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)圖Fig.2 Comparison of different mobile phase for cefonicid
2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化
在ESI+和ESI-離子化模式下,考察了頭孢尼西的電離效果.實(shí)驗(yàn)表明,頭孢尼西在ESI-電離方式下響應(yīng)較好,這可能與頭孢尼西呈弱酸性相關(guān).頭孢尼西的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3.頭孢尼西的定量離子對(duì)提取離子色譜圖見(jiàn)圖4.
圖3 頭孢尼西分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Molecular structure of Cefonicid
圖4 定量離子對(duì)提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograph of Cefonicid
使用陰性牛奶提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至濃度為1、5、10、25、100 μg/L,在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定,根據(jù)待測(cè)物濃度和定量離子峰面積關(guān)系進(jìn)行線性回歸.對(duì)陰性空白樣品提取液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),根據(jù)各定量離子3和10倍信噪比( S/N)對(duì)應(yīng)樣品中目標(biāo)化合物的濃度,得到檢出限和定量限(表2).
表2 頭孢尼西線性關(guān)系、檢出限( LOD)和定量限( LOQ)Table 2 Quadratic relationships,limits of detection ( LOD) and limits of quantification ( LOQ) of Cefonicid
2.4回收率和精密度
在空白牛奶樣品中添加3個(gè)濃度水平( 0.15、0.3、0.6 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本方法的回收率在87.4%~93.5%范圍內(nèi),精密度( RSD)小于5%,這表明本方法可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定.
表3 頭孢尼西平均回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of Cefonicid
2.5實(shí)際樣品的測(cè)定
應(yīng)用本方法對(duì)30份采集自超市的牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定,均未檢出頭孢尼西.下一步將擴(kuò)大樣品范圍、對(duì)集貿(mào)市場(chǎng)等地的樣品也進(jìn)行檢測(cè)和分析,以摸清我國(guó)目前的牛奶中頭孢尼西使用情況.
通過(guò)對(duì)牛奶樣品前處理方法的優(yōu)化,建立了牛奶中頭孢尼西的LC-MS/MS檢測(cè)方法.該方法具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、檢出限低的特點(diǎn),能夠滿足牛奶中頭孢尼西的檢測(cè)需求,其儀器條件也適用于其他類基質(zhì)中頭孢尼西的檢測(cè).
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[責(zé)任編輯:任鐵鋼]
Determination of cefonicid in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHOU Yu,ZHANG Yuan,ZHOU Yiping,YUAN Mingmei,F(xiàn)ENG Xuesong*
( School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110013,Liaoning,China)
Abstract:A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS) was established for the determination of cefonicid in milk.The milk sample was extracted with acetonitrile.Then,samples were centrifuged ( 10 000 r/min,10 min) to obtain the supernatant.After that the supernatant was added into acetonitrile-saturated hexane solutions and shaken to obtain the acetonitrile-soluble substances which were directly determined by HPLC-MS.The separation was performed on an ZORBAX Eclipse XDB-C18 column ( 150 mm×4.6 mm,5 μm) with 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile gradient solution as the mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min and 35℃.The sample injection volume was 5 μL.The electrospray source was operated in the negative ion mode,and monitored in the selective reaction monitoring ( SRM) mode.The concentration of cefonicid in the range of 1.0-100 μg/kg was linearly correlated to the peak area,with correlation coefficients 0.997.The limit of detection ( LOD) and limit of quantitation ( LOQ) were determined to be 0.04 μg/ L and 0.15 μg/L,respectively the recoveries of cefonicid were from 87.4% to 93.5% with the relative standard deviations ( RSD) of 2.1% to 4.5%( n = 6).
Keywords:milk; cefonicid; high performance liquid chromatography; mass spectrometry
作者簡(jiǎn)介:周昱( 1989-),女,碩士生,從事藥劑學(xué)及藥物分析研究.*通訊聯(lián)系人,E-mail: voncedar@ 126.com.
基金項(xiàng)目:遼寧省科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)基金( 201202252).
收稿日期:2015-11-09.
中圖分類號(hào):R917
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1008-1011( 2016) 01-0077-04